（微生物学专业论文）海洋产黄青霉低温碱性蛋白酶的纯化、性质分析及其基因的克隆.pdf

原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指导下 独立进 行研究所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果 对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体 均已在文中以明确方式标明 本人完全意识到本声明的 法律责任由本人承担 论文作者签名 恕i 鸟 日期 垒 上幺 7 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留 使用学位论文的规定 同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅 和借阅 本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索 可以采用影印 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文 保密论文在解密后应遵守此规定1 论文作者签名 盈曼 廷导师签名 占区 虹日期 2 塑三 铅 7 r 山东人学硕扛学何论义 摘要 世界海洋所占而积超过地表面积的7 0 海洋生态环境非常复杂 面多样 海洋微 生物具有一驰特殊的结构和功能来适应这样的t 卜态环境 凶而海洋微生物是开发新颖 生物活性物资的极好的灭然资源 海洋低温微生物分布于南北极地 深海海底等环境 具有独特的 卜物学特性和适应机制 它们所产生的酶等生物活性物质 也具有独特的 功能 但是k 期以来人们对此并未给了 充分的重视 直到5 0 年代以后 各国学者才相 继开展了低温微生物的研究i 丁作 9 0 年代以来 随着海洋生物技术的蓬勃兴起 国外 学者千h 继从南北极和深海处等终年低温的环境中分离得到多种新的低温微生物 并探 究了它们的生长机制 带动了冷活性酶的开发与研究 但这类研究一般局限于细菌的 范畴 冷话性酶能在低温保持较高活力的原因在于其蛋白分子结构的柔韧性增强 这 种强柔韧性的获得来自分予内部内聚力的减弱及外部与溶剂作用力加强的结果 从本 质上讲 其强柔韧性源自于其氨基酸残基间相互作用较弱份子表面系水区增多 与溶 剂水的作用增强 从而形成较伸展的分子结构 这种结构在低能耗的情况下发挥催化 作用 蛋白酶是f i 前用途最广泛的一种酶 占工业用酶的6 0 左右 广泛应用在洗涤剂 食品 发酵 皮革 纺织和医药等行业生产中 目前工业 匕应用的蛋自酶多为中温蛋 白酶 最适产酶温度在3 0 3 5 c 最适酶活温度在5 00 c 左右 低温蛋白酶一般由低温 菌产生 它具有产酶温度低 最适酶活温度低 在低温下具有更高的催化效率等特点 因而在洗涤剂 皮革 食品加 等工业上应用有着中温蛋白酶无法取代的优越性 自 7 0 年代以来 世界上有许多实验室在从事低温蛋白酶的研究 已从海水 嗜冷鱼类和 贝类以及高山 南北极的泥土等样品中分离到产 f 氐温蛋白酶的菌株 不同种类刁i 同来 源的低温菌町产生多种性质不同的低温蛋白酶 一些低温蛋白酶已经得到了纯化 有 的已应用到 q k 生产中 本实验旨在找寻在低温下有较高酶活但对中高温敏感的一种蛋白酶以期应用在工 业生产巾来降低能耗 提高产品质量 我们从海底污泥中分离到2 1 株产蛋白酶丝状真菌 将其中一株产蛋白酶酶活较高 的产黄青霏菌株 命名为p e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u mf s 0 1 0 4 4 1 对其生长的适冷性和它 产生的蛋白酶的适低温特性进行了研究 并对其培养条件进行了优化 该菌株能够在 5 c 下生长 其最适生长温度为2 0 c 最高彗i 长温度低于4 0 c 为一株适冷菌 在 山东大学硕士学位论文 5 时其芦 酶量最高 在液体发酵培养基巾培养3 d 活力达到1 7 6 u m 1 对该酶进行 纯化及性质研究 确定其最适反应温度为3 5 c 比一般1 业应用真菌蛋白酶之最适温 度低i o 1 5 c 该酶热敏感性强 当温度高于5 0 c 时 该酶易失活 6 0 保温5 m i n 后只残存l o 崤酶活力 保温l o m i n 后酶活力几乎完全谈失 但在1 0 保温3 0 r a i n 仍 然有8 6 酶活残留 其最遁p h 为9 在p h 8 1 1 范围内活力较高 酶反应条件温利 c a 2 i m g 对酶活力的提高有一定作用 而c u 2 c 0 2 对酶有抑制作用 d f p 和p m s f 对酶的抑制作用比较明显 s d s p a g e 法测得该酶表观分子量为4 1 0 0 0 1 0 0 0 d a 利用p c r 技术 根据e m b l 公丌的p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m 基因组d n a 序列设 计合成i p c r 所需引物 以p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u mf s 0 1 0 4 4 1 染色体d n a 为模板 扩增出目的基冈 构建了重组质粒 并将其转入ec o o d h 5a 本文首次报道从海洋中筛选到产低温碱性蛋广1 酶的产黄青霉 对其培养条什及产 生的碱性蛋白酶的理化性质进行了初步研究 并对该酶的基因进行克隆 为进一步研 究开发陔低温碱性蛋白酶奠定了基础 关键词 海洋产黄青霉 低温碱性蛋臼酶 基因克隆 l 丛堂塑 兰堕堡苎 一 a b s t r a o t e n z y m ep u r i f i c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o na n d g e n ec l o n i n g o fc o l d a c t i v ep r o t e a s ef r o m as t r a i no fp s y c h r o t r o p h i c p e n i c i i i u mc h r y s o g e n u m f s 0 1 0 4 4 1 o c e a n sc o v e rm o r et h a n7 0 o f t h ee a r t h ss u r f a c e t h em a r i n ee n v i r o n m e n t i sap r o l ir icr e s o u r c ef o rt h ei s o l a t i o no fl e s se x p o i t e dm i c r o o r g a n i s m sw i t h s p e c i a ll yg e n e t i c p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a lp r o p e r t i e s c o l d a d a p t i v e m a r i n em i c r o o r g a n i s m sa r es p r e a di nd e e p s e ab o t t o ma n di nt h es e aa r o u n dt h e n o r t ha n ds o u t hp o l e t h e yh a v es p e c i f i cb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d a d a p t a t i o nm e c h a n i s nt oa d a p ts u c h ah a r dc i r c u m s t a n c e s b u tu n t i l1 9 5 0 sp e o p l e d i dn o tp i ye n o u g ha t t e n t i o nt ot h e m w i t ht h eg r e a td e v e l o p m e n to f m a r i n e b i o t e c h n o o g y s c i e n t i s t sh a v ei s o l a t e ds e v e r a ls t a i n so fn o v e lc o ld a d a p t i v e m i c f o o r g a r l i s m sf r o mt h ea r e a sm e r i t i o n e da b o v e t h r o u g ht h er e s e a r c ho ft h e i r l i v i n gm e c h a n i s m p e o p l e b e g a nt ok n o wt h ei m p o r t a n c eo f c 0 1d a c t i v ee n z y m e s i t w a sp r o p o s e dt h a th i g hf l e x i b i l i t yw a st h em a i nr e a s o no ft h em a i n t a in i n go f e n z y m ea c t i v jt y a tl o wt e m p e r a t u r e s s u c hh i g hf l e x i b i l i t yc o m ef r o mt h e w e a k e n i r i g o fin t r a m o l e c u l a rf o r c e sa n dt h es t r e n g t h e n i n go fi n t e r a c t i o n b e t w e e ne n z y m ea n ds o l v e n t ar e l a t i v e l y1o o s es t r u c t u r ee n s u r e dal o w e r a c t i v a t i o nf r e ee n e r g yt ot h e i rm e s o p h i l i cc o u n t e r p a r t s p r o t e a s e sr e p r e s e n to n eo ft h et h r e el a t g e s tg r o u p so fin d u s t ria ie n z y m e s a n da c c o u n tf o r a b o u t6 0 o ft h et o t a lw o r l d wj d es a l eo fe n z y m e s pr o t e a s e s h a dc e m m o n l yu s e di nt h ed e t e r g e n t f o o d l e a t h e r t e x t i l ea n dp h a r m a c e u t ic a l i n d u s t r i e s t h e i ra p p li c a t i o ni nt h e1e a t h e ri n d u c t r yf o rd e h a i r i n ga n db a t i n g o fh i d e st os u b s l jt u t ec u r r e n t l yu s e dt o x i cc h e m i c a l s i tisa l s oc o m m o n l y u s e di n b r e w i n g f e r m e n t i n g s p i n n i n g a n dm e d i cf n em a n u f a c t u r i n g o u ra i mi st of i n dak i n do f p r o t e a s ew h i c h c o u l da c ts t t o n g l ya tl o w t e m p e r a t u r e sa n dl o s ei t sa c t i v i t yc o m p l e t e l yi nv e r ys h o r tt i m ew h e ne x p o s e d t ot e m p e r a t u r e sh i g h e rt h a n5 0 c t h i sc o u l d1o w e rt h ee n e r g ye x p e n d i t u r ea n d i r e p r o v eq u a l it yo fp r o d a c l 3 山东大学硕十 学位论文 f r o md e e ps e as l u d g e w cs c f e e n e das t r a i no fp e n f c i l l i u mc h c v x o g e n u mw h ic h c o t l l de x c ie t ec o d a c t i v ea l k a l j f i ep r o t e a s e a f t e ro p t i m i z j n gi t sc u l t iv a t i o n r e n d t i o n s w ef o u n dt h a tt h ee n z y m ep r o d u e t i o nw a st h eh i g h e s t j 7 6 u m 1 a f t e r3 d1i q u i df e r m e n t a t i o na t1 5 a f t e r p u r l f i c a t i o na n dc h a r a c t e r iz a t i o n t t l e o p t i m a lt e m p e r a t u r eo ft h ep u r ep r o t e a s ew a sf o u n dt ob e3 5 a b o u t1 0 15 l o w e rt h a nt h ec o m m o n l yu s e do n e i tw a s v e r ys e n s i t i v et ot e m p e r a t u r e s h ig h e rt h a n5 0 i t sa c t i v i t y1 0 s e sn e a r l y9 0 a f t e r5m i na t6 0 a n d1 0 s e s c m p l e t e l ya f t e ri o m ina t6 06 c i t so p t m a lp hw a sp l l9a n ds h o w e dh i g ha c t i v i t y a tp h81i s oi t sw o r k i n gc o n d i t i o n sa r ev e r ym o d e r a t e t sm o l e c u l a rw e j g h t w a sm e a s u l l e d4 1 0 0 0 1 0 0 0 d ab y s d s p a g e c a 2 m g w e r ei t sa c t i v i t t o r s w hjiec u c o d f p a n dp m s fc o u ld i n h ib i ti ts e r i o u s l v p c rt e c h n i q u ew a su s e dt oa m p i f yt h ea l k a l 1 f i ep r o t e a s eg e n eo fp e n f o i l l i u m c h r v s o g e n u mf s 0 10 4 4 1c h r o s o m ed n a a n dt h e g e n ew a sc l o n e di nd h 5a jtist h ef jr s tt i m et or e p o r tt h ep u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fe 1 d a c t i v ea k a l i n ep r o t e a s ef r o mm a r i n ef i l a m e n t o u sf u n g u s t h ew o r kw o u db e u s e i u lt of u r t h e rr e s e a r c ho fe x p r e s s i o no fc o l d a c t i v ea l k a l i n ep r o t e a s e t h c h i g hc a t a l y t i ca c t i v i t ya t1 0 wt e m p e r a t u r e sa n d h i g hs e n s i t i v i t yt o h i g h t e m p e r a t u r e sp r o m i s e di tag r e a tf u t u r ei nt h ei n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n k e yw o r d s m a r i n e p e n i c i j 蚴c h z y s o g e n u m c o l d a c t i v ea l k a l i n ep r o t e a s e g e n ec l o n i n g 4 山东大学硕l j 学何论文 第一章绪论 1 1 海洋真菌研究进展 世界 洋占据了地表面积的7 0 v a 卜 是生物资源的宝库 海洋环境包括了高压 低温 无光照 局部的高温 高盐等生命极限环境 以及从营养丰富区到只有少数微 生物能生存的营养馈乏区等等 生态环境非常复杂而多样 在这样的生态环境下 海 洋的微生物在艮期的进化中 发展了一一些独特的结构和功能 以维持其生命活动 海 洋微牛物的复杂多样使其产雀的代谢广 物也具有多样性 复杂性和特殊性 因而海洋 微生物成为开发新颖 l 三物活性物质的极好的天然资源 由于受地理环境的限制 以及 海洋生物在采集 培养等方面尚存在 些技术难题 海洋生物酶类方面的研究和应用 远不如陆地生物 一般认为 目前能被分离 培养和鉴定的微生物种类占自然界存在 量的5 据估计 而所研究和鉴别过的海洋微生物0 i 到整个海洋微生物的1 巨大 的海洋资源尚未得到研究与丌发 真菌是通过吸附于溶解的有机物质上行渗透营养生长的异养真核7 三物 海洋真菌 般指在海洋环境中分离 并能在海水盐度 或略低于海水盐度 的培养基中正常生 长的真菌 海洋真菌分布很广 各个气候带和各种盐浓度的海水均有存在 它 玎在来 源于海洋的不同基质中找到 如海底沉积物 海洋漂浮水 海洋中各种动植物的体表 或体内等 据估计 海洋真菌约有1 0 0 0 2 0 0 0 个种 而迄今只对4 0 0 余种海洋真菌进 行了相关研究 主要包括子囊菌纲 d s c o m y c o t a 担子菌纲 b a s i d i o m y c o t a 半知 茵类 1 o u z o r o m y c o t e s 等 较低等真菌包括壶菌纲 c h y t r i d i o 脚y c o t a 接合菌纲 z v g o m y c o t a 和卵菌纲 o o m y c e t e s 等 海洋真菌仍处于探索和研究的阶段l i 4 由于海洋环境的特殊性 海洋真菌研究开始的相对较晚 在2 0 世纪中期以前被 发现的海洋真菌仅占目前发现的总数的1 0 1 9 4 5 年 g b r o t z u 在地中海撒丁岛海域 分到一株顶头孢霉 c e p h a l o s p o i u na c r e m o n i u m 从其培养液中提取出头孢菌素c 等多 种抗菌素 2 0 世纪6 0 年代以来 海洋真菌研究开始发展起来 大部分集中在海洋真 菌产 生的活性物质方丽 海洋真菌的活性产物主要有以下几类 萜类化合物 肽类及 生物碱类化合物 酮类和酯类化合物 最早期的报导是从一种木素色子囊芮 l e p t o s p h a e r i ao r a e m a r i s 培养物中分到一个小内酯l e p t o s p h a e r i n 在7 0 年代后期 o k u t a n i 等 1 9 7 7 报导从海洋真菌a s p e r g i l l u ss p 中分离到抗细菌毒素一胶霉毒素 g l i o t o x i n 1 9 8 8 年g u e l x i e r o 等进行海洋半知菌类d e n d r y p h i e l l as a l i n a 发酵 从发酵 山尔人学颂十学位论文 物中分离到丰要的代谢物倍半萜类化合物d e n d r y p h i e l l i n a 随后又从中陆续分离到相 灭的代谢物d e n d r y p h i e l l i nb g 和两个游离酸d e n d r y p h i e l l i n a c i da 和b 5 9 l 1 9 9 1 年 s u g a l l o 等从产j 同本近海的螃蟹c f d p c e 把so p i l i o 上分离到担子菌p h o m as p 可以 产生新型的向小板涌化因子拮抗剂p h o m a c t i n s c h e n g 等 1 9 9 4 从印度洋海绵屁妒妇 酊j o h n s t o n i 上分离到真菌h y p 肋m y c e t e s 从其发酵物中分离列倍半萜类化合物 c o r i o l i nb d i h y d r o c o r i o l i nc 和c h l o r i o l i n ea c c h l o f i o l i n e s 为氯代 二环或三环 倍半帖类化合物 c h l o r i o l i n b 对乳房和c n s 癌细胞系有强烈的抑制作用 i c 5 0 值分别 为0 7ug m l 和0 5ug m l c u i 等从海洋真菌4 肇p 增f z m 声拂硅掣f s 代澍产物 f 1 分离出哺乳动物细胞周期 g j m 划抑制剂1 b p r o s t a t i n sa b c y c l o t r y p r o s t a t i n sa n d c y c l o t r y p r o s t a t i n sa d 有 l 元骨架 包括2 5 一二氧哌嗪环 由一个色氨酸单元 脯氨酸残基和异戊二烯基组 成 9 林永成等 1 9 9 9 从南海分离出 株海洋真菌a p r e r g t 淞肋v 啦枷 可产生高效抗真 菌剂t er r i e ca c i d 能强烈抑制多种植物病源真菌 在医用或农用方面有良好的前景 1 从海洋真菌培养物中分离新的医药品和代谢产物之外 近几年来 对海洋真菌所 产酶类的分离与克隆已有所报道 如b u r t s e v ay v 2 0 0 0 报道从海洋丝状真菌 c h a e t o m i u mi n d i c u m 液体培养物中分离到多种糖苷酶和葡聚糖酶 1 2 虽然对海洋真菌已7 展了一些研究 并从其代谢产物中已分离到若干新颖 有价 值的抗生素 生物活性物质和酶 但从总体e 看 对海洋真菌的研究相对于海洋细菌 要薄弱得多 所研究的种类相对于陆栖真菌更是无法相比 已报导的对海洋真菌的研 究 多是分离有用的化学产物 基本未见有深入的分子生物学研究的报导 利用基因工程技术 利用适宜的海洋真菌作为宿主 生产人类所需的药品与生物 活性物质 较之利用原核系统更有其独特的优点 可以解决当采用原核系统生产来自 真核生物的基因产物时 原核系统常常存在转录后不能i f 确地加工 修饰和进行糖基 化等缺陷 因而产物可能存在生物活力较低或无活力的问题 分离 筛选有用的海洋 真菌菌株 建立海洋真菌的基因资源库 从中筛选 获得我们所需要的生产各种低温 酶类与其它医药与化工产品的基因 并通过重组d n a 技术使其在适宜的宿主系统中进 行高表达 呵以为工业化大量生产低温酶类和其它医药与化工产品奠定基础 创造条 件 6 山东人学颂十学位沦文 1 2 低温微生物及低温酶研究进展 低温微生物广泛分布丁自然界中 在所有寒冷环境 淡水 海水 极地和高山上的 土壤和水 冰川 植物 动物以及冷冻食物 中都发现了 色 t 1 3 的存在 它们在这些低温 环境中进行着重要的 有益或有害的化学转化 低温微生物按照在不同温度条件卜生 长能力的不同 微生物可被大致分为3 类 高温菌 中温菌和低温菌 其中低温菌又通 常被分为嗜冷荫 p s y c h r o p h i l e s 和耐冷菌 p s y c h r o t r o p h s 嗜冷菌 词是ms c h m i d t n je 1s e n 1 9 0 2 在研究能于o 牛长和繁殖的微生物时首先使用的 s t o k e s i 9 6 3 将 嗜冷薪定义为 能在o c 条件卜 l 周内快速生氏至肉眼可见状态的微生物 从而将 其与中温菌相区别 并且按照微生物的最适生长温度是甭低于2 0 c 再将其细分为严格 的专十牛嗜冷菌和兼性嗜冷菌 按照m o r i t a 1 9 7 5 的定义 嗜冷菌的最适生长温度低于 1 6 c 具生长温度的上限为2 0 耐冷菌则是指能在0 进行分裂 最适生长温度在 2 0 c 2 5 左右的微生物 狭义上的耐冷菌不能在4 0 c 生长 而广义上的耐冷菌则能存 高于4 0 时生长 i i 存在极端环境中的微生物 通常足通过代谢作用适应其所处生境而得以存活并 发挥作用 这些适应方式包括 用于能量转导和用于胞内环境及新陈代谢调节的特殊机 理 细胞膜 细胞壁结构性成分和功能性成分的稳定性 反应动力学 蛋白质构象及 酶系的功能 由基因决定的适应性变异不同于那些凼适应环境而产生的适应件变异 j 低温微生物比中温微生物表现出更强烈 更高效的溶质跨膜运输活动 相对巾温 微生物而言 生长在低温条件下的低温微生物在更大程度上合成了含有更多不饱和脂 肪酸和短链脂肪酸的中性脂质及磷脂 而不饱和脂肪酸和短链脂肪酸的增加可导致脂 质熔点的降低并使脂质保持对生存所必需的液体流动状态 j o n e s 1 9 8 7 等人研究表 明 微生物呵通过冷激蛋白的合成来响应冷激作用 冷激作用的范围影响蛋白的诱导 温度变动越大 产乍的冷激蛋白越多1 通常 在低于0 c 条件下低温微生物表现出 比 p 湍菌更慢的代谢速率 但能表达h 所有在较高温度条件下存在的明显的生化活力 低温微生物一方面可能是在酶学水平上通过产生的酶种类的变化对低温造成的影响作 定性补偿 野一方面也可能在酶活力水平上通过酶浓度的变化来定量补偿低温带来的 影响 在低温条件下 不但低温微生物的酶活力得到提高 酶的分泌水平也得到提高 研究人员发现 嗜冷菌和耐冷菌的最高酶产生量出现在温度远低于其最适生长温度时 m a r g e s i n s c h i n n e r 1 9 9 2 低温条件下更多的酶生成 j 丁以补偿酶活力的低速率并 保证低温环境中底物的高效利用 来自低温微生物的酶类具有一些特征 例如其最适 i 尔人学硕l 字位呛文 酶活力出现在更低的温度条件下 热敏感性增高 生理效率 k t k 和k 值更高 而在o c 五 右低温时k m 值更低等 1 引 这些都反映了它们对所处自然生境条件的适应性 低温物种的蚩自质不易发生冷变性现象 并且其酶类比那些来自中温物种的酶类在低 温条件卜具有史商的催化效力 高催化效力与更松散且更具柔性的蛋白结构形成相关 联 这种蛋白结构容许利用更少的能量投入就产生具有催化效能的构象变化 凶此 这样的低温微生物酶类代谢反应所需的活化自由能与中温型同系物相比具有更低的数 值 并且 j 其适应温度成比例 f e l l e r 等人 1 9 9 1 研究了耐冷型脂酶的氨基酸序列 认为只有低温酶的一级结构的变化才足以能够改变其折叠状态的屈曲性 在低温脂酶 中 如精氨酸等稳定性残基的低数量可能有助于形成一更具屈曲性的三级结构 另外 增加的甘氨酸残基可能会起到有力的促进作用 在低温催化过程中促进酶的构象改变 这些特性可能与该脂酶的适冷性有关i 1 9 9 3 年 r e n t i e r d e l r u e 小组对几种嗜冷 性蛋白酶 脂肪酶和半乳糖苷酶进行了研究 发现它们含有几个中温性酶所没有的氨 基酸残基 f e l l e r 等人建立的计算机模型也表明 嗜冷蛋白酶含有大量带负电荷的氨 基酸残基 特别是天冬氨酸残基 分子表面的4 个极性坏状结构呈伸展状态 分予内 缺少离子阳j 作用与疏水作用 这些结构特征使酶分子呈松散状态 具有较大的可变性 从而导致酶的稳定性降低 1 7 1 9 由于低温微生物具有抗低温特性 能在低温条件下生长 繁殖 并产低温酶 凶 丽在 业牛产 特别是在洗涤剂二i 业的食品工业中有重要用途 在工业生产中应用低 温微生物及低温酶 具有如卜一些优势 在可防止微生物污染 尤其是在连续运转系统 中 的 2 0 温度范围内 此时同源的嗜温型酶不活泼 低温微生物具有高生长速 率 高酶活力及高催化效率 可大大缩短处理过程的时 h 并省却昂贵的加热 冷却系统 凶而在节能方面有千h 当大的进步 经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失 甚至 可使低温菌株选择性失活 而低温或适温处理不会影响产品的晶质 1 3 蛋白酶研究概论 j 3 1 蛋向酶概述 蛋白酶是水解蛋白或多肽的酶的统称 蛋白酶种类繁多 广泛存在于动物 植物 和微 i 物中 对机体的新陈代谢及生物调控起重要作用 按国际 k 化与分子生物学联合会酶学委员会的酶分类 蛋白酶属第3 大类 水解酶 类 的第4 亚类 但是蛋白酶作用方式和结构非常多样 很难按酶学分类标准来命名 山永火学硕十学位论文 一 一 通行的方法是按i l j 个重要标准将蛋门酶分类 1 催化反应的类翟 2 活性部 位的性质 3 结构f 二的进化关系 蛋白酶按水解底物的部位 l 分为外肽酶和内肽酶 外肽酶由底物n 端或c 端逐步 降解氨基酸 内肽酶水解底物内部的肽键 外肽酶根据其作用于多肽链n 或c 端而又 被分为氨肽酶或羧肽酶 氨肽酶作j e j 于多肽链的n 端 释放单个氨基酸残基 二 肽或 i 肽 细菌 真菌都产生各种氨肽酶 但其底物特异相差很犬 氨肽酶大多是胞内酶 但有个别报道米曲霉产生胞外酶 e c o l i 产生的氨肽酶i 是一个4 0 0 0 0 0 d a 的蛋白酶 最适p h 范嗣较宽 为7 5 1 0 5 且需要m 矿 或m n 地衣枯草杆菌氨肽酶分子量 3 4 0 0 0 d a 每摩尔酶含l 克z n 催化作用需要c o 离子 bs t e a r o t h e r m o p h i l u s 产生 的氨肽酶i i 是一个二聚体 分子量8 0 0 0 0 到1 0 0 0 0 0d a z n 2 m n z c 0 2 对僵化有激 活作用 羧肽酶作用于肽链的c 端 产生氨基酸残基或二肽 根据活性位点的氨基酸 溅基 羧肽酶可分为三大类 丝氨酸羧肽酶 会属羧肽酶和半胱氨酸羧肽酶 从青霉 属 酵母菌属和曲霉属分离到的丝氨酸羧肽酶作用底物相似 但在最适p h 分子量 抑制剂方而略有不同 酵母菌和假单胞菌属产 生的羧肽酶催化作用需要有z n 或c o 的存在 1 9 2 f q 根据活性位点的功能团 蛋白酶可分为4 大类 即丝氨酸蛋白酶 天冬氨酸蛋白 酶 半胱氨酸 巯基蛋自酶和金属蛋白酶 有一些蛋白酶不属于以上的分类 如依赖 a t p 的蛋白酶 根据蛋白酶的氨基酸顺序 蛋白酶分成不 司的族 每族肽酶用代表催 化类型的字母表示 即s c a m 和u 分别对应丝氨酸蛋白酶 半胱氨酸蛋白酶 天冬氨酸蛋白酶 金属蛋白酶和未知类型蛋白酶 2 t j 丝氨酸蛋白酶可被3 4 d c i d f p p m s f 矸i 可逆的抑制 一些活性位点附近 有半胱氨酸的丝氨酸蛋白酶 i r 被硫醇试剂 如p c m b 抑制 丝氨酸蛋白酶一般为 巾性或碱性蛋白酶 最适p h 为7 1 1 其作用底物多样 不仅能催化酰胺键水解 还能催化酯键水解 分子量大多介于1 8 3 5 k d a 间 个别的丝氨酸蛋白酶分子量达到 1 2 6 k d a 细蔺 酵母 霉菌和其他一些真菌都产丝氨酸碱性蛋白酶 丝氨酸碱性蛋白 酶l r 被d f p 抑制 但不被t p c k 或t l c k 抑制 其底物与胰凝乳蛋白酶类似 阻不如 其特异性强 可水解t y r p h e 或l e u 羧基端的肽键 碱性丝氨酸蛋白酶摄适p h 在1 0 左右 等电点在p h9 左右 分子量在l5 3 0 k d a 之问 常见产丝氨酸碱性蛋白酶的 微生物有芽孢杆菌属 节杆菌属 链霉菌属 产黄菌属等细菌和酵母 曲霉 脉孢霉 等 丝氨酸内肽酶根据催化反应位点不同大致分为3 类 a 胰蛋白酶类 作用于带难 9 山东人学硕l 学何 义 电荷氨基酸后肽键 b 胰凝乳蛋白酶类作用于疏水氨基酸后肽键 c 弹性蛋白酶类 作用r 具有小疏水基 i 1 氨基酸后肽键 酶切断的肽键之前的氨基酸决定了酶的专一性 与其相邻的氨基酸仅对酶反应速度有影响 已知的半胱氨酸蛋白酶有2 0 族 根据作用底物侧链的特异性 半胱氨酸蛋向酶可 分为4 类 m 木瓜蛋白酶类 b 胰蛋白酶类 c 作用于g l u 的半胱氨酸蛋门酶 d 其 他类 绝大多数半胱氨酸蛋白酶最适作用p f i 为中性 个别为酸性 半胱氨酸蛋白酶易 被硫化剂如p c m b 抑制 但划d f p 和螯合剂不敏感1 2 天冬氨酸蛋白酶大多为酸性蛋白酶 是活性中心有a s p 残基的内肽酶 可分为三 族 a 1 胃蛋白酶族 a 2 反胃蛋白酶族 a 3 来自副反转录病毒的蛋白酶族 a i a 2 族 问关系较密切 天冬氨酸蛋白酶最适p h 在3 4 问 等电点为p h 3 4 5 分子量在3 0 4 5 k d a 问 胃蛋白酶类活性可被抑胃肽抑制 在c u 存在时 对重氮酮类化合物如莺氮 乙酰一d e 正亮氨酸甲酯 d a n l 2 环氧一3 p 硝基苯氧基 丙烷 e p n p 敏感 微生 物天冬氨酸蛋白酶大致可分为两类 a 类胃蛋白酶类 曲霉 青霉 根霉和脉孢霉产 的天冬氨酸蛋白酶属此类 b 类凝乳酶类 毛霉和e n d o t h i a 产天冬氨酸蛋白酶属此类 微生物天冬氨酸蛋白酶可催化带芳香族及大的疏水侧链的氨基酸形成的肽键 2 3 1 盒属蛋白酶种类多样 如基质金属蛋白酶 蛇毒中出血l 毒素和嗜热菌蛋白酶等 基质余属蛋白酶 m a t r i xm e t a l l o p i o t e a g e m m p s 通过介导细胞外基质降解而参与组 织j e 常发育 伤l 1 愈合等过程 基质金属蛋白酶在体内的活性受到严格调控 其调控 失衡与关节炎 多发性硬化症及恶性肿瘤的生长和转移等多种疾病密切相关 研究其 结构对丁二药物筛选和疾病治疗有重大的意义 现有的会属蛋白酶分为3 0 族 其中有 1 7 族全部是内肽酶 有 2 族全部是外肽酶 有1 族既有内肽酶又有外肽酶 根据会 属离子结合部位的氨基酸残基的性质 将3 0 族金属蛋白酶分为几个族群 如m a 族群 活性中心具有h e x x l 卜e 序列 m b 旌群活性中心具有f l e x x h 一1 1 序列 根据催化方式 金 属蛋白酶可分为4 类 a 中性金属蛋白酶 b 碱性金属蛋白酶 c 粘细菌i 型会属蛋 白酶 d 耥细菌1 i 型金属蛋白酶 中性金属蛋白酶作用于带疏水侧链的氨基酸 碱性 金属蛋白酶特异性不强 粘细菌i 型会属蛋白酶作用于带小侧链的氨基酸任一侧肽键 粘细菌i i 型金属蛋白酶特异性作用于l y s 残基氨基形成的肽键 所有的金属蛋向酶都 可冈透析而失活 也可被螫合剂抑制 但不被硫化剂或d f p 抑制口3 1 东人学硕 学仿论文 1 3 2 蛋白酶的结构和作用机理 1 3 2 i 蚩f 1 酶分子结构 丝氨酸蛋白酶 泛存在于病毒 细菌和真核生物中 是研究得较多的蛋白酶 丝 氨酸蛋白酶凶活性何点卜的s e r 残基而得名 丝氨酸蛋白酶有外肽酶 内肽酶 寡肽 酶和o m e g a 肢酶等多种 根据其结构类似性 丝氨酸蛋白酶被分成2 0 族 并根据进 化谱系分为六大族群 胰凝乳蛋白酶 s a 枯草杆菌蛋白酶 s b 羧肽酶c s c 和大肠杆菌d n d n 肽酶a s e 的一级结构相差很大 应是由4 个不同的祖先进 化而来 s a s b s c 都有由三个氨基酸s e r a s p h i s 形成的活性 h 心 尽管这些 催化中心的曲 休结构相似 但蛋白折叠差异很大 这是趋同进化的典型例子 s e 和 s f 与s a s b s c 不同 他们不存在s e r h i s a s p 催化中心 b r e n n e r 1 9 8 8 发现在 丝氨酸蛋白酶催化中心的丝氨酸残基附近有保守的g l y 残基 从而形成 g l y x a a s e r y a a g l y 域 有少量丝氨酸蛋白酶 如e c o l i 中分离的肽酶a 没有 s e t h i s a s p 三肽结构 其催化域附近有保守的g l y f 目位置不同 胰凝乳蛋白酶类摹 本上来源于动物 胰蛋白酶类部分来自细菌和真菌 一些枯草杆菌蛋白酶有着与胰凝 乳蛋白酶类似的二三肽催化结构 但顺序为a s p h i s s e r 催化中心有丝氨酸的羧肽酶最 适作用p h 偏酸性 在s e r 前有一个g l u 碱基 2 4 2 天冬氨酸蛋白酶活性中心有a s p 残基的内肽酶 晶体结构研究表明 胃蛋门酶族 多在肽链n 端和c 端各有1 个耳垂形结构 其活性中心位于两个耳垂形结构中削裂隙 中 由a s p t h r g l y x a a x a a 为s e r 或t h r 组成 每个耳垂形结构各提供1 个a s p 残 基 反胃蛋白酶族只有1 个耳垂结构 需要形成同型二聚体来提供2 个a s p 残基 活 性巾一t b 多为a s p t h rg l y a 1 a 半胱氨酸蛋白酶都存在c y s h i s 催化中心 不同族的顺序 i f i 同 c y s h i s 或h i s c y s 半胱氨酸蛋白酶作用于c y s 或h c n 木瓜蛋白酶是最常见的半胱氨酸蛋白酶 由单链折叠成两个域 中问有裂隙 用来结合底物 催化中心由c y s 一t t i s 一a s h 构 成 其中c y s 起着与胰凝乳蛋白酶中s e r 类似的作用 金属蛋白酶的h e x x h 结构域 是金属离子的结合部位 其中的组氨酸被认为可以 与酶活性中心部位z n 结合而形成配位键 从而对酶的催化活性起重要作用 另外 a 对酶的活性及稳定性也起 定作用 山东人学顾十学位论文 图l 蚩自酶3 d 结构 f r o mp d b aa s p e r g i l l u so r y z a ea s p a r t i cp r o t e a s eb b o v i n eg a m m a c h y m o t r y p s i n c s t a p h o p a i n c y s t e i n ep r o t e i n a s ef r o ms t a p h y l o c o c c u sa u r e u sv 8 d p s y c h r o p h i l i cp r o t e a s ef r o mp s e u d o a l t e r o m o n a s t a ci i i8 圆筒状区域代表a 一螺旋 带状 趸域代表b 折叠 线状区域代表无规则折替 1 3 2 2 催化机理 f a s t r e z 等 1 9 7 3 研究了胰凝乳蛋白酶的催化机制 经过其他研究者进一步的化 学和结构研究 表明多数丝氨酸蛋白酶具有相同的催化机制 其过程如下 a 四面体 中间物的形成 当酶与底物结合时形成米氏复合物 s e r 亲核攻击羰基形成四面体中 州物 共价催化 x 射线分析认为s e t 处丁 有利的位置 邻近和定向效应 是一个有 效的亲核攻击基团 h i s 吸收释放的质子 起一广义碱的作用 这一过程为a s p 加 强 极化的a s p m z 与h i s w 的氢发生静电相互作用 静电催化 酶的催化即从形成短暂 山东大学硕十学位论文 的四面体结构丌始 b 乙酰化过程 四面体结构在 s s t n 3 质子供体作用下 酸碱催 化 分解 形成酰化酶中间物 r n 心从酶分子上释放并由溶剂h o 替代 c 脱酰过程 脱酰反廊是酰化反应的逆过程 释放生产物羧酸 酶得以再生 在这一过程中 i o 为亲核试剂 2 图2 a 天冬氨酸蛋白酶通过酸碱反应催化肽键水解 活性部位的2 个a s p 残基的羧基 1 个作为广义酸 另1 个作为广义碱 作用于与活性部位紧密结合的1 个水分子 水分 了对水解肽键的羰基碳进行亲核攻击 从而水解肽键 图2 b 半胱氨酸蛋白酶通过双置换反应催化羧酸衍牛物的水解 反应涉及广义酸碱催化 和硫酯中f 日j 物生成 催化过程包括 a 酶与底物形成非共价结合复合物 b 酶的酰化 产q r 一n i t c 脱酰过程 酰化酶与水分子反应 生成第二产物 金属蛋白酶催化反应需要二价金属离子的存在 最常见的二价金属离子是z n 对嗜热菌蛋白酶和羧肽酶a 反应机理的研究表明 酶分子中z n 与酶分子中h i s g l u 残基及1 个 l 0 分子形成四配位结构 反应过程中论著 z n 使底物敏感肽键羰基碳原 子电子云密度降低 该肽键羰基极化 g 1u 残基协助水分子进行亲核攻击 水解肽键 擎p 1 0 2 i o 唿芦 8 s 复合糖 舭p 1 0 2 协 岱一 r 四西体中棚镌 分p l o z 嘹 诲毒基哆 i i 1 7 n h 醺 i 匕 咚蛳 q 0 2 咤一 这 o 酰化冀 1 图2 a 胰凝乳蛋白酶催化机理 1 3 些垒尘竺堕 堂堡堕苎 3 产一一一e 一一e i n y 一 t 夕 0 女e h h 一一s 惑c o o 梦 c h 之z 8 圈2 h 天冬氨酸蛋白酶催化机理 1 3 3 蛋白酶的应用 二 2 i 二 l 一 k l 州 箧曼翌 卜w n 土习 m m 一 m 匕 二 t 图2 c 半胱氨酸蛋白酶催化机理 蛋白酶广泛应用于医疗 食品 制革 缫丝和洗涤剂等工业 同时也是重要的生化 试剂 随着近年来对环保的要求越来越高 蛋白酶在环境工程方面也得到广泛应用1 2 l 3 3 1 洗涤荆二 业 自1 9 1 3 年作为洗涤添加剂以来 蛋白酶现在已被 泛应用于各种家用和专用洗涤 剂中 其用量占全世界工业用酶的2 5 1 9 5