嗜盐菌与高盐有机废水的生物强化处理实验方案.doc

嗜盐菌与高盐有机废水的生物强化处理实验方案1：取样：样品取自威海市某盐场（威海市双岛盐场 环翠区张村镇前双岛村西（264203），此处还涉及到取样方法。土样采集方法：先选择好适宜地点，再用小铲子或无菌手套采样，取样时应除去表土，取表土以下的土并将采集到的土样盛入玻璃瓶或聚乙烯袋中。水样采集方法：500mL干净、灭菌的广口玻璃瓶一只，使用前必须彻底洗净，采样时应选择在较深的静水层中采样。方法：握住采样瓶底浸入水中一定深度（深度视水的深度而定）然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入，注意水样不应装满采样瓶。采集好的式样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点生态参数2：增值培养：如果采集到的样品中嗜盐菌的数量很少可以采用增值培养的方法增加嗜盐菌的数量，控制培养基的盐度和酸碱度，或在培养基中加入各种不同盐分的海水（控制盐度），调节pH至碱性，因为微生物代谢过程中会造成pH的变化，为了保证培养基处于适宜的pH范围，（具体pH值可根据土样或水样的pH确定）可在培养基中加入缓冲溶液（磷酸盐），但是当pH值下降的很剧烈以致加缓冲试剂也难以维持的时候可往其中加入碳酸钙，也可以往其中加入酸或碱溶液。 具体方法：取采集的土样g（湿重）或液体样品mL（可预先测定其盐度）置于盛100mL液体培养基的300mL三角瓶中，在光照条件下3337、120rmin摇床培养35d，富集菌体（用什么方法富集）；用接种环取一环富集培养液在预先制备好的大试管固体培养基斜面上连续划曲线；然后在3337培养箱下培养24天，获得斜面单菌落。（接种操作使用无菌接种箱或超净工作台）。培养基：酪素水解物 5g, 酵母浸出物（酵母膏）12g, 细菌蛋白胨 6g, 柠檬酸三钠 3g, KCL 3g ,MgSO4.7H2O 18g, CaCl2 0.2g, FeSO4 0.001g, NaCl 70g, 海水 1000mL, pH 7.5, 高温（121）灭菌2030min。液体培养基的配置：（1）：称量 用天平准确称量配置培养基所需的各种药品。先按培养基配方计算各成分的用量，然后进行准确称量。（2）：溶化 将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水（最好用蒸馏水），用玻璃棒搅拌促进溶解。（3）： 定容 待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如果某种药品用量太少时，可预先配制成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入培养基中。（4）调PH 用PH计测定培养基的PH，如果培养基偏酸或偏碱，可用1mol/L的NaOH溶液或1mol/LHCl溶液进行调节。调节PH时，应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱，从而破坏培养基成分。边加边搅拌，并不时用PH计测定，直至达到所需PH。对于固体培养基应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂（1.5%-2%）加入，并用玻璃棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去的水分。培养基的灭菌制好的培养基需要灭菌（高压蒸气锅灭菌）以保证培养基不含杂菌。如需制成斜面，应在高压蒸汽灭菌锅降压后，取出培养基摆成斜面。接种步骤：（1）：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。（2）：手持试管，将菌种和待接斜面的两只试管用大拇指和其他4指握在左手中，使中指位于两试管之间部位，斜面向上，并使他们位于水平位置。（3）：旋松棉塞，先用右手将棉塞旋松，以便接种时拨出。（4）：取接种环，右手拿接种环，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分均用火烧过灭菌。（5）：拔棉塞，用右手的无名指、小指、和手掌边先后拔出菌种管和待接使馆的棉塞，然后让试管口缓缓过火灭菌。（6）：环冷却，将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。（7）：取菌种，待环冷却后轻轻蘸取少量菌，然后将接种环移出接种管，注意不要使环的部分碰到管壁。（8）：接种，在火焰旁边迅速将蘸有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管，从斜面底部向上划曲线，切勿划破培养基。（9）：塞棉塞，取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上，塞棉塞时不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动式将不洁空气纳入。（10）：环灭菌，将接种环烧红灭菌，放下接种环，再将棉花塞旋紧。土中真菌的分离：将土样打碎蘸取上清液接种到适宜盐度（12%）的固体培养基上，直至长出耐盐菌落，然后采用接种环挑取一个菌落移入装有相同盐度液体培养基的锥形瓶中，在水浴摇床中于30下进行富集。水中真菌的分离：尽管通过增值培养效果显著，但是微生物还是处于混杂的生长状态，因此还必须分离、纯化。仔细观察上述斜面单菌落，挑取具有嗜盐菌典型特征（拥有什么特征）的菌落再次在固体培养基斜面上连续划线，培养，进行多次分离纯化得到纯培养嗜盐菌菌株。在上述的增值培养过程中可以设置盐度梯度，对嗜盐菌进行驯化，以让其适应更高的盐度。4：菌种鉴定：用原子力显微镜观察菌体形态、大小，依据常见细菌系统鉴定手册和伯杰氏细菌鉴定手册（第9版）进行常规生理生化鉴定，全细胞脂肪酸分析，16S rDNA序列同源性分析确定菌株的菌属。5：菌种保藏：分离纯化后的菌种用牛奶管保藏，以备试验时用，也可采用冷冻斜面法：将菌种转接在适宜的固体斜面培养基上，待其充分生长后，用封口膜或油纸将棉塞部分包扎好，置于4冰箱中保藏。6：菌液制备：将上述纯化的噬盐菌菌株在32 150r / min的液体培养基中摇床培养2d，获得菌悬液，将50mL的菌悬液经离心和盐水洗涤后获得纯菌液，然后再将其加入反应器中。配置模拟废水：针对好氧菌的降解要求，按CODCr：N：P为100:5:1的比例，以葡萄糖（1250mg/1000mL）为碳源，尿素(128mg/1000mL)、磷酸二氢钾(72mg/1000mL)磷酸氢二钾(30mg/1000mL)分别为氮源和磷源，加灭菌海水配制，添加NaCl调至含盐12%，PH值调至7.5，模拟废水CODCr=1494/L。也可以取工业废水。7：噬盐菌处理效果研究：反应器为六个有机玻璃SBR反应器SBR反应器：反应器1：（废水+未灭菌海水+活性污泥+菌液）；反应器2：（废水+未灭菌海水+菌液）；反应器3：（废水+活性污泥+菌液）；反应器4：（废水+未灭菌海水）；反应器5：（废水+活性污泥）；反应器6：（废水+菌液）。多孔增氧泵曝气（每个反应器的曝气量应相同），自动调温电热器控制恒温（32），每天调节pH值至 7.5 ，每隔24h取样，酸性重铬酸钾法测定CODCr值（氧化较完全，适用于各种水样）。绘制CODCr随时间变化曲线和CODCr去除率曲线，对比各个反应器废水处理效果，试验中每个反应器可以设3次重复，结果取3次测定的平均值。酸性重铬酸钾法测定CODCr值实验步骤：重铬酸钾标准溶液：先将重铬酸钾在120烘干2h至恒重，精确称取12.2588g，溶于1000mL蒸馏水中。硫酸亚铁铵标准溶液：称取硫酸亚铁铵FeSO4(NH4)SO4.6H2O98 g溶于蒸馏水中，边搅拌边缓慢加入20mL浓硫酸，冷却后加入1000mL容量瓶中，临用前用重铬酸钾标准溶液标定。标定：吸取25mL 0.04167mol/L重铬酸钾标准溶液，稀释至250mL，加20mL浓硫酸，冷却后加入23滴亚铁灵指示剂。用硫酸亚铁铵标准溶液滴定至溶液呈红褐色为止。硫酸硫酸银溶液：将11g硫酸银加入1000mL浓硫酸中，摇匀，放置12天，使其溶解。(1):取20.00mL混合均匀的水样（化学需氧量很高时也可取适量废水样稀释至20.00mL）置于250mL磨口的回流锥形瓶（三角瓶）中，加入适量（0.4g）硫酸汞，混匀。准确加入10.00mL重铬酸钾标准溶液以及数粒沸石，连接磨口回流冷凝管，从冷凝管口加入10mL含有硫酸银的浓硫酸溶液。轻轻摇动锥形瓶使溶液混匀，加热回流2h，（沸腾时开始计时）。（2）：冷却后，用蒸馏水淋洗冷凝管，并稀释至150mL。冷却后，加2-3滴亚铁灵指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定至溶液由黄色到蓝绿色