烟草愈伤组织诱导与器官分化.doc

烟草愈伤组织诱导与植株再生房雪菲（2008304201229）, 周荣华（2008304201208）(生技0802)摘要细胞全能性学说认为，植物的细胞具有发育为胚胎和植株的潜能。换句话说，细胞全能性是指植物细胞具有全套遗传信息，不论是性细胞还是体细胞，在特定环境下仍能进行表达，而产生一个独立完整的个体。因此我们把细胞全能性学说看作是细胞工程的理论基础1 。本实验以烟草为实验材料，采用组织培养的方法，在添加BA和NAA各2.0mg/L的MS培养基上诱导小块的烟草叶片愈伤组织的发生， 2周后，将愈伤组织转到MS + BA 2.0 mg/ L+ NAA 0.5mg/ L培养基中光照培养,三周后，观察到幼芽的形成。关键词：烟草；愈伤组织；全能性Tobacco callus induction and plant regenerationAbstractIn cell totipotency，cells of plant have the potential to develop into embryos and plantsIn other words，cell totipotency refers to plant cells have its whole genetic information ，neither gengmtive cell norsomatoplasm，in given conditions，can express and grow into all intact plantSo plant cell totipotency is the fundanlental basis for cell engineeringIn this experiment,we take tobacco as experimental material. Using tissue culture methods,that induce the occurence of tobacco leaves callus in the MS medium with BA(2mg/L)and NAA(2mg/L).Two weeks later,we transfer the callus to the new MS medium with BA(2mg/L)and NAA(0.5mg/L).Useing light training.three weeks later ,bud formation was observed.Key words: tobacco callus totipotency 1前言植物组织培养是本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项技术。它是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根茎叶花果实等），组织（形成层花药组织胚乳皮层等），细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整植株，统称为植物组织培养。该技术以德国著名的植物学家G.Haberlandt提出的全能性学说为基础，即作为高等植物器官和组织基本单位的细胞，有可能在离体条件下实现分裂和分化，乃至形成胚胎和植株 5 。30年代，美国植物生理学家White用番茄根组织离体培养获得成功，建立了活跃的无性繁殖系，并能进行继代培养。Gautheret和Nobecourt用胡萝卜根组织离体培养，经过脱分化产生了大量的愈伤组织，并再分裂形成完整的植株。50年代末，Steward等和Reinert几乎同时在胡萝卜根组织单细胞悬浮培养中发现某些体细胞在形态上转变为合子胚相似的结构，其发育过程也与合子胚类似，但由于它是由体细胞分化而来的，因而称为体细胞胚，这一重大的突破更进一步验证了细胞的全能性 1。随后，关于植物全能性的学说在各类的植物中不断得到验证，植物通过体细胞胚胎发生途径形成再生植株已是及其普遍的现象 6。烟草 (Nicotiana)原产于南美洲和澳大利亚，是植物组织培养的四大典型实验植物（烟草、矮牵牛、胡萝卜、芸苔）之一，也是一种重要的经济作物，在国民经济发展中起着重要的作用。从50年代初Skoog 和崔澄等以烟草离体根、茎、叶等进行培养开始，烟草的体外培养研究已有50多年的历史 7。 目前，通过烟草的花药培养7，原生质体培养8，以及烟草叶组织培养9已经成功获得烟草的体外再生植株。本实验以烟草叶片作为外植体，通过对其进行诱导培养，通过实验发现，光照可以使愈伤组织能够被更好的诱导；而不同来源（光照或黑暗）的愈伤组织对其的器官分化没有明显的影响。材料与方法材料材料 烟草无菌植株试剂 MS培养基成分物质 (第三版 第80页 谢从华) BA NAA 琼脂粉 蔗糖方法愈伤组织诱导培养基制备与灭菌在1L 烧杯中加入各MS培养基成分物质，再加入 0.5mgL-1的BA 8mL（终浓度2mg/L），0.5mgL-1的NAA 8mL（终浓度2mg/L），然后加入实际配制培养基体积（500ml）约2/3-3/4的蒸馏水(约400ml)，后加入10g蔗糖，充分搅拌使其溶化，用0.5 N的NaOH和0.5N的HCl调整pH至6.0。加入4g琼脂，将烧杯置于电炉上，搅拌加热使琼脂完全溶化，然后用蒸馏水定容至终体积500ml，混合均匀后分装于25ml三角瓶中。分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121，压力1.1kg/cm2，灭菌时间20min。灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。（分化培养基的成分与准备相同，但NAA 终浓度改变为0.5mg/L）烟草叶片愈伤组织诱导 取一无菌培养皿，然后用解剖刀切取1-2片无菌烟草苗叶片置于无菌培养皿中，并用锋利解剖刀将叶片切成5mm2左右/小片，然后将其接种于准备好的培养基上，每瓶诱导培养基接种5片小片，共接种12瓶。接种后的三角瓶快速封好瓶口，6瓶放于黑暗培养，6瓶放于光照培养。培养条件：（1） 黑暗培养 ：25+/-1 ，全黑暗；（2） 光照培养 ：25+/-1 ，每天连续光照16小时。三周后记录分析结果。不同来源烟草叶片愈伤组织的分化诱导将经上面方法诱导的愈伤组织，切成5mm2/块，按培养条件分别转入分化培养基上，每瓶分化培养基接种5块，共接种12瓶。接种后的三角瓶快速封好瓶口，全部光照培养。培养条件： 2022 条件下 连续光照培养。三周后记录分析结果。结果与分析愈伤组织诱导结果愈伤组织诱导结果统计培养三周后，对诱导的愈伤组织的诱导率、生长状态及污染率进行记录。结果如：表1。（+：非常绿、结构紧密； +：较绿、结构较密； +：黄绿、结构较疏松； +：灰黄、结构疏松） 表1：愈伤组织诱导培养结果统计编号培养条件每瓶接种数愈伤组织诱导率愈伤组织状态污染率1光5100%+02光5100%+03光5100%+04光5100%+05光5100%+06光5100%+07暗5100%+08暗5100%+09暗5100%+010暗5100%+011暗50100%12暗50100%A、 B、 图1：愈伤组织诱导结果。（A：每天光照16小时条件下诱导培养的愈伤组织 ； B：全黑暗诱导培养的愈伤组织）愈伤组织的诱导培养的结果分析：从表型观察（图1）和统计结果（表1）可知，光照对愈伤组织的诱导有非常显著地影响：在每天16小时光照条件下诱导生长的愈伤组织生长状态很好，颜色鲜绿，愈伤结构紧密；而全黑暗诱导生长的愈伤组织生长状态较差，颜色淡黄，愈伤结构松、脆。通过“+”的个数将所诱导的愈伤组织的状态数值化（污染的愈伤组织不列入计算范围，另外，通过随机删除数据的方式，使光照、黑暗条件下诱导培养的无污染的愈伤组织的瓶数相同）。例如：编号：134578910愈伤状态：44443322用SAS软件进行方差分析有：P=0.01380.05 ，没有明显差异；生长状态 P=0.39100.05 ，没有明显差异；分化能力 P=0.11640.05 ，没有明显差异。 （ 芽分化率：以每瓶中分化出芽的愈伤组织块/总愈伤组织块衡量 ； 生长状态：以芽生长的大小衡量 ； 分化能力：以没块愈伤组织分化出芽的个数衡量 ）从统计分析结果可知，不同来源（光照或黑暗）的愈伤组织对器官分化没影响。讨论 前人已经对不同植物的愈伤组织的诱导条件及分化进行了广泛深入的探究。如潘宇等以MS为基本培养基，通过添加不同浓度的生长素、细胞分裂素或两者组合，以及添加Vc或活性炭（共350中组合），研究中华芦荟愈伤组织的诱导及生长情况10；范国强等研究了不同种泡桐叶片愈伤组织诱导及其再生植株的培养条件11；那日等以花棒的芽尖和下胚轴为外植体，对经高压电晕电场处理后的幼胚进行了愈伤组织诱导和分化的研究12；杨春等生长素和细胞分裂素在马铃薯愈伤组织分化中的作用13.本实验以无菌烟草幼苗为研究对象，探讨了不同光照对其愈伤组织诱导的影响，及不同来源（光照与黑暗 ）愈伤组织对芽分化的影响。分析我们的结果发现：（1）从所诱导的愈伤组织的状态评价光照条件与黑暗条件对愈伤组织诱导的影响。光照条件下诱导的愈伤组织生长状态非常好，颜色鲜绿、结构紧密，这可能是因为光照利于外植体的细胞建立极性的原因 。说明光照有可能会改变愈伤组织细胞的生长素的比例，从而使植株经过一段很短的愈伤组织生长阶段后 ， 直接进入器官分化阶段。所以，虽然光照有利于愈伤组织的诱导与生长，如果是只想得到愈伤组织，而不想得到分化器官的话，光照成为了不利因素； （2）从芽分化率、生长状态、分化能力三方面评价不同来源（光照与黑暗 ）的愈伤组织对器官分化的影响。三方面的分析都表明，不同来源（光照与黑暗 ）的愈伤组织对器官分化没有显著地影响。对于其中的具体分子机制，还有待进一步的探究。参考文献：1赵世萍.蝴蝶兰组织培养过程中特异蛋白表达差异的研究,蚕业科学 20062曹孜义，刘国民实用植物组织培养技术教程M,甘肃科学技术出版社，19963朱至清，植物细胞工程M，化学工业出版社，20034颜昌敬，植物组织培养手册M,上海科学出版社5谢从华，柳俊. 植物细胞工程M，北京高等教育出版社，20046 邢更生，植物体细胞胚发生的分子基础，遗传，19917邵宏波，初立业.烟草组织培养研究的进展(上)，国外科技