CRISPR-Cas技术.pptx

CRISPR Cas技术 CONTENTS 一 CRISPR Cas系统的简介1 CRISPR Cas系统的由来2 CRISPR Cas系统的分类3 CRISPR Cas系统的结构二 CRISPR Cas系统的作用机理1 CRISPR间隔区的获得2 crRNA的表达和成熟3 外源基因的切割三 DSB的修复四 CRISPR Cas系统的应用五 CRISPR技术的脱靶问题六 实验设计 CRISPR Cas9系统是一特殊的DNA重复序列家族 又命名为成簇的 规律间隔的 短回文 重复序列 是目前用于基因敲除 点突变 基因插入 基因修复等基因编辑方面的新方法 CRISPR Cass系统是从细菌和古生菌内发现的 它参与细菌的免疫过程 抵挡外源遗传物质的侵袭 是一种后天获得的防御系统 以往的基因编辑技术 ZFN TALEN 一次只能编辑一个基因 并且耗时耗力 CRISPR Cas9技术最大的优势就在于一次可以编辑很多个基因位点 只需设计多个不同的gRNA 它可以介导Cas9核酸酶进行多靶点基因编辑 CRISPR Cas9技术可以通过核酸之间的相互识别 防止DNA甲基化对基因编辑的干扰 编辑效率显著高于ZFN 和ALEN 且不需要反复设计核算内切酶载体 操作简单 一 CRISPR Cas系统的简介 1 CRISPR Cas系统的由来 CRISPR Cas9来源于细菌免疫系统 经过人为改造后 可在真核细胞中实现高度灵活且特异的基因组编辑 CRISPR Cas9系统是一种后天免疫防御系统 用以保护细菌或古细菌免受外来质粒或噬菌体的侵入 当病毒首次入侵时 细菌会整合病毒基因到CRISPR的间隔区 当再次入侵时 CRISPR转录相应的crRNA crRNA与病毒基因的同源序列结合 介导Cas酶切割病毒基因 从而保护自己 2CRISPR Cas系统的分类 基于CRISPR Cas基因保守型和位点构成的不同 可分为Type Type Type 三种类型 Type 和 行较为复杂 类的特征蛋白是Cas3 在细菌和古生菌中都有 类的有Cas6和Cas10两种酶 Type 系统较简单只存在与细菌 主要是Cas9酶介导降解外源基因和crRNA的成熟 CRISPR Cas系统目前广泛应用 由系统 改造而的 为第三代人工核酸内切酶 比第一代 ZFN 和第二代 TALEN 的人工核酸内切酶操作更加简单 修饰更为精确 且成本低 CRISPR Cas系统包括不连续的重复序列 Repeats 间隔序列 Spacers 间隔排列成CRISPR簇 前导序列 L 和编码Cas酶的基因 tracrRNA基因 1 2 3 CRISPR系统的结构 Repeaeas两端序列是严格保守的分别为 和 能使转录岀的RNA二级结构保持稳定 Spacers均为外源的DNA插入 前导序列可能在插入新的Spacers时起到识别作用或者作为转录CRISPR的启动子 Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶 能在guideRNA的引导下切割靶位点 Cas9具有HNH和RuvC两结构域 都可以切割DNA 其中HNH结构域切割互补的DNA链 RuvC切割非互补的DNA链 Cas9切割双链时无特异性 可作用于任何基因 1 2 CRISPR之间的间隔区转录成前体cr RNA pre crRNA 经核酸酶切割成熟 与tracrRNA结合成sgRNA sgRNA具有特异性 作用于特定的基因序列 3 实验时只需要改造CRISPR的部分序列 就可以得到针对特定基因的CRISPR Cas系统 crRNA与tracrRNA碱基互补配对结合成gRNA 此复合物能引导核酸酶Cas9蛋白切割与crRNA配对的双链DNA 二 CRISPR Cas系统的作用机理 CRISPR间隔区的获得 crRNA的表达和成熟 外源基因的切割 作用过程 1 2 3 1CRISPR间隔区的获得 噬菌体或质粒上与CRISPR Cas9系统中间隔序列对应的序列被称为protospacer PAM 一般为 当外源基因入侵时 宿主识别PAM 以PAM附近的序列作为protospacer 把protospacer整合到CRISPR基因座的5 端的两个重复序列之间 从而获得相应的间隔区 2crRNA的表达和成熟 前导区调控细菌CRISPR之间的间隔区转录为前体crRNA 反式激活crRNA tracrRNA 与pre crRNA重复序列互补介导核酸酶RnaseIII对pre crRNA进行加工处理 切割成成熟crRNA 3外源基因的切割 crRNA和tracrRNA结合成sgRNA 指导Cas9对外源基因进行切割 Cas9识别目的基因中的PAM片段 而crRNA识别 的 端互补的20bp的DNA序列片段 外源DNA 使基因组与Cas9稳定结合 从而对靶位点进行切割 基因组双链发生断裂 形成双链缺口 DSB 在真核生物中DSB DNA双链切口 可被两种不同的机体自身修复机制修复DSB 非同源性末端连接 NHEJ 和同源重组 HDR 进行修复 NHEJ能够高效地引入不同长度的插入或缺失突变 indel 产生由于移码突变而导致的基因功能受损 多用于细胞或动物模型中的基因敲除 功能基因组的筛查 转录调控和基因沉默的研究 HDR以DNA结构的同源性为基础 修复会带入特定位点的突变或在外源DNA供体模板存在下对靶点形成可预测的插入 此外还有一种微生物学介导的末端连接 这种在实验中比较少应用 除了DSB 实验时也能利用Cas9突变的 切口酶 形成单链切口 Nick 可通过同源重组 HDR 进行修复 以完整的链为模板修复缺口 三 切口的修复 基因敲出 如向受精卵中注射Cas9mRNA和sgRNA 构建gRNA Cas质粒结合非同源重组进行基因的敲除 构建sgRNA文库进行基因组筛查和药物靶点的鉴定 基因表达调控 改造成转录激活因子 转录抑制因子等调节蛋白对基因表达进行调控 如使Cas9两个活性位点突变形成dCas9 dCas9不切割DNA 而是引导抑制因子或转录因子的结合到靶位点上 从而达到抑制基因的表达或激活基因的表达 目标位置可以是启动子区域 调控区域或早期编码区域 四 CRIPR Cas9的应用 脱靶现象是基因编辑实验的资格重要问题 CRISPR Cas的脱靶受到sgRNA PAM Cas9等的影响 实验时可以通过设计优化的sgRNA 控制Cas9 sgRNA的用量 改造Cas9 选着合适的PAM系列和适中的酶浓度等方法降低脱靶率 五 CRISPR技术的脱靶问题 六 实验设计 实验思路 用CRISPR Cas9技术筛选跟肿瘤转移密切相关的基因 实验过程 以高度转移的肿瘤细胞株作为模式细胞 筛选跟肿瘤转移密切相关的基因 构建gRNA腺病毒质粒文库 用于靶基因位点的敲除 以质粒为载体 通过在线软件设计设计gRNAs文库 质粒载体中需包含有gRNA 嘌呤毒素抗性基因 对gRNA文库进行扩增 把gRNA文库合并到腺病毒中 转染细胞时 腺病毒会把质粒传递到细胞中 实验过程 构建reporter腺病毒载体 把荧光蛋白报告基因 FP 整合到腺病毒上合成报告因子 载体中需要包含有包含有Cas9和报告基因 表达形成Cas9 FP复合物 gRNA序列会将dCas9 FP融合物导向特定的基因组序列 荧光蛋白载体和gRNA载体可通过addgene网站获取 制备高度转移的肿瘤单细胞悬液 用构建好的gRNA腺病毒转染肿瘤细胞 在培养基中加入嘌呤毒素筛选出转染成功的细胞 裂解细胞提取质粒DNA 通过酶切电泳鉴定和DNA测序鉴定 实验过程 把构建好的reporter载体转染到筛选出来的肿瘤细胞中 以reporter转染空肿瘤细胞做空白对照 培养一段时间后 通过荧光显微镜观察细胞荧光表达情况 制备单细胞悬液 用流式细胞仪分选出突变的细胞并进行扩大培养 对发