临床免疫学抗原抗体反应.doc

第二章抗原抗体反应本章考点1.概述2.抗原抗体反应原理3.抗原抗体反应的特点4.抗原抗体反应的影响因素5.抗原抗体反应的类型 第一节抗原抗体反应原理抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇（表位）和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性。这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的。除两者分子构型高度互补外，抗原表位和抗体超变区必须密切接触，才有足够的结合力。 抗原抗体反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应；第二阶段为可见反应阶段，这一阶段抗原抗体复合物在适当温度、pH、电解质和补体影响下，出现沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合介导的肉眼可见的反应，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。在血清学反应中，以上两阶段往往不能严格分开，往往受反应条件（如温度、pH、电解质、抗原抗体比例等）的影响。 （一）抗原抗体结合力 抗原抗体是一种非共价的结合，不形成共价键，需要四种分子间引力参与。 1.静电引力：又称库伦引力。是因抗原、抗体带有相反电荷的氨基与羧基基团间相互吸引的能力，这种吸引力的大小和两个电荷间的距离平方成反比。两个电荷距离越近，静电引力越大； 2.范德华引力：这是原子与原子、分子与分子相互接近时分子极化作用发生的一种吸引力，是抗原、抗体两个大分子外层轨道上电子相互作用时，两者电子云中的偶极摆动而产生的引力。这种引力的能量小于静电引力； 3.氢键结合力：是供氢体上的氢原子与受氢体上氢原子间的引力。其结合力较强于范德华引力； 4.疏水作用力：水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向聚集的力。当抗原表位和抗体超变区靠近时，相互间正负极性消失，周围亲水层也立即失去，从而排斥两者间的水分子，使抗原抗体进一步吸引和结合。疏水作用力是这些结合力中最强的，因而对维系抗原抗体结合作用最大。 图10 抗原与抗体的结合力（二）抗原抗体的亲和性和亲和力亲和性指抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在的引力，它是抗原抗体间固有的结合力。亲和性用平衡常数K来表示，K值越大，亲和性越高，与抗原结合也越牢固。 抗体的亲和力指抗体结合部位与抗原表位间结合的强度，与抗体结合价相关，所谓多价优势，抗体亲和力高，与抗原结合牢固，不易解离。 （三）亲水胶体转化为疏水胶体抗体是球蛋白，大多数抗原亦为蛋白质，它们溶解在水中皆为胶体溶液，不会发生自然沉淀。亲水胶体形成机制是因蛋白质含有大量的氨基和羧基残基，这些残基在溶液中带有电荷，由于静电作用，在蛋白质分子周围出现了带相反电荷的电子云。如果溶液pH偏高，蛋白质分子带负电荷，周围出现极化的水分子，形成水化层，而当抗原抗体的结合，使表面电荷减少或消失，电子云也消失，水化层变薄，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。此时，如再加入电解质，如NaCl，则进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。 图11 抗原抗体结合时胶体状态的变化习题15 抗原的特异性取决于抗原（）A.分子量大小B.化学结构C.决定簇的性质、数目和空间构型D.表位的数目E.结构的复杂性答疑编号500734020101正确答案C习题16 关于抗原抗体第一阶段反应的叙述,错误的是（）A.属于特异性结合B.几秒至几分钟内完成C.可用散射比浊测定反应结果D.出现肉眼可见的沉淀线或沉淀环E.肉眼见不到免疫复合物答疑编号500734020102正确答案D 第二节抗原抗体反应特点1.特异性：抗原抗体结合的特异性是指抗原表位与抗体超变区结合的特异性。是由两者在化学结构和空间构型上呈互补关系所决定的。抗原与抗体的结合高度的特异性，是应用于临床诊断的基础，但多数天然抗原具有不只一种抗原决定簇，与另一物质可能有共同抗原，对检验结果产生交叉反应，但这交叉反应仍是抗原抗体特异性结合，对临床诊断可能产生干扰，不过有时也将这种交叉反应用于临床诊断，如外-斐试验。 2.比例性：在抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。只有当抗原抗体分子比例合适时抗原抗体充分结合，沉淀物形成快而多，称为抗原抗体反应的等价带；若抗原或抗体极度过剩则无沉淀形成，称为带现象，抗体过量时，称为前带，抗原过剩时，称为后带。 图12 抗原抗体反应中的带现象3.可逆性：可逆性指抗原抗体结合后形成的复合物在一定条件下可发生解离，恢复抗原抗体的游离状态。抗原抗体结合是分子表面的结合，犹如酶与底物的结合，是一种非共价键结合，结合虽稳定但可逆；抗原抗体的结合是一种动态平衡过程，抗原抗体复合物的解离取决于抗体对相应抗原的亲和力及反应条件（如离子强度、pH等）。免疫学技术中的亲和层析法就是利用这个原理来纯化抗原或抗体。 习题17 抗原抗体比例不合适出现的无沉淀现象称为A.等价带B.带现象C.前带D.后带E.中带答疑编号500734020103正确答案B习题18 不同抗原与抗体结合发生交叉反应的原因是A.抗原抗体比例不合适B.抗体分子量较大C.抗原和抗体大小相近D.抗体为多聚体E.不同抗原具有相同或相似的抗原决定簇答疑编号500734020104正确答案E第三节影响抗原抗体反应的因素（一）反应物自身的因素1.抗体：不同来源的抗体，反应性各有差异，抗体的浓度、特异性和亲和力都影响抗体抗原反应，为提高试验的可靠性，应选择高特异性、高亲和力的抗体作诊断试剂。等价带的宽窄也影响抗原抗体复合物的形成，单克隆抗体不适用于沉淀反应。 2.抗原：抗原的理化性状、分子量、抗原决定簇的种类及数目均可影响反应结果。颗粒性抗原出现凝集反应，可溶性抗原出现沉淀反应，单价抗原与相应抗体结合不出现沉淀现象。 （二）反应环境条件1.电解质：抗原与抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。为了促成沉淀物或凝集物的形成，常用0.85%NaCl或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液。2.酸碱度：抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行。蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在pH69进行，有补体参与的反应pH为7.27.4，pH过高或过低都将影响抗原与抗体反应。 3.温度：在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。一般为1540，常用的抗原抗体反应温度为37，温度如高于56，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏。每种试验都有其独特的最适反应温度要求。此外，适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。 第四节抗原抗体反应基本类型目前临床应用的主要有沉淀反应、凝集反应、补体参与反应、中和反应、标记免疫的抗原抗体反应。抗原抗体反应基本类型如下表。 第三章免疫原和抗血清制备本章考点1.免疫原制备2.抗血清制备3.抗体的纯化和鉴定 第一节免疫原的制备 免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 一、颗粒性抗原的制备颗粒性抗原如各种细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可； 细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。有的需经特殊处理，如鞭毛抗原需用0.3%0.5%甲醛处理；菌体抗原加温10022.5h去除鞭毛抗原；毒素抗原则在杀菌后再加0.5%l.0%氯化钙溶液等。 颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂作皮内注射。 二、可溶性抗原制备蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原，免疫前常需纯化。 （一）组织和细胞抗原的制备 1.组织和细胞抗原的制备：通常需要先将来源于人和动物的组织和细胞破碎，再经一定的方法纯化，才能获得所需的抗原。细胞破碎方法有： （1）高速组织捣碎机法； （2）研磨法（可用组织匀浆器或乳钵） 组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。 2.组织细胞或培养细胞可溶性抗原制备：除上述机械捣碎获取外，尚有酶处理法，常用胃蛋白酶或胰酶，可获得游离的单个细胞。 细胞抗原分膜蛋白抗原、细胞质抗原（主要为细胞器）、细胞核与核膜抗原，制备这些抗原前均需将细胞破碎，方法有： （1）反复冻融法：一般-20反复冻融。 （2）超声破碎法：利用超声波机械振动原理使细胞破碎。 （3）自溶法：利用组织、细菌自身酶系统使之裂解。 （4）酶处理法：常用溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等使细菌或组织裂解。 （5）表面活性剂处理法：常用十二烷基硫酸钠等表面活性剂处理。 （二）超速离心分离法 用于分离亚细胞成分和蛋白质，是进一步纯化的第一次过筛。可分下列方法： 1.差速离心法：低速离心高速离心交替进行，分离大小差异的抗原颗粒； 2.梯度密度离心法：是一种区带分离法，通过梯度密度离心，使各类分子量的颗粒得以分离，也可以采用梯度柱的形式分离。 超速离心分离或梯度密度离心仅适用于少数大分子抗原及一些比重较轻的抗原，而不适用于大多数中、小分子抗原。 （三）选择沉淀法 选择沉淀法是采用各种沉淀剂或某些条件使抗原成分沉淀的方法。 1.核酸去除法：可采用氯化锰、硫酸鱼精蛋白等核酸提取沉淀剂，而核糖核酸降解法更简便（采用DNA或RNA酶）； 2.盐析沉淀法：常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩； 3.有机溶剂沉淀法：常采用乙醇或丙酮； 4.水溶性非离子型聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物为分子量为20006000的聚乙二醇（PEG）。 （四）凝胶过滤法 又称分子筛层析。通过凝胶分子筛作用，可将大、中、小三类分子分开，选择凝胶柱时应注意选用适于分离范围内的凝胶。 （五）离子交换层析法 离子交换层析是利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。常用的离子交换剂有： 1.具有离子交换基团的纤维素。 2.具有离子交换基团的交联葡萄糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺。 3.被覆以离子化物质的细粉。 4.凝胶合成的高度交联树脂。 （六）亲和层析法 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体、DNA和RNA等之间有特殊亲和力，一定条件下，两者可紧密结合成复合物，如将复合物的一方固定于固相载体上，则可从溶液中分离和提纯另一方。 1.亲和层析支持物的选择：常用的有琼脂糖珠（sepharose2B、4B、6B）、琼脂糖、聚丙乙烯酰胺、多孔玻璃球等。 2.配体的选择：配体指具有亲和力的双方，或与受体特异性结合的结构物，作为免疫亲和层析则为抗原和抗体的同义语。良好配体必须具备抗原和抗体单一特异性；抗原和抗体间有较强亲和力；配体有一适宜的化学基团。 3.抗原或抗体与支持物的结合：结合的方法很多，可归纳为载体结合法、物理吸附法、交联法、网络法。 （七）免疫球蛋白片段的制备五种免疫球蛋白都具抗原性、皆可提取及纯化，但如分解成片段（如Fab片段、Fc片段、轻链片段等）作为免疫原可制备出分辨力更高的特异性抗血清。制备方法有： 1.温和条件下离析亚单位。如改变pH；用盐酸胍或脲等强变性剂将亚单位分开； 2.用还原法或氧化法解离二硫键； 3.溴化氰裂解法。用溴化氰裂解蛋白质肽链； 4.酶裂解法。如木瓜酶可将IgG裂解成2个Fab片段及1个Fc片段；胃蛋白酶可将IgG裂解成F（ab）2片段及数个小片段；胰蛋白酶可将IgG切成不规则的肽链。 （八）纯化抗原的鉴定主要对纯化抗原的含量、理化性质、纯度及免疫活性进行鉴定，常用方法有酚试剂法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、免疫电泳法、免疫双扩散法等，实际工作中常几种方法联用作纯度鉴定。 三、半抗原性免疫原的制备半抗原：某物质在独立存在时只具有反应原性而无免疫原性，这些物质称为半抗原。如一些分子量小于4000的有机物质，如多肽、大多数的多糖、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些小分子量的药物等。 半抗原与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性。 （一）载体的选择1.蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白、牛甲状腺球蛋白等。以牛血清白蛋白最常用。蛋白质与半抗原结合基于游离氨基、羧基、酚基、巯基、吲哚基、咪唑基、胍基等活性基团的缩合。 2.多肽类聚合物：常用多聚赖氨酸，分子量达十几万至几十万，与半抗原结合后可诱发动物产生高亲和力及高滴度的抗血清。 3.大分子聚合物和某些颗粒：聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、羧甲基纤维素等皆常用。 （二）半抗原-载体联接方法 1.碳二亚胺法。 2.戊二醛法。 3.氯甲酸异丁酯法。 一般认为应连接20个以上半抗原才能使动物有效产生抗体。 第二节免疫佐剂 与抗原同时或预先注射于机体能增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的辅助物质称为免疫佐剂。（一）佐剂种类 1.具备免疫原性的佐剂：如卡介苗、枯草分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、脂多糖、细胞因子等。2.不具备免疫原性的佐剂：如氢氧化铝佐剂、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、多聚核苷酸、胞壁肽等。应用最多的是福氏佐剂、细胞因子佐剂。 （1）福氏佐剂：分完全福氏佐剂（石蜡油+羊毛脂+卡介苗）、不完全福氏佐剂（石蜡油+羊毛脂）两种。福氏完全佐剂可提高佐剂效能，但注射后易产生局部持久性溃疡和肉芽肿，宜注意。（2）细胞因子佐剂：细胞因子佐剂与抗原合用，可有效激发机体的免疫功能。IL-2、IL-1、IFN、IL-12、GM-CSF皆较常应用；细胞因子佐剂还被广泛应用于肿瘤基因治疗中。（二）免疫佐剂的作用应用佐剂的目的是为了增强抗原对机体的免疫原性，从而提高体液免疫应答和细胞免疫应答水平。1.增强免疫原性。2.增加抗体的滴度。3.引起或增强迟发型超敏反应。（三）佐剂增强免疫应答的机制1.改变抗原物理性状，使抗原在体内缓慢释放，延长抗原与免疫细胞作用时间。2.抗原在佐剂的辅佐作用下，更易被巨噬细胞吞噬和有效加工处理及呈递。3.刺激单核巨噬细胞活化，释放细胞因子调节和增强淋巴细胞免疫应答能力。4.刺激淋巴细胞增生、分化，从而增强和扩大免疫应答能力。第三节抗血清的制备抗血清指含有抗体的血清。传统的抗血清制备方法是将某种抗原通过多次注入动物，数十天后或数月后，采集动物血，立即分离出血清。此抗血清在保存或应用前必须作效价和特异性鉴定及纯化。（一）免疫动物的选择免疫动物的选择基本要求： 1.抗原与免疫动物的种属差异越远越好。2.动物必须适龄、健壮、无感染、体重合乎要求。3.不同动物对同一免疫原有不同的免疫应答表现。因此针对不同性质的免疫原，选用相应的动物。蛋白质抗原大部分动物皆适合；甾类激素多用家免；酶类多用豚鼠。4.抗血清要求：为R（rabbit）型或H（horse）型血清。R型抗血清是以家兔为代表的小型动物产生的抗血清，能和很小量抗原结合形成沉淀线，而H型抗血清则以马为代表的大型动物产生的抗血清，较少用于沉淀反应。此外需要制备大量免疫血清时，应选用马、绵羊等大动物；若需要量不多，则选用家兔、豚鼠和鸡等小动物。（二）免疫方法及途径1.免疫原的注射剂量：应考虑抗原性强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。抗体需要量多，时间间隔长，剂量可适当加大。2.免疫途径：通常有静脉、腹腔、肌肉、皮内、皮下、淋巴结及足掌等。若抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法；半抗原宜皮内多点注射。3.免疫方案：根据设计的目的要求、抗原性质、佐剂的种类来制定免疫方案。可采用全量免疫法、微量免疫法或混合免疫法。4.抗体产生阶段：可分静止期（约2天，血中尚无抗体）；指数期（约4天左右，抗体迅速上升）；稳定期（约24周，抗体保持一个稳定水平）；下降期（约几个月后，此时抗体缓慢下降）四个阶段。（三）动物采血法动物采血法有颈动脉放血法、心脏采血法、静脉多次采血法等。 第四节抗血清的鉴定和保存 一、特异性抗体的鉴定1.抗体特异性鉴定：常采用双向免疫扩散法。2.抗体的效价的鉴定：常采用双向免疫扩散法。一是仅稀释抗血清，与同一浓度抗原反应；另一是抗血清、抗原同时稀释作棋盘滴定。3.抗体的纯度鉴定：常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定。二、抗血清的保存动物血采集后，室温自然凝固后立即分离出血清，妥善保存。抗血清保存有三种方法：第一种是4保存，通常可保存3个月半年，效价高时可保存一年左右；第二种是-20-40低温保存，可保存5年左右，但需防止反复冻融；第三种是真空冰冻干燥保存，可保存510年。 第五节抗血清的纯化纯化的目的是尽量去除抗血清中与目的抗体不相关的成分，防止与特定抗原反应时起干扰作用。最常见的纯化方式是提取特异性IgG或单价特异性抗血清。一、特异性IgG抗血清制备首先用硫酸铵或硫酸钠盐析法粗提丙种球蛋白，再进一步纯化，常用的方法有：1.离子交换层析法：离子交换剂有DEAE纤维素和QAE纤维素。2.凝胶过滤：通过多孔凝胶介质达到分离目的。3.亲和层析法：采用纯化抗原或粗提抗原交联的sepharose 4B的层析柱来制备。4.酶解法 如制备F（ab）2：片段用胃蛋白酶水解制备。二、单价特异性抗血清制备主要通过亲和层析法（交叉杂抗原与琼脂糖珠4B交联制成层析柱）和吸附法（用双功能试剂与抗原交联，制成固相吸附剂）除去杂抗体。习题19 抗原必须具备的基本特性是A.有免疫原性、无免疫反应性B.无免疫原性、有免疫反应性C.分子量大、化学结构复杂D.有免疫原性和免疫反应性E异物性、复杂性答疑编号500734030201正确答案D习题20 兼有免疫原性及免疫反应性的抗原物质称为A.简单半抗原B.复合抗原C.阻断抗原D.完全抗原E. 封闭抗原答疑编号500734030202正确答案D习题21 免疫原性是指抗原分子A.能与应答产物发生特