（微生物学专业论文）微生物发酵橙皮生成曲酸及综合开发研究.pdf

四川大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进 行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特 别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指 导下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。 学生签名：塑曼韭导师签名：递 四川大学硕士学位论文 微生物发酵橙皮生成曲酸及综合开发研究 微生物学专业 研究生：霍蕾指导老师：孙启玲 摘要 中国的柑桔类水果年产量在1 0 0 0 万吨以上，数量巨大的柑桔加工必然产 生大量的副产物。一般柑桔类果实会产生5 0 左右的皮渣，如果不能很好的综 合开发，不但会浪费大量资源，而且会给环境带来很大压力。橙皮中不仅有可 供微生物生长的丰富的营养成分，而且含有生物类黄酮、纤维素、果胶等有用 物质可供开发利用。 在本文中从腐烂的桔皮、桔树根际土壤中筛到一株h - i o 菌株，以此展开研 究，内容包括以下几个方面： 1 菌种筛选 筛选到菌种h - 1 0 ，经过鉴定该菌种属于黄一米曲霉组，接近黄曲霉。 2 优化发酵条件 发酵产物检测的定性分析采用t l c 法，以在聚酰胺薄膜上观察到橙皮苷消 失，另一红色斑点产生为目标产物，暂定为产物a 。得到优化发酵条件：7 5 的橙皮，自然p h 值、2 0 装液量、2 5 、1 8 0 r p m 发酵1 2 0 h 。 3 产物a 的分离纯化、结构鉴定、含量测定 建立了产物h 的分离方法。经过浓缩、糖沉淀、重结晶、萃取等分离过程， 得到了大量的产物a 的粗晶，经过多次的重结晶得到了产物a 较纯的针状晶体。 经过核磁共振、红外检测等结构鉴定，得到以下数据：1 hn m r ( d ：0 ) 6 ： 8 0 1 6 8 ( 一o - c h = ) ，6 5 0 8 2 ( - c h = ) ，4 4 4 0 5 ( 一c h 2 0 ) ；0 1 3 cn m r ( d ：0 ) 6 ： 四”i 大学硕士学位论文 1 7 6 7 ( 一c 0 一) ，1 6 8 5 ( = c o ) ，1 4 4 6 ( = c o h ) ，1 4 2 1 ( = c o ) ，1 1 0 6 ( = c h ) ， 5 9 9 一c h ：一o ) 。红外数据，i r ：1 0 7 4 、1 4 7 2 、1 5 8 2 、1 6 1 2 、1 6 9 1 、2 9 2 4 、3 0 9 8 、 3 1 7 7c m - 1 。经以上数据分析得出结论：产物a 为曲酸( k o j i ca c i d ) ，分子式 c 乩0 4 ，分子量为1 4 2 。 建立曲酸定量检测方法，通过分光光度计法得到橙皮发酵液的曲酸产率为 0 2 3 3 。通过抗菌实验，证明橙皮发酵液的抗菌能力增强。 4 发酵副产物分析 发酵液中含有多种物质，包括多糖、黄酮、新产物橙皮素等。进过微生物 转化发酵液中总黄酮含量有大幅度提高，如未发酵的橙皮水提液黄酮含量为 0 0 1 4 7 ，孢子接种发酵后为0 0 2 3 ，发酵后总黄酮含量提高约5 6 5 ，大剂量 的液体种子接种可提高总黄酮含量达7 6 9 。 橙皮渣本身就可作为膳食纤维，经过微生物转化，其溶张性，持水力都有 所提高。未发酵的橙皮渣溶胀性为3 2 9 3 ，发酵后为3 8 5 3 ，溶胀性提高了1 7 ； 发酵前橙皮渣持水力为5 2 7 ，发酵后为9 7 2 ，持水力提高了8 4 7 。 之前的橙皮综合开发中，未见有开发曲酸的报道。微生物发酵橙皮制备曲 酸，为橙皮的综合利用提供了新的途径。 关键词：柑桔废渣、微生物发酵、综合开发、曲酸 2 四川大学硕士学位论文 s t u d i e so nm i c r o b i a lt r a n s f o r m a t i o no fo r a n g ep e e l st op r o d u c e k o j i ca c i da n dc o m p r e h e n s i v e u t i l i z a t i o n a b s t r a c t t h ey e a ro u t p u to fo t m sf r u i ti nc h i n ai so v e r1 0m i l l i o nt o n t h eg i g a n t i c c i t r u sf r u i tu t i l i z ei n d u s t r yb r i n gt r e m e n d o u sb y - p r o d u c t si n e v i t a b l y i ng e n e r a l ，t h e p r o c e s so fc i t r u sf r u i tu t i l i z eh a v e5 0 w a s t e s ，w h i c hc o n c l u d eo r a n g sp e e l sa n d r e s i d u e s i ft h e s ew a s t e sc a n n o tb eu s e da p p r o p r i a t e l y , t h e r ea r en o to n l ya b o u d a n t r e s o u r c e sw a s t ee v e r yy e a r ，b u ta l s o t a k el u m b e r s o m ep r e s s u r et oe n v i r o n m e n t s e c a f i t y i nf a c t , t h eo r a n g ep e e li sr i c hi nn o u r i t i o nf o rm i c r o b i ot ou s e ，a n d ，t h e b i o f l a v o n o i d 、f i b e r ，p e c t i ca l s oc a l lb ec o m p r e h e n s i v eu s e d t h e r ea r et h o s ew o k sa n dm a i nr e s u l t so fo u rs t u d yi n c l u d e ： 1 t h em e t h o do fs t r a i n ss c r e e ns e tu pw a su s e dt of i l t r a t eas t r a i nw h i c hc a n u s eh e s p e r i d i na sc a r b o nr e s o u r c e ，a c c o r d i n gt 0s c r e e n i n gm o d e l t h es t r a i nh - 1 0 w a ss e l e c t e df r o mo v e r2 0d i f f e r e n ts o i l sa r o u n dc i t r u st r e e sa n dr o t t e do r a n g e p e e l s 2 t h ep r o d u c t so ff e r m e n t a t i o mw a se x a m i n e db yt h em e t h o do ft h i nl a y e r c h r o m a t o g r a m i tc a nb es e e n t h em a r ko fh e s p e r i d i nw a sv a n i s h e dg r a d u a l l y , a n da n e wr e dm a r kw a ss e e n ，w ec a l l e di ta p r o d u c t f o rt h ea i mo fp r o d u c eap r o d u c t , w eg o tt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n ：o r a n g ep e e lp o w d e r7 5 ( 、w v ) ，t h ep hw a s n a t u r e ， 2 0 m e d i u m ，2 5 c ，1 8 0 r p ms h a k i n gf o r5 d 3 t h ea p r o d u c tw a ss e p a r a t e db yt h ec o m b i n a t i v em e t h o do fe x t r a c t i o na n d r e p e a t e dc r y s t a l ，t h ec o m b i n a t i v em e t h o do fh p l c 、n m ra n di rw a su s e dt o i d e n t i f yt h eap r o d u c t t h e nt h ef o l l o w i n gs t a t i s t i cw e r eg o t ：1 hn m r ( 0 2 0 ) d ： 8 0 1 6 8 ( 一o c h = ) ，6 5 0 8 2 ( - c h - ) ，4 4 4 0 5 ( 一c h 2 - ) ；0 1 3 cn m r ( d 2 0 ) d ：1 7 6 7 ( 一c o - ) ， 1 6 8 5 ( c - 4 ) ，1 4 4 6 ( c o 哪，1 4 2 1 ( c 一1 ) ，1 1 0 6 ( c 一3 ) ，5 9 9 ( 一c h 2 - ) 。i r ：1 0 7 4 、1 4 7 2 、 1 5 8 2 、1 6 5 9 、1 6 9 1 、2 9 2 4 、3 1 7 7 啪一。s u m m a r i z e da n da n a l y e dt h e s er e s u l t s w eg o t t h ec o n c l u s i o nt h a tt h ea p r o d u c tw a sk o j i ca c i d t h o u g hs p e c t r o p h o t o m e t e rm e t h o d ， t h ek o j i ca c i dp r o d u c er a t ew a sa b o u t0 2 3 t h e a b i l i t yo fa n t i b a c t e r i a lw a s 3 四川大学硕士学位论文 s t r o n g e ra f t e rm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n 4 t h ec o n t e n to ft o t a lb i o f i a v o n o i dh a dal a r g ec h a n g ea f t e rm i c r o b i a l f e r m e n t a t i o n u s e dt h es p o r et of e r m e n t ，t h ec o n t e n to ft o t a lb i o f l a v o n o i dw a s i n c r e a s eb y5 6 5 ，u s e dt h el i q u i ds e e d st of e r m e n t ，t h ec o n t e n to ft o t a lb i o f l a v o n o i d w a si n c r e a s eb y7 6 9 5 t h eo r a n g ep e e lp o w d e ru s e dt ob ea st h ed i e t a r yf i b e r w a t e rh o l d i n g c a p a c i t ya n de x p a n s i o nc a p a c i t yw e r ek n o w na si m p o r t a n tc h a r a c t e ro fd i e t a r yf i b e r a f t e rm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n , t h ew a t e rh o l d i n gc a p a c i t yo fi tw a si n c r e a s e db y 8 4 7 ，a n de x p a n s i o nc a p a c i t y1 7 t h i sr e s e a r c hp r o v i d ean e wa p p r o a c ho fe x p l o i t i n ga n du t i l i z i n gr e s o u r o eo f o r a n g ep e e l s ，o no n es i d e ，i tc a np r o d u c et h ek o j i ca c i d ，o nt h eo t h e r ，t h em i c r o b i a l f e r m e n t a t i o ns u p p l yan e ww a yt oc o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o n k e yw o r d s ：o r a n g ep e e l ，m i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n ，c o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o n , k o j i ca c i d 4 四川大学硕士学位论文 刖昌 柑桔是世界产量第一的水果种类，2 0 0 3 2 0 0 4 年度世界主产国柑桔产量 约为7 1 1 0 万吨。我国柑桔栽种面积居世界之首，占世界柑桔栽种总面积的1 8 ， 年产量达1 0 1 4 万吨，仅次于巴西美国之后名列第三位。四川省历来是柑桔生成 大省，2 0 0 6 年四川省柑桔种植面积达到3 2 6 万亩，总产超过2 0 0 万吨。成都 周边的金堂地区更是全国著名的柑桔之乡，四川省优质柑桔生产基地。金堂县 现有柑桔种植面积总面积达2 8 万亩，2 0 0 6 年产量超过2 0 万吨。 可喜的产量带来了大规模的生产加工，大量加工副产物也随之产生。一般 柑桔类果实会产生5 0 的皮渣，几乎9 9 的柑桔皮都被作为废料丢弃了，既造 成资源的浪费，也造成环境的污染。其实柑桔皮渣含有诸多有用物质，如生物类 黄酮、纤维素，果胶、香精油和色素等。 生物综合开发橙皮有微生物产酶酶解橙皮纤维素，或发酵生产膳食纤维、 动物饲料等。橙皮主要成分为纤维素，其葡萄糖亚基排列紧密有序，形成类似 晶体的不透水结构，橙皮的致密的纤维素限制了与它结合的其他物质的利用， 动物直接食用也难以消化。大量文献表明，经过相应的微生物菌种发酵后，纤 维素含量降低，可溶性纤维增商，抗氧化性提高，生物活性也有一定提升。此 外以橙皮苷为代表的水不溶性物质限制了橙皮产物的应用，橙皮苷的衍生物、 或是橙皮中其他活性成分并没有很好开发出来。如果筛选到合适的菌种，一方 面生成橙皮苷的衍生物，立一方面降低纤维素的含量，并开发其他副产物，必 能给橙皮的开发应用带来广阔前景。 5 四川大学硕士学位论文 第一章橙皮转化菌株的筛选及其鉴定 第一节橙皮转化菌株的筛选 1 设备与材料 1 1 主要仪器 m p 4 0 0 电子天平上海第二天平仪器厂 超净工作台北京半导体设备一厂 s a n l 0a u t oc l a v em l s 一3 7 5 0 灭菌锅 隔热式电熟恒温培养箱国光医化仪器厂 h z q - x 1 0 0 振荡培养箱哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 e p p e n d o r fc e n t r i f u g e5 8 0 4 r 离心机德国e p p d o r f 公司 1 2 主要药品 橙皮苷标准品、橙皮素标准品( 购于四川省食品药品检验所) 去氧胆酸钠、f e c i 。( 购于长征药品，化学纯) 乙酸乙酯、甲醇、乙醇( 购于长征药品，分析纯) 1 3 培养基 马铃薯培养基平板( ) ： 称取2 0 9 去皮的土豆切碎煮沸3 0m i n 后用纱布过滤去滤渣，于滤液中 2 1 2 9 葡萄糖定容到l oo l l ，添加0 2 去氧胆酸钠，混匀后加) k 2 9 琼脂，灭菌。 橙皮苷碳源查式培养基平板( ) ： n a n 0 30 0 2 k ：h p 0 4 0 0 1 m g s 0 4 7 h 。0 0 0 0 5 f e s 0 40 0 0 0 1 k c l 0 0 0 5 橙皮苷08 6 四川大学硕士学位论文 琼脂1 8 自然p h 值 去氧胆酸钠0005 低糖培养基： 在上述橙皮苷碳源查式培养基平板基础上添加0 1 葡萄糖 橙皮发酵培养基： 5 9 橙皮，l o o m l 水，自然p h 值 1 4 菌种来源 从桔树根际周围土壤、长霉的湿润桔皮中筛选。 2 方法 2 1 橙皮苷的薄层检测( t l c ) 固定相：聚酰氨薄膜 流动相：乙酸乙酯：甲醇：水= 1 0 0 ：1 7 ：1 3 显色剂：1 f e c l 。乙醇溶液 2 2 菌株筛选 2 2 1 菌种初筛 收集长霉的柑桔皮，用无菌水洗下孢子；收集桔树根际周围土壤，用无菌 水洗后，采用梯度稀释法稀释1 0 个梯度，涂土豆平板，2 8 * ( 2 培养2 天后挑取单 菌落于土豆斜面。 用接种针将富集的菌种孢子接于低糖培养基平板，2 8 c 培养2 3 d 后观察， 挑取能长出菌落、生长较好的菌种。 2 2 2 菌种复筛 将初筛选出的菌株接入橙皮苷查氏培养基平板，2 8 c 培养2 3 d 后观察， 挑取能长出菌落、生长较好的菌种。 将上述菌株孢子接于橙皮发酵培养基，一般霉菌培养条件发酵3 d 、5 d 后， 7 四川大学硕士学位论文 离心，取上清夜。发酵上清夜采用2 1 橙皮苷薄层法检测发酵情况。 3 结果与讨论 3 1 菌种初筛结果 菌种在土豆平板大量生长，收集菌株8 3 株。 将上述菌株的孢子接入低糖查氏培养基后，小部分菌种不能生长，一部分 菌种菌落很小，生长缓慢，约3 4 株能正常长出菌落，编号h - 1 h - 3 4 。其中有 1 5 株生长比较好，菌落较大。 表1 ：初筛菌株及形态 菌种编号形态菌种编号形态 h - 1黑曲霉 h 一1 7 灰褐色霉菌 h - 4黑曲霉 卜1 8 黑曲霉 h 一5 青霉 h - 1 9 灰白色霉菌 h - 8 毛霉，底部有淡紫色 h 一2 2 青霉 h - 9黑曲霉h - 2 9黄绿色霉菌，有菌核 h l o 黄绿色霉菌 h 一3 1 黄绿色霉菌 h 一1 3黑曲霉 h - 3 4 青霉 h 一1 4 白色菌丝，菌丝生长旺盛 3 2 菌种复筛结果 上述1 5 株菌种有8 株可以在橙皮苷平板上生长，菌株生长部位有浅浅的透 明圈。将以上8 株菌的发酵液用薄层检测，发酵转化最好的情况见图1 所示。 h 一1 0 菌种和h - 2 9 菌种转化能力高于其他菌种，橙皮苷消耗比较完全， 生成了新的产物，而且产物量比较大。 目前，h 一1 0 、h - 2 9 菌株为出发菌株。 8 四川大学硕士学位论文 图t ：两种菌种发酵时问效果比较 1 h _ 1 0 菌种发酵3 d ，2 1 0 菌种发酵列 3 h 一2 9 菌种发酵3 d ，4 h - 2 9 萄种发酵翮 3 3 发酵结果讨论 图2 ：发酵转化前后比较 1 灭菌后发酵前，2 发酵后， 3 橙皮苷标准品 图3 ：发酵产物a 的定位 1 ，5 d 的发酵液，2 橙皮素标准品 3 橙皮苷标准品 由图2 可知，培养基灭菌后橙皮苷含量很高，经过几天发酵后橙皮苷的点 逐渐消失，红色产物大量生成，暂时命名为产物a ，有少量的产物b 生成。图2 可以清楚的看出产物a 是发酵过程中产生的，参照图1 ，在发酵过程中橙皮苷 9 四川大学硕士学位论文 的量逐渐减少，产物a 的量逐渐增大。可以推测产物a 的生成和橙皮苷的减少 有一定的关系。 由图3 可知，产物a 在薄层层析中的r f 值约为o 8 ，不符合橙皮苷的糖 苷一一橙皮素的迁移率( r f = o 9 ) ，产物a 有可能是橙皮苷的单糖苷，即橙皮苷 失去一分子鼠李糖后所剩的葡萄糖与橙皮素的结合体，称为单葡萄糖橙皮素( 参 见图4 ) h 一砘 橙皮苷h e s p e r i d i n 单葡萄糖橙皮素m o n o g l u c o s y h e s p e r e t i n 橙皮素h e s p e r e t i n 图4 ：橙皮苷及其衍生物 由图2 、图5 分析可知，橙皮发酵后产生大量的产物a 和少量产物b ，产物 b 经薄层层析判断为橙皮素，即橙皮苷的糖苷，橙皮苷脱去一分子鼠李糖、一 分子葡萄糖之后的产物( 参见图4 ) 。 发酵液离心后所剩的发酵渣，添加与发酵液同等体积的水搅拌3 0 r a i n 后离 心，水提液薄层层析( 参见图6 ) 可知产物a 大部分在发酵液中，发酵渣中含 量较少，在今后的实验中以发酵液中的产物a 来判断发酵情况。 产物a 在发酵液中大量存在，发酵渣水提液中也可得到相当多的产物a ， 产物a 的水溶性比较大。从图4 橙皮苷及其衍生物的结构可以推断出，橙皮苷 比单葡萄糖橙皮素含有更多的酚羟基，理论上橙皮苷的水溶性应该比单葡萄糖 橙皮素更大。橙皮苷是不溶于水的，目前实验结果推断出产物a 的水溶性比较 蝴 孵 四川大学硕士学位论文 好，这和结构分析结果有矛盾。 豳5 ：发酵产物分析 1 橙皮昔标准品，2 发酵前， 3 发酵后4 橙皮素标准品 图6 ：发酵液渣中产物的比较 1 橙皮苷标准晶，2 发酵液 3 发酵渣水提液 综上所述，产物a 是一种发酵代谢产物，是否为橙皮苷的衍生物单葡萄糖 橙皮素，它在发酵过程中怎样产生的，都值得在后续实验中进一步探讨。 第二节菌种形态鉴定 通过初筛和复筛得到了两株菌种，h 一1 0 和h - 2 9 ，在之后的工作中发现h - i o 菌种有更强的转化能力，所以对h 一1 0 菌种的种属、生理特征进行鉴定。 1 仪器 恒温培养箱，国光医化仪器厂 o l y m p u s 光学显微镜 2 方法 2 1 培养基： 四川大学硕士学位论文 马铃薯培养基平板：称取2 0 9 去皮的土豆切碎煮沸3 0m i n 后用纱布过滤 去滤渣，于滤液中加2 9 葡萄糖定容到1 0 0 m ，添加0 2 去氧胆酸钠，混匀后 加入2 9 琼脂，灭菌。 2 2 菌种性质研究 2 2 1 平板培养法进行菌落形态鉴定 配制土豆固体培养基2 0 0 m l ，灭菌、倒平板( 每平板倒入2 0 m l ，以保证平 板厚度一致) ，冷却后备用。无菌操作情况下，用灭菌后的打孔器在冷却的土 豆培养基平皿中心打孔，孔径约5 m m 左右。将接种针经火焰灼烧并待冷却后， 从斜面上蘸少量h l o 菌种孢子，与5 m l 无菌水中混匀。用灭菌吸管吸取孢子悬 液滴于平板上中心孔径中。静置5 m i n ，约水分吸收后将培养皿倒置平放于恒 温箱中在2 8 c 下培养，观察菌落的特征。 2 2 2 载片培养法进行菌丝体及孢子梗形态鉴定 同2 2 1 准备好土豆培养基平皿，孢子悬液。用酒精棉擦拭盖玻片，在酒 精灯上晃动，挥干酒精。无菌操作条件下，将盖玻片斜着插入土豆培养基平皿 中。将孢子悬液滴于盖玻片斜面下方。放于恒温箱中在2 8 c 下培养，3 6 h 后将 盖玻片取出，制片，显微镜观察。 3 结果 3 1 菌落形态 通过在平板上培养，表明该菌生长的速度较快，在马铃薯培养基上菌落表 面菌丝颜色黄绿色、且颜色由内到外逐渐变浅，底部菌丝呈黄青色，菌落背面 呈浅黄色，菌落表面有辐射状纹，中心部位有突起，有颜色较深的菌丝，菌落 最外边缘有一圈浅白色菌丝环。培养过程中没有渗出物出现及其他异昧。菌株 在马铃薯培养基的正面及背面的菌落形态如图7 、图8 所示。 四川大学硕士学位论文 图7 ：菌落正面圈8 ：菌落反面 3 2 孢子及孢子梗形态 气生菌丝长、有横隔，透明无色，顶囊球形，孢子囊在显微镜下的形态如 图9 所示， 图9 ：孢予囊 图1 0 ：菌丝 4 讨论 该菌种属于黄一米曲霉组，顶囊球形，颜色与菌落相同，菌落初略带黄色， 渐变为黄绿色，最终成褐绿色，和真菌鉴定手册中黄曲霉相似。 小结 经过实验室保存菌种、桔树根际周围土壤、长霉橙皮中的筛选，最终确定 四川大学硕士学位论文 了一株发酵转化比较好的菌株 i 一1 0 菌株，对h - i o 菌株进行了菌种形态学 鉴定，初步确定该菌种属于黄一米曲霉组，接近于黄曲霉。 用h 一1 0 菌株发酵橙皮，橙皮苷逐渐减少，随之产生大量未知产物，暂定 为产物a ，产物a 有较好的水溶性，除此之外还产生少量的橙皮素。 1 4 四川大学硕士学位论文 第二章橙皮发酵转化条件的优化 1 材料与设备 1 1 材料与试剂： 市售柑桔，取其皮烘干、打粉，过2 0 目筛。 橙皮苷标准品( 购自四川省食品药品检验所) 1 2 仪器与设备： h z q - x 1 0 0 振荡培养箱( 哈尔滨) 贝克曼j 一2 5 i 高速冷冻离心机 高效液相色谱仪( w a t e r s 公司) 2 检测方法 2 1 薄层层析法( t l c ) 固定相：聚酰氨薄膜 流动相：乙酸乙酯：甲醇：水= 1 0 0 ：1 7 ：1 3 显色剂：1 f e c l ，乙醇溶液 2 2 高效液相色谱法( i i p l c ) 高效液相色谱分析条件：色谱柱c 1 8 柱，柱温2 8 ，流动相是甲醇 ( 4 0 ：6 0 ) ，流速im l m i n 。进样量l o u l ，检测波长2 8 3 n m 3 方法 将保存的h - i o 菌孢子接种于马铃薯琼脂斜面上，置2 8 恒温箱培养3 天。 获得母斜面，选用生长正常、孢子丰富的斜面加一定量的无菌水，打散孢子后， 用显微镜记数并调节为每毫升孢子( 1 0 0 0 0 5 ) xi 0 8 个。将粉碎后的橙皮按 一定的料水比进行配制，灭菌冷却后接入孢子浓度为( 1 0 0 0 0 5 ) 1 0 8 m l 的孢子悬液5 m l ，放入2 8 的恒温培养箱培养。观察转化情况，对其转化时间、 转化温度、橙皮比例、转速、初始p h 、无机盐等情况进行考察，其间用t l c 检 1 5 四川大学硕士学位论文 测橙皮发酵情况，确定出最佳的转化条件 3 1 发酵时间的确定 在温度为2 8 “c p h 自然、料水比为5 、装液量为2 0 ，转速1 8 0 r p m 的条 件下分别发酵3 6 、6 0 、7 2 、1 0 8 、1 3 2 h ，按2 1 所述方法测定发酵产物a 及橙 皮苷的转化情况。 3 2 橙皮比例的确定 在温度为2 8 、p h 自然、装液量为2 0 0 5 ，转速1 8 0 r p m ，橙皮量分别为2 5 、 5 、7 5 、1 0 的条件下发酵1 2 0 h ，按2 1 所述方法测定发酵液中产物a 的生 成情况。 3 3 发酵温度的确定 p h 自然，料水比为7 5 、装液量为2 0 ，转速1 8 0 r p m ，分别在2 5 、2 8 、 3 2 。c 的条件下发酵1 2 0 h ，按2 1 所述方法测定发酵液中产物a 的生成情况。 3 4 装液量的确定 在p h 自然，温度为2 8 c 、料水比为7 5 、转速1 8 0 r p m ，装液量分别为l o 、 2 0 、3 0 、4 0 的条件下发酵1 2 0 h ，按2 1 所述方法测定发酵液中产物a 的生 成情况。 3 5 初始p h 的确定 在温度为2 8 c 、料水比为7 5 、转速1 8 0 r p m ，初始p h 分别为4 、5 、6 、7 、 8 的条件下发酵1 2 0 h ，按2 1 所述方法测定发酵液中产物a 的生成情况。 3 6 摇床转速的确定 在温度为2 8 、料水比为7 5 、装液量为2 0 ，转速分别为1 5 0 r p m 、1 8 0 r p m 、 2 0 0 r p m 、2 2 0 r p m 的条件下发酵1 2 0 h ，按2 1 所述方法测定发酵样品中中产物a 的生成情况。 1 6 四川大学硕士学位论文 3 7 无机盐等条件的确定 在上述发酵单因素条件基础上，添加少量无机盐( 查氏培养基比例) 、增 加一定量葡萄糖，按2 1 所述方法测定发酵样品中中产物a 的生成情况。 4 结果 4 1 发酵时间对产物a 的影响 围i i ；发酵时间对产物的影响 1 0 1 发酵3 6 h ，2 发酵6 0 h ，3 发酵8 4 发酵1 0 8 h ，5 发酵1 3 2 h 圈1 2 ：两种菌种发酵时闻效果比 i h - 1 0 菌种发酵3 d ，2 _ 1 0 菌种发酵5 d 3 h - 2 9 菌种发酵3 d ，4 h - 2 9 菌种发酵5 d 由图1 1 可知：发酵6 0 h 时就产生了发酵产物a 。但是，随着发酵时间的延 长，产物a 的量也随之增加，直到1 3 2 h 后发现整体含量都下降；后续的实验表 明( 图1 2 ) ，发酵3 天时，橙皮苷还有剩余，发酵5 天时，橙皮苷消失，产物a 大量产生，1 0 # 菌种和2 9 # 菌种都在5 天时达到产物a 积累最大值，在同等条 件下1 0 # 菌种的产量更高。考虑到产物a 有可能是橙皮苷转化生成，鉴于今后 分离工作的开展，最佳发酵时间为5 天，此时橙皮苷消失而产物a 积累量最大。 4 2 橙皮比例对产物a 的影响 7 四川大学硕士学位论文 由图1 3 可知：当橙皮的浓度由2 5 增长到7 5 时，产物a 的生成呈上 升趋势，到7 5 升至最大，1 0 的橙皮时产物a 产量降低。在图1 4 中也有相 同情况。不同处在于h 一1 0 菌种的产出率明显高于h 一2 9 菌种。橙皮含量过高不 利于氧气溶解和微生物生长，故产物a 产量随之降低。因此，培养基中最佳的 橙皮量为7 5 。 图1 3 ：( 1 0 菌种) 不同橙皮比例 1 料液比2 5 ，2 料液比碍， 3 料液比7 5 ，4 料液比1 0 图1 4 ：( h 9 菌种) 不同橙皮比例 1 料液比2 5 ，2 料液比骗， 3 料液比7 5 ，4 料液比1 饿 参照图1 2 中h l o 菌种的转化情况明显高于h - 2 9 菌种，不同橙皮量的情 况下产量有很大差别，在今后的实验中，选用h - i o 菌种为出发菌株。 4 3发酵温度对产物a 的影响 由图1 5 可知：当发酵温度由2 5 c 增加到2 8 时，产物a 的量随之增加， 而发酵温度由2 8 c 增加到3 2 时，产物a 和橙皮苷都有消耗。虽然在2 8 c 下产 物a 的量更大，温度升高会有很多副产物生成，不利于今后分离纯化。所以发 酵的最适温度为杂质为少的2 5 c 。 4 4 装液量对产物a 的影响 由图1 6 可知：当装液量由1 0 增加到2 0 时，产物a 的产量增加，2 0 1 8 四川大学硕士学位论文 以上的装液量不产生产物a 。由此看出，发酵的最适装液量为2 0 。 图1 5 温度对产物a 的影响 1 橙皮苷标准品，2 2 5 3 2 8 4 3 2 4 5 初始p h 对产物a 的影响 图1 7 = 初始p h 对产物a 的影响 1 初始p h 为42 初始p h 5 ， 3 初始p h 为6 ，4 初始p h 为7 、_ ，孑矿 i 一。， 。3 5 ，5 ；暴4 0 围1 8 ：转速对产物a 的影响 1 1 5 0 r p m , 2 1 8 0 r p m , 3 2 0 0 r p e l 4 2 2 0 r p m e ： 3 f 譬勉 1& 四川大学硕士学位论文 。， 由图1 7 可知，当初始p h 为5 时，有痕量产物a 生成，当初始p h 为6 时， 才能大量生成产物a ，在其他条件下都不可产生，可见弱酸环境适合产物h 的生 成。鉴于体系的自然p h 也为6 ，最佳p h - - - - - 6 ，即自然p h 值。 4 6 转速对产物a 的影响 由图1 8 可知：当转速由1 5 0 r p m 增加到1 8 0 r p m 时，产物a 的产生随之增加， 。而转速由1 8 0 r p m 增加到2 2 0 r p m 时，产物a 的产生随之降低。由此看出，发酵 的最适转速为1 8 0 r p m 。 4 7 无机盐等条件的影响 图1 9 发酵比较 1 添加葡萄糖2 添加无机盐 3 原发酵条件4 橙皮苷标品 图2 0 ：最佳单因素组合发酵前后比较 1 灭菌后发酵前，2 发酵后， 3 ，橙皮苷标准品 由图1 9 可知，添加了少量葡萄糖和无机盐的发酵液中除了含大量产物h 外，未见对发酵产生太大的影响，暂时不添加。 4 8 最佳发酵条件的确定 考虑到产物a 可能是橙皮苷转化的黄酮类物质，杂质过多不利于后期分离 2 0 四川大学硕士学位论文 纯化，在产物a 不确定的情况下无法用定量的方法来确定最佳发酵条件，就将 橙皮苷消失，产物a 大量产生，杂质很少的情况视为最佳发酵条件。 由图2 0 可知，培养基灭菌后整个发酵体系不含产物a ，橙皮苷含量高，优 化发酵条件后，橙皮苷的点消失，产物a 大量生成。所以，最佳发酵条件为橙 皮7 5 ，自然p h 值、2 0 装液量、2 5 、1 8 0 r p m 发酵1 2 0 h 。 在此基础上大量富集发酵液。 4 8h p l c 检测产物a !ll 奠，；懋、jv、，。、，久!。l，_i、，一一一一 由图2 l 高效液相色谱数据可知，橙皮苷标准品出蜂时间为8 7 6 4 ，发酵前 在9 0 8 9 分钟出现橙皮苷的峰，发酵后3 7 3 、4 1 1 分钟都有杂质峰。经过发酵， 在3 3 3 6 位置出现新物质，发酵后其他杂质很少。 小结 通过对发酵时间、发酵温度、转速、装液量、橙皮比例、无机盐添加情况 的薄层层析检测，得出最佳优化条件：7 5 橙皮，自然p h 值、2 0 装液量、 2 5 、1 8 0 r p m 发酵1 2 0 h 。在此条件下橙皮苷的点消失，产物a 大量生成，副产 物少。 四川大学硕士学位论文 第三章产物a 的研究 第一节产物a 的分离纯化 1 材料与仪器 1 i 试剂与材料 f e c l 。为化学纯，乙酸乙酯、盐酸为分析纯 在最佳发酵条件基础上富集的大量发酵液 1 2 仪器： 贝克曼j - 2 5 i 高速冷冻离心机 s e n c or 2 0 1 旋转蒸发仪上海申顺生物科技有限公司 2 方法 分离过程中用薄层层析方法检测产物a 的分离情况。 2 i 发酵液的初步处理 初始带渣发酵液 橙皮渣( 经乙醇提取后，其中已无产物a 和橙皮苷) 发酵液 厂 l浓缩 _ 一 浓缩液1 0 0 m i 沉淀( 用乙醇溶，基本无产物a ) 乙醇液 糖沉淀 糖沉淀渣 乙醇液( 若检测到大量产物a ) 四川大学硕士学位论文 图2 2 ：发酵液初步处理流程图 发酵液的初步处理包括离心、去除发酵渣、去除沉淀、去除发酵液中的糖 等等，得到富含产物a 的乙醇溶液。 2 2 萃取法 产物a 的乙醇溶液，旋转蒸发去除乙醇后用等体积水溶解，按照体积比l ： l 加入乙酸乙酯进行萃取，每隔2 m i n 振荡l m i n ，共振荡3 次后静置，分离乙酸乙 酯层，重复3 次后将收集的乙酸乙酯液放入旋转蒸发器中浓缩，得到产物a 的乙 酸乙酯溶液。 2 3 重结晶法 2 3 1 产物a 粗晶的制备 图2 3 ；热乙醇除杂流程图 多次重复上述工艺流程后得到乙醇溶液，旋转蒸发挥干乙醇后用水溶解， 浓缩至一定体积，在4 下结晶2 4 h ，真空抽滤、收集粗晶体。 2 3 2 产物a 晶体的制备 将产物a 粗晶体溶解，结合萃取等方法，多次重复热乙醇除杂流程，得到 淡黄色的产物a 乙醇溶液后，旋转蒸发挥干乙醇后用水溶解，浓缩至一定体积， 在4 下结晶2 4 h ，真空抽滤、收集晶体。 四川大学硕士学位论文 2 3 3 产物a 晶体的h p l c 高效液相色谱分析条件：色谱柱c 1 8 柱，柱温2 8 ，流动相是甲醇：水 为4 0 ：6 0 ；流速1m 1 m i n ，进样量l o u l ，检测波长2 8 3 n m 3 结果 3 1 初步处理的发酵液 从图2 4 可知产物a 在薄层层析上成鲜艳的酒红色，大量浓缩后有未转化 完全的橙皮苷出现。 3 2 萃取的产物a 图2 4 z 初步处理的发酵液图2 5 ：萃取的产物a 从图2 4 、图2 4 中可以看到，初步处理后杂质还是很多，经过萃取之后杂质 减少。之后采用采用萃取和反复结晶相结合的办法。 3 3 粗晶制备 粗晶体为红褐色块状结晶。 3 4 产物a 纯晶体的制备 经过反复萃取、结晶得到的较纯晶体为针状米色结晶。 2 4 四川大学硕士学位论文 图2 6 z 租品t l c 3 5 产物a 晶体的h p l c 囤2 7 ：产物a 纯晶体t l c 圈2 8 - 产物 晶体的呼l c 由高效液相色谱可知，产物a 的保留时间为3 3 1 7 m i n ，样品纯度达到结 构鉴定的样品标准。 1 材料与设备 第二节产物a 的结构鉴定 四川大学硕士学位论文 1 1 材科 分离所得淡黄色针状结晶 1 2 试剂 重水( d ：0 ) 色谱纯 1 3 仪器 傅立叶红外光谱仪( 美国n i c o l e t 公司) i n o v a - 6 0 0 型6 0 伽h z 核磁共振仪。 2 方法 2 1 核磁鉴定 送中国科学院成都生物所检测中心核磁测试处检测，i n o v a - 6 0 0 型6 0 0 mt t z 核磁共振仪，p r o b e ：1 3 c 一1 h d u l ，t e = 3 0 0 k ，s o l v e n t ：d 2 0 ，s p e c t r u m ：l i t 、1 3 c 2 2 红外鉴定 取提取纯化后的样品用k b r 压片，在红外光谱仪上扫描检测，得红外光谱图。 3 结果与讨论 3 1 核磁h 谱鉴定结果 图2 9 ：产物a 的h 谱数据 2 6 四川大学硕士学位论文 样品核磁共振图显示如下结果：1 hn m r ( d 2 0 ) 6 ：8 0 1 6 8 ( 一o _ c h = ) ， 6 5 0 8 2 ( 一c h = ) ，4 4 4 0 5 ( 一c h ：一o 一) 。 ， 从图中可以推断出产物a 有三种类型四个氢。由于溶剂为重水，在4 6 位 置出现很大的溶剂造成的峰，对4 。4 4 0 5 峰形有些影响。从氢个数的比例来说， 这三个位置的氢数目分别为1 ：1 ：2 。需要指出的是，在重水溶剂系统中，活 泼质子( 羟基氢) 是不容易检测到的，其范围在5 o 1 0 都可能有分布，只有 在二甲基亚砜( d m s 0 ) 作为溶剂系统的情况下才能准确定位羟基氢。 3 2 核磁c 谱鉴定结果 样品核磁共振图显示如下结果：o “cn m r ( d 2 0 ) 6 ：1 7 6 7 ( 一c 沪) ，1 6 8 5 ( = c - o ) ，1 4 4 6 ( = c - o h ) ，1 4 2 1 ( = c o ) ，l l o 6 ( = c 一1 4 ) ，5 9 ，9 ( 一c h z o ) 。 从图中可以推断出，产物a 有六个碳。经过数据查询和推断，产物a 的核 磁数据和一种吡喃酮相同。这种化合物为5 一羟基一2 一羟甲基一4 ，4 吡喃 酮，也就是曲酸( k o j i ca c i d ) ，其结构式如图所示。产物a 的核磁数据与曲酸 相符，其分子式c 。0 4 ，分子量为1 4 2 。 四川大学硕士学位论文 3 3 红外鉴定结果 i 入 8 h cc c h 2 0 h d 图3 2 ：产物a 的红外检测结 从产物a 的红外检测结果( 图3 2 ) 看：i r ：1 0 7 4 、1 4 7 2 、1 5 8 2 、1 6 1 2 、 1 6 9 1 、2 9 2 4 、3 0 9 8 、3 1 7 7c 一。产物a 的红外数据与曲酸主要功能团的数据一 致。 1 0 7 4a m l 对应c - o 结构吸收，1 4 7 2c m - 1 对应c h 结构吸收，1 5 8 2 、1 6 1 2 c m l 对应c = c 结构吸收，1 6 9 1a m l 对应c = o 结构吸收，2 9 2 4a m l 对应c - h 结构吸收， 3 0 4 8c m 。对应c = c h 结构吸收，3 1 7 7c f f l 对应一0 h 结构。 参见下图3 3 曲酸标准品的红外图谱。 四川大学硕士学位论文 围3 3 标准曲酸的红外吸收光谱 所以，从以上数据可以断定发酵所得产物a 即为曲酸。 4 讨论 4 1 产物a 蓍曲酸的比较 表2 ：曲酸和产物a 的比较 曲酸产物a 发酵菌种黄曲霉、米曲霉h - 1 0 ，黄米曲霉组 发酵温度 3 0 2 5 3 2 转速1 8 0 2 0 0 r d m 1 8 0 r p m 初始p h 66 装液量 1 5 2 0 发酵时间 o c l5 d 晶体颜色白色或类白色米色 晶体形态针状晶体 针状晶体 4 2 曲酸的来源 4 2 1 曲酸由h 一1 0 菌种发酵代谢产