豆豉组分抑制乙酰胆碱酯酶活性的研究.pdf

2 0 0 9 上海市食品学会学术年会论文集 豆豉组分抑制乙酰胆碱酯酶活性的研究 宋庆1 张资彬r 郭嫒 1 上海师范人学生命与环境科学学院上海2 0 0 2 3 4 2 上海应用技术学院香料香精技术与 T 稗学院上海2 0 0 2 3 5 摘要 本文研究单冈索实验优化豆豉t l t 乙酰胆碱酯酶 A c h E 抑制剂的提取T 艺 粗提液采用石油 醚 氯甲烷 乙酸乙酯依次萃取处理 并通过E l l m a n 法对豆豉提取物体夕l A c h E 抑制能力进fJ 测 定 结果表明 当提取时f 1 6 0r a i n 乙乔卒浓度8 0 温度7 0 C 同液比1 1 0 时 1 0m g m L 的豆豉 提取液对A c h E 的抑制率为5 2 3 3 务白 机溶剂的萃取组分在1 0m g m L 时的A c h E 抑制率分别为 石油醚组分7 5 5 2 二氯甲烷组分6 1 0 0 和乙酸乙酯组分7 0 8 4 关键词 豆豉 乙酰胆碱酯酶 E l l m a n 法 萃取 中图分类号 R 9 3 1文献标识码 A A c e t y l c h o l i n e s t e r a s eI n h i b i t o r yS c r e e n i n gF o r F a r c t i o n sO fD o u c h i S o n gQ i n g l Z h a n gY u n b i l l G u oY u a n z 1 C o l l e g eo fL i f ea n dE n v i r o n m e n tS c i e n c e s S h a n g h a iN o r m a lU n i v e r s i t y S h a n g h a i2 0 0 2 3 4 C h i n a 2 S c h o o lo fP e r f u m ea n dA r o m aT e c h n o l o g y S h a n g h a iI n s t i t u t eo fT e c h n o l o g y S h a n g h a i2 0 0 2 3 5 C h i n a A b s t r a c t T h r o u g ht h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tt oo p t i m i z a t i o nt h ea c e t y l c h o l i n e s t e r a s e A c h E i n h i b i t o r Se x t r a c t i o np r o c e s sf r o mD o u c h i T h ec r u d ee x t r a c tw a se x t r a c t e db yp e t r o l e u me t h e l m e t h y l e n ec h l o r i d ea n de t h y la c e t a t ee x t r a c ti nr u m a n du s e dt h eE l l m a n Sm e t h o dt od e t e r m i n a t i o no f A c h Ei n h i b i t o r ya b i l i t yi nv i t r o T h er e s u l ti n d i c a t e d W h e nt h ee x t r a c t i o np r o c e s si s t h ee x t r a c tt i m ei s 6 0m i n e t h a n o lc o n c e n t r a t i o ni s8 0 t e m p e r a t u r ei s7 0 1 2 t h er a t i oo fl i q u i d s o l i di s1 1 0 1 O m g m L o fD o u c h ie x t r a c t i o no ft h eA c h Ei n h i b i t i o nr a t ef o r5 2 3 3 A n de a c he x t r a c t i o ni nt h e1 0 m g m Lo ft h e A c h Ei n h i b i t i o nr a t er e s p e c t i v e l yi s p e t r o l e u me t h e rc o m p o n e n ti s7 5 5 2 m e t h y l e n ec h l o r i d e c o m p o n e n ti s6 1 0 0 a n de t h y la c e t a t ec o m p o n e n ti s 7 0 8 4 K e y w o r d s D o u c h i A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e E l l m a n Sm e t h o d E x t r a c t 前言 老年性痴呆症又称阿尔茨海默氏痫 A l z h e i m e r SD i s e a s e A D 随着人L J 老龄化速度的快速增 加 A D 病人日益增多 已经成为继心血管疾病和肿瘤之后严重威胁老年人生命健康 基金项目 上海市自然科学基金项目 0 8 C R l 4 1 8 9 0 0 作者简介 张赞彬 1 9 7 3 男 汉族 浙江台州人 教授 食品科学与工程专业 主要从事植物中活性物质 的分离提取研究 的主要疾病之一 据预测 我国在2 1 世纪 I 叶6 0 岁以上的老龄人口将达到4 亿人左右 并将成为t f t 界上老年人U 最多的国家 A D 症发病机理复杂 目前世界上较为接受的A D 病理为 胆碱能缺 失学说 该学说认为其病理与患者神经问隙q f A C h E 活性过高具有重要关系 A C h E 催化乙酰胆碱 的裂解反应 导致乙酰胆碱的缺失 直接造成神经信号传递失败 引起老年痴呆症1 2 1 应用于临 2 0 0 9 上海市食品学会学术年会论文集 床的A C h E 抑制剂大多存在半衰期短 较严重的外周日日碱能系统副作用等缺点 小利于患者长期服 用1 3 l o 豆豉作为1 1 1 园的一种传统人豆发酵食品在市 力 地区深受老百姓的喜爱 它的营养价值极高 制作及食用豆豉在我幽已有上千年历史 豆豉具自 较好的生理功能 L 三见报道的仃预防糖尿病 抗氰化 降血压 溶血栓等作用 4 1 本文探讨了从豆豉 I 提I 私 A c h E 抑制剂 为开发新颦的 适宜 患者长期服用 毒副作用小的治疗老年痴呆症的药物打下基础 l 材料与设备 1 1 材料 豆豉 购于徐汇区漕河泾菜场 产地为重庆永川 1 2 试剂 无水乙醇 石油醚 二氯甲烷 乙酸乙酯 磷酸氢 钠 磷酸二氢钠等均为分析纯 乙酰胆 碱酯酶 A c h E 硫代乙酰胆碱 A T c h 硫一硝基苯甲酸 D T N B 十二烷基硫酸钠 S D S 均购于 美 捌s i g m a 公司 1 3 仪器 D J 灵巧型粉碎机 上海淀久 I 药器械制造有限公司 7 5 4 紫外可见分光光度计 上海菁华科技 仪器仃限公刮 恒温磁力搅拌器 上海r J 乐仪器仃限公训 漩涡混合器 上海精科实业有限公叫 电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备J 出品 数显鼓风T 燥箱 上海博迅实业有限公 司医疗设备J 出品 旋转蒸发仪 上海q 旷荣生化仪器J 真空T 燥箱 上海精宏实验设备打限公 司 分析天 r 梅特勒 托利多仪器钉限公叫 冷冻真空 T 燥机 上海照生有限公司 等 2 实验方法 2 1 乙酰胆碱酯酶抑制剂的测定方法的建立 根据E l l m a n 的方法1 5 1 底物硫代乙酰胆碱 A T c h 在乙酰胆碱酯酶 A c h E 作用下分解 生成硫代 胆碱 T h i o c h o l i n e 硫代胆碱与显色齐U D T N B 迅速作用 生成在4 1 2 n m 处钶光吸收的黄色物质 在 酶催反应的稳态阶段其O D 值即可代表起始反心速率 A c e t y l t h i o c h o l i n e H 2 0 A c h e A c e t y r a t e T h i o c h o l i n e T h i o c h o l i n e 5 5 t h i o b i s 2 n i t r o b e n z o i ca c i d 一5 t h i o 2 n i t r o b e n z o i ca c i d 2 1 1A T c h 非酶水解产生的光吸收测定1 6 1 由于h i t c h 不稳定 在3 7 水浴t lA T c h 自身逐渐分解 其体的实验方法是 在试管中加入 3 0 2 0 L 的P B S 1 0 0 m Mp H8 0 3 7 颅热2r a i n 然后依次加入1 5 r a M 的D T N B 5 0 a L 1 5 r a M 的 A T c h 5 0 l t L 3 7 水浴反应不同时间 加入1 0m L 的4 S D S 终 止反应 迅速测其 4 1 2 砌的O D 值 2 1 2O D t 曲线的测定 在试管l I 加入3 0 0 0 L 的P B S 和2 0J c L 1 0U m L 的乙酰胆碱酯酶 3 7 预热2m i n 然后依次加 入1 5m M 的D T N B5 姒L 1 5m M 的A T c h 5 0 l t L 3 7 1 2 水浴反应不同时间 加入1 0 m l 的4 S D S 终止 反应 迅速测其4 1 2a m 的O D 值 2 1 3O D 酶活曲线 2 0 0 9 上海市食品学会学术年会论文集 方法同2 1 3 只是将加入酶的浓度换成0 2 0 4 0 6 0 8 和1 0U m L 反应时间确定为2 0m i n 2 1 4 提取物t I 活性物质的测定 在试管r I I 加 K 2 9 0 0 9 L 限J P B S 2 0 9 L1 0U m L 的d 酰胆碱酯嗨和1 0 0 p L1 0m g m L 豆豉提取物 3 7 C 预热2m i n 然后依次加入1 5m M 的D T N B 5 0g L 1 5 r a M 的A T c h 5 0 l L 3 7 C 水浴反I 2 2 0 m i n 加入1 0 m L 的4 S D S 终I 反应 迅速测其4 1 2 n m 的O D 值 记为A 样品 每个样品作3 个 I 衡 取 I 均值 由于豆豉提取物多有颜色 所以每次实验同时做一个木底扣除 即用2 鲰L P B S 代替乙酰玎日 碱酯酶 记为A 木底 冈豆豉提取物用1 0 乙酵济液溶解 9 l 可能乙醇溶液本身就会导致乙酰髑碱 酯酶失活 所以以1 0 乙醇代替提取物作为对照 记为A X e 照 在做空广1 对照组 即用1 0 0 f l LP B S 代替豆豉提取物 记为A 空白 抑制率的计算公式 抑制率 A 对照心样品 A 木底 A 空广1 x 1 0 0 2 2 豆豉提取液的制备 2 2 1 样品的预处理 豆豉真空 T 燥后 用粉碎机粉碎 过6 0 目筛 密封保存备用 2 2 2 豆豉不同溶剂提取液的制备 在3 个锥形瓶中分别装 k l O 0 9 冻下豆豉粉末 分别加入水 甲酡和无水乙醇1 0 0 m L 在3 0 下振荡 1 2 0 r r a i n 提取2h 将提取液于4 0 0 0r r a i n 离心2 0m i n 上清液用旋转蒸发仪浓缩成浸臂 冷冻真空 r 燥后4 保存备用 样品用1 0 0m Mp H O 的P B S 稀释全 定浓度梯度 2 2 3 豆豉 1 i 同时间提取液的制备 在8 个锥形瓶中分别装A 1 0 O g 豆豉粉末 然后分别加入无水乙酣1 0 0m L 在3 0 下分别振荡 1 2 0r r a i n 提取 1 5 3 0 4 5 6 0 1 2 0 和2 4 0m i n 后处理同2 1 2 2 2 4 豆豉小同固液比提取液的制备 在4 个锥形瓶巾分别装 K 1 0 o g 豆豉粉末 分别加入无水L 酩5 0 1 0 0 1 5 0 和2 0 0 m E 在3 0 C 下 振荡 1 2 0r m i n 提取6 0 r a i n 后处理同2 1 2 2 2 5 豆豉小同乙醇浓度提取液的制各 在4 个锥形瓶中分别装入1 0 0g 豆豉粉末 然后分别加入4 0 6 0 8 0 和1 0 0 体积比 的乙 醇水溶液1 0 0m L 后处理同2 1 2 2 2 6 豆豉小同温度提取液的制备 在5 个锥形瓶t 1 分别装入1 0 0g 豆豉粉末 然后分别加入8 0 的乙醇水溶液1 0 0n i L 分别在 3 0 5 0 7 0 和9 0 的温度下提取6 0r a i n 后处理同2 1 2 2 2 7 豆豉粗提液的萃取处理 称取豆豉粉末1 0 0 0g 按照优化的提取工艺制备粗提液 将粗提液减压浓缩 得到的浸膏依 次用石油醚 1 0 0 x 3 二氯甲烷 1 0 0 x 3 乙酸乙酯 1 0 0 3 分别萃I R 3 次 合并各提取液 将各提取 液用旋转蒸发仪浓缩成浸膏后冷冻真空 T 燥至粉末 然后用1 0 乙醇将各组分稀释成1 0m g m l 溶 液 按照2 1 4 测定各萃取组分对乙酰胆碱酯酶的抑制率 2 0 0 9 上海市食品学会学术年会论文集 3 结果与分析 3 1 乙酰胆碱酯酶抑制剂测定方法的建立 3 1 1A T c h 非酶水解产生的光吸收曲线 实验结祟A T c h 本身不稳定 A T c h 溶液在配制过程I I 已备少黾分解 在水浴t 随时间延长而逐 渐分解 在所测时问范围内成线性关系 且分解最一i 可忽略 在以后的实验 l 必须考虑A T c h 的非 酶水解 阜 O 4 5 O 4 O 3 5 O 3 趔0 2 5 白 oo 2 O 1 5 0 1 O 0 5 0 02 4 681 01 2 1 4 1 6 1 82 02 22 42 62 83 0 I t I N r a i n 图lA T c h 非酶水解产生的光吸收 时间曲线 F i g 1C u r v eo f A T c hg e n e r a t e dO D t i m eb yn o n e n z y m a t i ch y d r o l y s i s 3 1 2O D t 曲线 实验结果表明 在2 0m i n P 勺可保持较好的线性关系 反J 啦处于稳定状态阶段 确定实验的反 应时问为2 0m i n 1 8 1 6 i 4 1 2 葛1 凸 o0 8 o 6 o 4 0 2 0 0246 R 1 01 21 41 61 8 舶2 2 2 4 2 6勰 3 2 时间 m h 图2O D t 曲线 F i g 2C u r v eo fO D t i m e 3 1 3O D 酶活曲线 实验表明 在酶浓度为0 2U m 1 1 0U m l 时 O D 值与酶浓度旱现较好的线性关系 线性方程 式 A o 5 3 5 4 C 式中 C 一乙酰胆碱酯酶的浓度 U m L 直接的反映酶浓度同O D 值的正比例关系 证明了在这个范闸内可以用O D 值表示酶活 2 0 0 9 上海市食品学会学术年会论文集 0 6 r 0 5 0 4 善瞄 0 2 0 I f 0 O0 20 40 60 8 厶酰胆碱睹酶浓度 U m L 图3 0 D 酶活曲线 F i g 3C u r v eo fO D e n z y m ea c t i v i t y 3 2 提取条件的优化 3 2 1 彳i 同溶剂的豆豉提取液对A c h E 的抑制率 表I 不同溶剂的豆豉提取液对A c h E 的抑制率 1 0 0i n g m L 旦竺 垦墅 竺 垒 兰 翌 i 坠 塑1 21 苎堑2 1 垫 2 2 竺业i 垒Z 壁 丝竺2 11 2 翌 兰 翌璺 竺生竺型竺兰 提取溶刺抑制率 水 甲醇 无水乙醇 1 0 9 9 8 2 2 2 9 1 6 l 结果表明 用甲醉和乙醇作为豆豉的提取溶剂 提取液浓度在1 0 0m g m L 时对A c h E 的抑制率 很高 丽水提液对A c h E 的抑制率很低 可以粗略的判断提取液 I 有效成分为弱极性或者非极性物 质 冈此选择乙醇作为提取溶剂 3 2 2 小同时问的豆豉提取液对A c h E 抑制率的影响 实验表明 在6 0r a i n 前 提取物I I l 乙酰胆碱酯酶抑制物的龠帚随着提取时间的延长逐步增加 6 0m i n 后 提取物对A c h E 抑制率逐渐下降 可能足随着提取时间增加 提取液巾非A c h E 抑制成分 的含幂增多 导致提取物浓度在1 0m U m L 时的有效成分相对含晕降低 综合考虑 确定最佳提取 时间为6 0r a i n 毋 一 簪 蚕 晕 03 06 09 01 2 01 5 01 8 02 1 0 2 4 0 提取时间 m i n 图4 不同时间的豆豉提取液对A c h e 抑制率的影响 1 0m g m L F i g 4 E f f e c to f A c h Ei n h i b i t i o nr a t i o sf o rD o u c h ib yd i f f e r e n te x t r a c tt i m e 1 mm g m L 3 2 3 不同同液比的豆豉提取液对A c h e 抑制率的影响 2 0 0 9 上海市食品学会学术年会论文集 实验表明 在同液比人于1 1 0 时 豆豉提取液对A c h e 抑制率基本保持4 i 变 考虑到提取操 作的经济性 确定周液比为l 1 0 时可以自 效的提取豆豉J J l 行效活性物质 5 0 一I 4 5 4 0 释3 5P 妊 露3 0 2 5 2 0 l 0 51 1 0l 1 5l 2 0 料液比 图5 不同固液比的豆豉提取液对A c h E 抑制率的影响 1 0m g m L F i g 5 E f f e c to f A c h Ei n h i b i t i o nr a t i o sf o rD o u c h ib yd i f f e r e n tr a t i oo fs o l i d l i q u i d 1 0m g m L 3 2 3 小同乙醇浓度的豆豉提取液对A c h E 抑制率的影响 实验表明 随着乙醇浓度的变化 提取液对A c h E 抑制率变化自 一个先上升后下降的趋势 在 乙醇浓嫂为8 0 时 豆豉提取液对A c h E 抑制率最高 乙醇水溶液作为提取溶剂 其 I l 准的存在 能帮助渗透豆豉组织 提高渗透性 史易于仃效成分济于溶剂体系I I I 从而游离到胞外 8 0 的 乙醇水溶液对豆豉 IJ A c h E 抑制成分的提取效果较好 6 0 5 0 主4 0 龉3 0 耄2 0 l O O 2 04 06 08 01 0 01 2 0 乙醇浓度 图6 不同乙醇浓度的豆豉提取液对A c h E 抑制率的影响 1 0m g m L F i g 6E f f e c to f A c h Ei n h i b i t i o nr a t i o sf o rD o u c h ib yd i f f e r e n te t h a n o lc o n c e n t r a t i o n 1 詹m g m L 3 2 44 i 同温度下的豆豉提取液对A c h e 抑制率的影响 实验表明 在随着温度升高 豆豉提取液对乙酰胆碱酯酶抑制剂的浓度逐渐增加 说明豆豉 l 的A c h e 抑制成分热稳定性较好 冈此确定提取最适温度为7 0 C 2 0 0 9 上海市食品学会学术年会论文集 6 0 5 0 4 0 璧3 0 壬罟 写2 0 1 0 0 一一一J L 一 2 0 3 04 05 06 07 08 0 温度 图7 不同温度下的豆豉提取液对A c h E 抑制率的影响 1 0m m L F i g 7 E f f e c to f A c h Ei n h i b i t i o nr a t i o sf r o mD o u c h ib yd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e 1 om g m L 以上实验结果表明 通过对提取溶剂 提取时间 同液比 乙醇浓度 提取温度等单冈素实 验 确定提取丁艺为 浸提时间为6 0 m i n 同液比为1 1 0 乙孵浓度为8 0 温度为7 0 该提取 丁岂史易于豆豉r l I A c h E 抑制成分的提取率 在该r T 艺条件下 浓度为1 0 m g m L 的豆豉提取液对 A c h E 抑制率为5 2 3 3 3 2 5 并行机溶剂萃取组分对A c h E 的抑制率 表2 各有机溶剂萃取组分对A c h E 的抑制率 1 0 m g m L 垒 竺 垒 塾量 旦坐垒坚 竺竺 i 2 11 垒 垒竺壁 坚坐 兰 翌 i 2 竺 竺型竺三 萃取组分石油醚绀分二氯甲烷组分乙酸乙酯组分 抑制率 7 5 5 26 1 0 0 7 0 8 4 实验结果表明 提取液 I 仃效成分主要为非极性和弱极性物质 石汕醚组分多为脂溶性成分 已有的文献报道衷 f l i T 脂肪酸 甘油酯 长链烃类化合物 极性小 含氧取代低的帖类 i i j 体 生物碱等是石油醚的主要组成成分 并且已有多种生物碱类被报道具自 A c h E 抑制活力 二氯甲烷 和乙酸乙酯组分巾可能还含有对A c h e 行抑制活力的其他成分 三种萃取组分对A c h E 的抑制率都较 强 具体的化学成分还有待进一步分析 这为开发新的A c h E 抑制剂提供了新的来源 4 结论 1 A c h E 浓度同O D 值成正比例关系 即可用O D 值表示酶活 2 用不同溶剂 水 甲醇 乙醇 提取豆豉 乙醇提取物对A c h e 的抑制率最高 3 提取时间 固液比 乙醇浓度 提取温度对豆豉q l A c h E 抑制成分的提取都存在影响 在 提取T 艺为 浸提时间为6 0m i n 固液比为l 1 0 乙醇浓度为8 0 温度为7 0 C 浓度为1 0m g m L 的豆豉提取液对A c h E 抑制率最高为5 2 3 3 4 石油醚 二氯甲烷 乙酸乙酯组分对A c h E 抑制率都较强 分别为 7 5 5 2 6 1 0 0 7 0 8 4 2 0 0 9 上海市食品学会学术年会论文集 参考文献 1 陈科茂 乙酰胆碱酯酶抑制剂药物 激活 老年痴呆疵市场 一l t 凼医药情报 2 0 0 4 1 0 6 4 8 2 李前 朱振霞 孙曼霁 乙酰胆碱酯酶与老年性痴呆关系的研究进展 l 困老年学杂志 2 0 0 2 2 2 4 3 2 5 3 2 6 3 B e r n dI b a c h E k k e h a r dH a e n A c e t y l c h o l i n e s t e r a s eI n h i b i t i o ni nA l z h e i m e r sD i s e a s e C u r r e n t P h a r m a c e u t i c a lD e s i g n 2 0 0 4 1 0 2 3 1 2 5 1 4 范俊峰 李里特 张艳艳 陈湘宁 传统人豆发酵食品的生理功能 t l 园老年学杂志 2 0 0 5 1 2 0 1 2 0 7 5 E l l m a nGL C o u r t n e yKD A n d r e sVJ r e ta 1 An e wa n dr a p i dc o l o r i m e t r i cd e t e r m i n a t i o no f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s ea c t i v i t y B i o c h e mP h a r m a c o l 1 9 6 1 7 8 8 9 5 6 张翼 冯妍 李晓明 王斌贵 海藻组分抑制乙酰胆碱酯酶活性研究 海洋与湖沼 2 0 0 5 5 3 6 4 5 9 4 6 3 7 1F a u l k n e rDJ M a r i n en a t u r a lp r o d u c t s N a t u r a lP r o d u c tR e p o r t s 2 0 0 1 1 8 1 1 4 9 豆豉组分抑制乙酰胆碱酯酶活性的研究豆豉组分抑制乙酰胆碱酯酶活性的研究 作者 宋庆 张赟彬 郭媛 作者单位 宋庆 上海师范大学 生命与环境科学学院 上海 200234 张赟彬 郭媛 上海应用技术学院 香料香精技术与工程学院 上海 200235 相似文献 2条 相似文献 2条 1 学位论文 邹磊 豆豉抗氧化及乙酰胆碱酯酶抑制能力的体外实验研究 2006 近些年 科研人员已经意识到食品中含有的活性物质可以调节人体生理功能 一些食物也被报道具有某些功能性 本论文通过体外实验鉴定中国传 统大豆发酵食品 豆豉的抗氧化功能性和抗老年痴呆功能性 并且研究了豆豉加工工艺对两种功能性的影响 为自由基损害的营养干预和食物中抗氧化 物质的开发利用提供理论依据 开发豆豉的抗老年痴呆功能 主要结论如下 1 豆豉80 乙醇提取物和水提取