犬细小病毒核酸疫苗制备及免疫试验.doc

犬细小病毒核酸疫苗制备及免疫试验邱 薇1，范泉水1，李作生1，杨美峰1，郑 颖1，李丽红1，王双印1，李 江1，夏咸柱2（1.成都军区联勤部军事医学研究所，云南昆明 650032；2.解放军军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130062） 摘 要：以犬细小病毒基因组DNA为模板，应用PCR方法扩增了全长VP1基因，PCR产物经纯化和Not/BamH双酶切后与同样处理的真核表达载体pIRES进行连接，转化到感受态细胞JM109中，筛选了真核重组表达质粒pIRESVP1，并进行了序列测定。对6只9月龄犬分别接种不同剂量的pIRESVP1或空载体质粒及生理盐水，8周接种1次，每次接种前采血，测定血清的血凝抑制抗体效价，第2次免疫后即可检测到较高的血清效价。在第3次接种4周后，对全部实验犬进行攻毒，攻毒后第7天及第14天时采血，测定血清的血凝抑制抗体效价。所有接种pIRESVP1疫苗的犬均能抵抗CPV强毒的攻击，而接种空载体质粒和生理盐水的对照犬则全部发病。证明所构建的核酸疫苗（pIRESVP1）能使犬免受犬细小病毒强毒的感染。关键词：核酸疫苗；犬细小病毒；免疫犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）于1978年首次发现，是细小病毒科中的一个自律性细小病毒，病毒粒子小，无囊膜，属单链DNA病毒。CPV属猫细小病毒亚群，感染犬，在幼龄犬中引起严重的肠炎，在新生幼犬中引起心肌炎。CPV和猫泛白细胞减少症病毒（FPV）核衣壳蛋白的氨基酸序列有98%的同源性1-2，由于高度的同源性以及近年来犬病的严重流行，CPV被认为是FPV的一个新宿主变异株3。CPV核衣壳基因编码两个重叠蛋白VP1和VP2，VP2是主要的核衣壳蛋白，从VP1开放阅读框的一个框架内ATG编码子开始翻译。VP3是完整的VP2核衣壳N末端除去15个20个氨基酸形成的。VP1约占CPV核衣壳蛋白的10%，其余90%由VP2和VP3组成。表位图谱试验表明，结合中和抗体的全部抗原决定簇都在VP2中，VP1特有区域中还发现一个细胞表位4。 核酸疫苗（nucleic acid vaccines，NAVs）就是把能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，通过宿主细胞的转录系统，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。NAVs诱导体液和细胞免疫，不复制，不感染宿主，易于生产，以及在室温下稳定性好，还提高了毒株间的交叉保护且保持病毒抗原的天然形式5。这些性质使NAVs比常规疫苗和重组疫苗更具优越性，具有控制人和动物传染性疾病的潜力。核酸疫苗已实验性地用于鼠，以抗各种病毒和人的肿瘤相关抗原，如流感病毒、人类免疫缺陷病毒型、狂犬病毒、乙型肝炎病毒、牛疱疹病毒型、人癌胚抗原以及淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。 传统的灭活和致弱的活病毒（MLV）CPV疫苗含整个病毒粒子，这两种疫苗有较大的免疫原性，新一代MLV CPV疫苗克服了部分母源抗体问题，小剂量疫苗就可产生更高效的免疫6-8。其他的CPV疫苗还有利用杆状病毒表达系统的重组疫苗9和合成肽疫苗10-11，这些疫苗与佐剂一起接种犬后，可诱导抗CPV的免疫保护。但NAVs有避免应用有毒佐剂的优点，另外，重组疫苗只激发一次免疫反应，需多次接种才能获得保护，而NAVs可持续表达CPV病毒抗原，可产生比重组疫苗更好的免疫反应。合成肽疫苗局限于限制了抗原的表位，而CPV的NAVs表达天然、完整的病毒抗原蛋白，能更好地刺激免疫系统。本研究用CPV全长VP1基因构建了真核重组表达载体（pIRESVP1），该载体可诱导犬产生较高的免疫应答，使其能够抵抗强毒的攻击，现报告如下。1 材料与方法1.1 试剂、细胞株及动物限制性核酸内切酶BamH、Not及T4 DNA连接酶购自宝生物(大连)有限工程公司。pIRES载体由本实验室保存。DNA胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。大肠埃希菌JM109感受态细胞由本实验室制备。猫肾（F81）细胞、CPV毒种由本实验室保存。6只混合饲养的昆明犬为市售，CPV血凝抑制抗体效价2。1.2 引物根据文献合成一对引物，上游引物中含BamH限制位点，下游引物中含Not限制位点，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：P1 5-CGGGATCCGAGACGACTTGGATTAAGGTA-3； P2 5-GTGCGGCCGCTAGTTGATATGTAATAAAC-3。1.3 方法1.3.1 CPV DNA的制备 用从感染犬粪便中提取的CPV2b型病毒接种猫肾（F81）细胞，收集上清液，浓缩，用苯酚氯仿（11）抽提5次，乙醇沉淀DNA，溶解于10 mmol/L Tris(pH8.0)1 mmol/L EDTA溶液中，于-20 冻存。1.3.2 目的基因的PCR扩增与回收 以CPV DNA作为模板，用VP1片段引物进行PCR扩增。反应总体积为50 L，上下游引物各200 nmol/L，dNTP各50 mol/L，模板50 ng，Taq酶0.5 L,10buffer 5 L，无菌去离子水42 L。模板于95 变性5 min，PCR扩增循环如下：95 60 s,50 90 s,72 120 s循环5次，然后95 60 s,55 90 s,72 120 s再循环35次，产物在8 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳，并用胶回收试剂盒回收2.2 kb的目的基因片段。1.3.3 VP1片段的克隆和序列测定 分别用Not和BamH双酶切表达载体pIRES和回收的目的片段，经胶回收纯化后，将VP1片段与pIRES载体的回收产物用T4 DNA连接酶于16 连接过夜，转化JM109感受态细胞，涂布含50 g/mL氨苄青霉素的LB平板，37培养过夜，挑取单个菌落培养后抽提质粒并进行酶切鉴定，阳性重组质粒命名pIRESVP1。重组质粒由上海华舜生物工程有限公司进行核苷酸序列测定，并与GenBank中的VP1序列进行比较。1.3.4免疫接种 6只混合饲养的9月龄犬编号为1号6号,分别接种含200，400，600 g/mL和800 g/mL pIRESVP1和800 g pIRES的磷酸盐缓冲液（PBS，0.006 7 mol/L,pH7.2），每只犬接种1 mL PBS，所有接种分别在左、右肢股四头肌处肌肉注射。每隔8周在同样部位接种同样剂量的DNA或PBS，共接种3次，每次接种前采血样检测抗体效价。1.3.5 血凝抑制抗体检测 参照文献12方法，测定血清的血凝抑制（HI）效价。1.3.6 攻毒试验 用相同数量的CPV2、CPV2a和CPV 2b 3种强毒混合，在第3次接种4周后，对全部实验犬进行攻毒试验，剂量为1107.0 TCID50/只，每天观察犬的发病情况，7 d及14 d时采血，检测血清抗体效价。2 结果2.1 CPV VP1片段的PCR扩增、克隆及酶切鉴定用8 g/L琼脂糖凝胶电泳，扩增片段约为2.2 kb,与预期值大小一致。从平板上挑取的单个菌落，抽提质粒后用BamH和Not双酶切鉴定，用8 g/L琼脂糖凝胶电泳，酶切后得到约2.2 kb的目的片段，与预期大小相符（图1）。 1.VP1基因的PCR产物；2.重组质粒pIRESVP1；3.DNA标准 DL 15 000；4.重组质粒pIRESVP1经BamH酶切结果；5.重组质粒pIRESVP1经BamH和Not双酶切结果。 1.PCR products of VP1 gene;2.Recombinant plaSMid pIRESVP1;3.DNA Marker DL 15 000;4.Recombinant plasmid pIRESVP1 digested by BamH;5.Recombinant plasmid pIRESVP1 digested by BamH and Not图1 VP1基因的扩增及重组质粒pIRESVP1的鉴定Fig.1 Amplification by PCR of VP1 gene and identification of recombinant plaSMid pIRESVP1 2.2 VP1片段的序列测定及比较 得到的阳性质粒pIRESVP1经序列测定后，与GenBank中的VP1序列进行比较，同源性为99%。 2.3 血凝抑制抗体效价用血凝抑制试验测定了pIRESVP1免疫犬的血清效价，结果见表1。 表1 免疫及攻毒后犬血清中CPV抗体的血凝抑制效价Table 1 The HI antibody titer against CPV in pIRESVP1 immunzed and unimmunized dogs before and after challenge 1免 The first immunization 2免 The second immunization 3免 The third immunization 7天(d) 14天(d) PBS 2 2 2 128 128 800g pIRES 2 2 2 128 128 200g pIRESVP1 2 8 16 64 256 400g pIRESVP1 2 16 32 32 256 600g pIRESVP1 8 16 32 32 128 800g pIRESVP1 2 16 32 32 64 2.4 攻毒试验每天3次观察犬的精神状况、食欲、粪便、体温及呕吐情况，经pIRESVP1免疫的4只犬，无论接种剂量多少，均未表现出CPV的临床发病特征，而接种空质粒和PBS的阴性对照犬则表现出有体温升高、腹泻等CPV的临床特征。攻毒后7 d及14 d后的血清效价见表1。 3 讨论 CPV主要引起犬出血性肠炎和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高。通过接种弱毒疫苗对CPV病进行预防取得了很好的效果，CPV病基本上得到了完全的控制。近年来CPV病的重新暴发和流行，使研究者发现了CPV较快的变异和进化现象13-15，从而对现行弱毒疫苗的有效性产生了怀疑,但要研制出新的弱毒疫苗需要较长的时间，另外，弱毒疫苗的免疫效果还易受到母源抗体的干扰。而NAVs的研制需要的时间较短，可根据目前流行的毒株类型制备不同的疫苗，由于NAVs不接种活毒，不存在弱毒疫苗潜在的致