（微生物学专业论文）苏芸金芽孢杆菌的电穿孔转化及其多功能工程菌的构建.pdf

南开人学坝l j 研究生毕业( 学位) 论文 摘螫 摘要 本文对苏芸金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b t ) 和蜡状芽孢杆菌 ( b a c i l l u sc e f e l l s , b c ) 部分菌株的电穿孔转化进行了研究，主要从电穿孔的供 体质粒和受体菌株等方面讨论了各种因素对该方法的影响。同时利用电穿孔方法 对部分b t 的高效野生株进行遗传改良，以期获得含有c r y l a c 和c r y l c 高效基因 组合的对鳞翅目棉铃虫、甜菜夜蛾都有效的广谱工程株。 恬0 用质粒p s b l 4 0 2 ( c r y l o ，p a m y ( c r y l a c ) ，p n q l 2 2 ( c m 3 枷j r 有的供试菌株 进行畦穿孔转化，不同菌株的表现出不同的转化情况。结果表明质粒和受体菌株 的性质是影响电穿孔转化的重要因素。小质粒比大质粒具有较高的电穿孔转化率。 不同的受体菌株对于高压电脉冲具有不同的耐受能力因而影响到其转化率。同 菌株的消质粒株会比其野生株更容易接受外源d n a 。各菌株的c r y 基因型和表达 调控机制等因素会影响到外源c r y 基因的稳定性和表达水平，不带有c r y 基凶的b t 近缘菌蜡状芽孢杆菌的两株菌b c 9 5 0 9 ，b e l 1 2 6 可以被带有c r y 基因的质粒稳定转 化，且转化率都比较高。另外，受体菌株的表面结构特性也会对转化造成影响。卜 结果证明b t it - 1 8 9 7 是一种进行遗传改良工程菌构建的良好受体。以b t it 18 9 7 的p s b l 4 0 2 转化子t 5 为受体，再次用电穿孔方法导入质粒p a m y , 得到具有 c r y l c 、c r y l a c 双基因组合的转化子t 1 8 9 7t t l 3 。对t t l 3 的生物测定初筛显示 t t l 3 保持了t 5 对淡色库蚊和甜菜夜蛾的毒力，同时也增加了对棉铃虫的毒杀作 用。对于t 5 和t t l 3 的杀虫晶体蛋白进行s d s p a g e 分析表明转入的c r y l c 和 c r y l a c 基因都得到了高表达。 关键词：苏芸金芽孢杆菌，电穿孔转化，遗传改良 1 1 1 南扦人学坝f 。研究生毕业( 学位) 论文 摘要 a b s t r a c t t h i sw o r ks t u d i e dt h ee l e c t r o p o r a t i o no fan u m b e ro fb a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ( b t ) a n d b a c i l l u sc e r e u s ( b e ) s t a i n s ，m a i n l yf o c u s i n gt h ed i s c u s s i o na b o u t t h ef a c t o r sa f f e c t i n gt h i s m e t h o do nt h ed o n o rp l a s m i d sa n dt h er e c i p i e n ts t r a i n s b ym e a n so fe l e c t r o p o r a t i o n ， s e v e r a lh i g ht o x i cw i l dt y p eb tw e r eg e n e t i c a l l yi m p r o v e d ，a n dt h ep u r p o s ew a st o c o n s t r u c ts t r a i n sw i t hc o m b i n a t i o no fc r y l ca n dc r y l a cg e n e s ，w h i c hm a yh a v ea b r o a d e r s p e c t r u ma g a i n s ts p o d o p t e r ae x 辔“na n dh e l i c o v e r p aa r m i g e r a w h e ne l e c t r o p o r a t i n ga l lt h ee x p e r i m e n t a ls t r a i n s b yp l a s m i d sp s b l 4 0 2 ( c r y l c ， p a m y ( c r y l a c ) a n dp n q l 2 2 ( c m 9 ，d i f f e r e n t r e s u l t sw e r e g a t h e r e d f r o md i f f e r e n t b a c t e r i u m i ts h o w e dt h a tt h ep r o p e r t i e so fp l a s m i d sa n dr e c i p i e n ts t r a i n sw e r ev e r y i m p o r t a n tf a c t o r st h a tm a d es t r o n gi m p a c t s o ne l e c t r o p o r a t i o n t h et r a n s f o r m a t i o nr a t e o fs m a l lp l a s m i d sw a sh i g h e rt h a nt h a to fb i go n e s d i f f e r e n tr e c i p i e n t ss h o w e dv a r i o u s a b i l i t i e so n e n d u r i n g t h e h i g hv o l t a g ep u l s e s ，a n d t h e s ea b i l i t i e si n f l u e n c e dt h e i r t r a n s f o r m a t i o nr a t e t h ep l a s m i d - c u r e ds t r a i na c c e p t e dt h ef o r e i g nd n am o r ee a s i l y t h a nt h ew i d et y p e t h ec r yg e n ep a t t e r n sa n dt h ee x p r e s s i o n ，r e g u l a t i o no ft h e s eg e n e s o fe a c hs t r a i n sm a ye x e r ti m p a c t so nt h es t a b i l i t ya n de x p r e s s i o no ff o r e i g nc r yg e n e s t w os t r a i n so fb a c i l l u sc e r e u s ，w h i c hi sc l o s e l yr e l a t e dt ob tb u th a sn oc r yg e n e s ，c o u l d b et r a n s f o r m e ds t a b l yb yp l a s m i d sc a r r y i n gc r yg e n e sa th i g hr a t e s i na d d i t i o n ，t h e s u r f a c es t r u c t u r eo f r e c i p i e n ts t r a i n sw o u l di n f l u e n c et h ee l e c t r o p o r a t i o nal o t i ts h o w e dt h a tb t it - 1 8 9 7i sag o o dr e c i p i e n tf o rt h ec o n s t r u c t i o no fg e n e t i c a l l y e n g i n e e r e ds t r a i n s b ye l e c t r o p o r a t i n gt - 1 8 9 7t 5 ，a t r a n s f o r m a n to fp l a s m i dp s b l 4 0 2 ， w i t hp a my an e ws t r a i nn a m e dt - 1 8 9 7t t l 3w i t hc o m b i n a t i o no fc r y l ca n dc r y l a c w a sc r e a t e d t h r o u g hb i o a s s a y , i ts h o w e dt h a tt t l3n o to n l ym a i n t a i n e dh i g ht o x i c i t yt o s e x i g u a a n dc u l l e x p i p i e n sp a p l l e n s ，b u ta l s o s h o w e da d d i t i o n a l t o x i c i t ya g a i n s t h a r m i g e r a s d s - p a g ea n a l y s i s d e m o n s t r a t e dt h a tt h e c r y l ca n dc r y l a cg e n e s i n t r o d u c e di n t ot 5a n dt t i3e x p r e s s e da ta h i g hl e v e l k e y w o r d s ：b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，e l e c t r o p o r a t i o n ，g e n e t i ci m p r o v e m e n t 南开人学倾i - ) f 究生毕业( 学位) 论文 第一部分：前言 第一部分：前言 一苏芸金芽孢杆菌简介 苏芸金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，简称b t ) 是目前世界上研究最 深入、应用最广泛的一类微生物杀虫剂。它是一种在自然界广泛分布的革兰氏阳 性内生芽孢杆菌，在其芽孢形成期苏芸金芽孢杆菌会产生一种或多种杀虫晶体蛋 白( i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n s ，简称i c p s ) ，由i c p s 形成一个或多个形态 多样的伴孢晶体。伴孢晶体是产生杀虫毒力的主要有效成分，它在其敏感昆虫幼 虫的中肠碱性条件下降解并激活为毒素核心片段，该片段与中肠上皮细胞刷状缘 膜上的特异性受体结合，快速而不可逆地插入细胞膜，使细胞膜传递受干扰，膜 非极化，使肠腔内溶物渗漏，最终导致幼虫死亡。 苏芸金芽孢杆菌的发现及广泛研究己近l o o 年的历史，到1 9 9 9 年，法国巴 斯德研究所“国际昆虫病原芽孢杆菌保藏中心( i e b c ) ”已鉴定出6 9 个h 血清型 和1 3 个亚抗原群，在i e b c 收藏的3 5 0 0 株苏芸金芽孢杆菌中共有8 2 个h 一血清型 亚种“。各品系在生化特性、杀虫谱及毒力等方面具有广泛的生物多样性。2 2 “ ， 对b t 敏感的无脊椎动物已涉及到节肢动物门的鳞翅目、双翅目、鞘翅目等九个目， 以及扁形动物门中的吸虫和绦虫，线形动物门中的动植物线虫，原生动物门的鞭 毛虫、变形虫和草履虫“o ”j 。 苏芸金芽孢杆菌的杀虫活力与杀虫晶体蛋白( i c p s ) 、芽孢及其胞外分泌的 多种组分，包括磷酸酯酶、b 一外毒素、蛋白酶、几丁质酶和营养体杀虫蛋白( v i p ) 驯等相关，其中最主要的活性物质是杀虫晶体蛋白，包括晶体蛋白( c r y ) 和溶细 胞素( c y t ) 两大类”3 。自从1 9 8 1 年，s c h n e p f 和w h i t e l e y 克隆到第一个编码i c p s 的基因一c 叫，爿a 以来，到2 0 0 0 年4 月5 日，克隆到的i c p s 编码基因已达1 8 3 个， 它们被分成2 8 类c c y 基因和2 类c y t 基因口“。杀虫晶体蛋白的杀虫毒力具有很高 的特异性，一种杀虫晶体蛋白仅对少数几种已知昆虫有效，有时蛋白上几个氨基 酸的差异就表现为不同的杀虫活性。c r y l 、c r y 9 a 和c r y 9 c 几类蛋白是对鳞翅目 昆虫有高毒力的杀虫晶体蛋白，其中研究的最多的是c r y l 蛋白，这类蛋白分子量 约为13 01 4 0 k d a ，构成菱形晶体，不同亚类的杀虫谱有较大差异“”( 表1 1 ) 。 c r y 2 、c r y 4 、c r y l o a 、c r y l l a 和c y t 等蛋白对双翅目昆虫有特异性“1 1 ”1 ( 表1 2 j ， c r y 3 a 、c r y 3 b 、c r y 3 c 和c r y 7 h 等蛋白对鞘翅目昆虫如马铃薯甲虫( l e p t i n o t a v a d e c e m j i n e a d ) 有特异杀虫活性。杀虫晶体蛋白的这种杀虫特异性是产生活性蛋 白核心片段的方式及其与昆虫消化道匕皮细胞相互作等多步反应的结果。 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 第一部分：前言 表1 1c r y l 杀虫晶体蛋白对鳞翅目昆虫的特异性i 1 1 昆虫 1 a al a b1 a e 1 b 1 ci d1 e 1 f 一一 + 土 + + 一 + + + 一一土 + + 甜菜夜峨( s p o d o p t e r ae x i g u 斜蚊夜蛾( 旦l i t t o r a l i s ) 黑迁移地老虎州e t e b i a f e n n i c a ) 粉蚊夜蛾( t r i c h o p l u s i ah i ) 烟芽夜蛾( h e l i o t h i sv i r e s c e n s ) 欧洲玉米螟( o s t r i n i an u b i l a l i s ) 甘蓝夜蛾( m a m e s t r ab r a s s i c a e ) 十+ 一 一 + 一 一 大菜粉蝶俨i e r i sb r a s s i c a e ) + 烟草天蛾( m a n d u c as e x t a ) + 一 + 云杉卷夜蛾( c h o r 括t o n e u r a 向m i r e r a r l a ) + 舞毒蛾( l y m a n t r i ad i s p a r ) + 一士 白斑天幕毛虫( o r g y i al e u c o s t i g m a ) + 一 十 森林天幕毛虫( m a l a c o s o m ad i s s t r i a ) + 家蚕( b o m b y x m o t 0 + 一一 十 十 小菜蛾( p l u t e l l a x y l o s t e l l a ) 十+ 一 丛堑垦堡! ! ! ! ! ! ! ! 巫塑! ! 型 !：二! + 有活性；低括性：一无活性 表1 , 2c r y 2 、c r y 4 、c r y l o 和c r y l l 对麴目和礁垦垦蜜鲤鳖! 型”1 昆虫2叫 2 b2 c 4 a 4 bi o a l l a 烟芽夜蛾( h e l i o t h i sv i r e s c e n s ) + 舞毒峨( l y m a n t r i ad i s p a r ) + 粉蚊夜蛾( t r i c h o p l u s i a 棚 + 大菜粉蝶( p i e r i sb r a s s i c a e 、 + 烟草天蛾( m a n d u c as e x t a ) + 埃及伊蚊“e d e s a e g y p t i ) + 一一 + 斑须按蚊似n o p h e l e ss t e p h e n s i ) + 尖音库蚊( c u l e x p i p i e n s ) + + 有活性：一无活性 苏芸金芽孢杆菌含有丰富的质粒，不同的菌株中包含2 1 6 种质粒，大小范 围在1 5 m d a 一1 5 0 m d a 之间心“。根据大小可将b t 的质粒分为1 5 - 1 5 m i ) a 的小质粒和 大于1 5 m d a 的大质粒两种类型，大质粒中有些与染色体d n a 部分同源，小质粒与 染色体d n a 没有同源性h 9s 2 。除了少数亚种，如b ts u b s p w u h a n e n s i s , b t s u b s p d e n d r o l i m u s 和b ts u b s p b e i n e r 的c r y 基因是位于染色体外，绝大多数 c r y 基因位于3 0 m d a 以上的大质粒心”。一个b t 菌株中常具有几种不同类型的c r y 基因，它们可能定位于不同的质粒，也可能位于同一质粒上。对b t 菌株的某一个 或某一类c r y 基因的定位通常采用s o u t h e r n 杂交的方法，即将b t 的质粒与特异 的c r y 基因片段进行杂交。实验证明h d 一1 一x 的c r y l a a 、c 9 0 时，1 5 0 0 0 r p m 离心3 0 分 钟，沉淀用无菌水洗涤1 次，悬浮于少量无菌水中，冷冻干燥，即得伴孢晶体冻 干粉。 ( 2 ) 伴孢晶体的溶解及s d s - p a g e 参考l a e m m l i ( 1 9 7 0 ) 和李荣森( 1 9 8 9 ) 方法进行【6 4 7 1 。浓缩胶浓度为4 8 ， 分离胶浓度为1 0 ：溶晶体样品缓冲液：2 0 蔗糖，4 s d s ，0 1 2m o l lt r i s ，1 0 巯基乙醇，o 0 0 2 溴酚蓝( p h 1 2 ) ；电泳缓冲液：1 0 0 0 m l 水中含有t r i s6 0 9 ，甘 氨酸2 8 8 9 ，s d s1 0g ，p h8 3 。将晶体用溶晶体样品缓冲液处理( 5 m g m l ) ，1 0 0 。c ， 5 分钟，取5 - 1 0 1 a l 点样。于1 5 m a 泳动2 小时后，凝胶在0 2 5 考马斯亮兰g 2 5 0 甲醇冰乙酸水染色液( 5 ：1 ：5 ) 中染色2 小时，在甲醇冰乙酸水溶液( 5 ：7 5 ：8 7 5 ) 中脱色。 堕墅盔兰堡! 婴塞生兰些! 兰垡! 笙壅一型二三塑坌二_ 缝塑受! 堕一 6 供试菌株的杀虫活性测定 ( 1 】棉铃虫、甜菜夜蛾的毒力初筛 采用斜面培养物菌悬液光密度标定法：取培养7 2 h 的菌株斜面，以1 0 m l 生测 缓冲液制成菌悬液，7 2 1 型分光光度计测定其光密度o d 6 0 0 ，将菌悬液稀释至 o d 6 0 0 = 1 0 ( 甜菜夜蛾) 或o d 6 0 0 = 0 8 ( 棉铃虫) ，吸取3 m l 与2 7 m l 感染饲料混 匀倒2 4 孔生测板，每块板接入2 4 头初孵1 2 h 未进食、健康活泼幼虫，设两个重 复：置于3 0 c 恒温箱中饲养，并设对照，7 2 h 后检查其死亡数，计算死亡百分率。 生测用缓冲液( g 1 0 0 0 m l ) n a c l8 5 ；k 2 h p o 6 0 ；k h 2 p 0 43 0 ；吐温一8 0 ( 1 ) 1 0 m l 。 棉铃虫感染饲料：黄豆粉8 0 ；酵母粉4 0 ；抗坏血酸5 ；3 6 乙酸1 3m l ：琼脂粉 1 8 。甜菜夜蛾感染饲料：黄豆粉8 0 ：酵母粉4 0 ；大麦粉6 0 ；3 6 乙酸1 4 m l ：苯 甲酸钠3 ；苯甲酸l ；抗坏血酸5 ：蜂蜜4 ；琼脂粉1 8 。供试昆虫均为本实验室饲 养。 ( 2 ) 淡色库蚊初筛 取培养7 2 小时的菌株斜面，以一满环菌j j u z 盛有2 0 0 m l 蒸馏水的搪瓷碗中 每个搪瓷碗中接2 5 头三龄淡色库蚊幼虫，2 3 - 2 5 c 条件饲养4 8 小时，计其死亡率 每个处理2 个重复。 7 质粒的构建 用限制酶b a m h i ( 华美公司产品) 和e c o r i ( 华美公司产品) 双酶消化质粒 p s b l 4 0 2 ，回收1 0 - 3 k b 口的线状大片段。该片段作为连接反应的受体片段，带有c r y l c 基因。用b a m h i 和e c o r i 双酶消化质粒p n q l 2 2 ，回收1 2 k b p 的小片段。该片段 作为连接反应的供体片段，带有c m 抗性标记。 酶切片段的回收：电泳酶切结果，在回收的目的片段电泳出一段距离后，在 该片段前方的凝胶中切下一个小的缺口，灌入少量低熔点胶；继续电泳，待目的 片段进入低熔点胶后，切下的熔点胶；从低熔点胶中回收目的片段( 参见分子克 隆) 。 连接反应：将l 灿受体片段和7 5 此供体片段混合于小离心管，4 5 0 c 水浴 5 分钟，再将混合物冷却到0 。c ；加入t 4l i g a s eb u f f e r ( 1 0 ) l h l ，加入t 4l i g a s e o 、5 9 l ，体系共1 0 i t l ；1 6 0 c 反应大于1 6 小时。 感受态细胞( j m l 0 9 ) 制备，参见分子克隆。 连接产物转化j m l 0 9 ：3 - 5 9 l 连接产物加入l o o g l 感受态细胞，冰浴3 0 分钟； 1 4 南开大学坝p 研究生毕业( 学位) 论文 第一部分：材料和方法 4 2 。c 热休克9 0 秒，0 。c1 分钟冷却；加入9 0 0 1 - tll b 培养基，3 7 。c ，小于1 6 0 r p m 培养l 小时；取2 0 0 1 - t l 连接产物涂选择平板。 挑选转化子，提取其质粒，用b a m h i 和e c o r i 双酶消化，电泳检测酶切后片 段大小是否与出发片段相符。 堕茎查堂竺土型窒生望、业! 堂垡! 笙兰笙三塑坌三一塑墨量兰! 塑一 第三部分：结果与分析 一供试不同菌株的电穿孔转化 1 三种质粒对供试菌株的电穿孔转化 利用质粒p s b l 4 0 2 ( c r y l c ) ，p a m y ( c r y l a c ) ，p n q l 2 2 ( c m r ) 对所有的供试菌株进 行电穿孔转化，转化结果见表3 1 。表中可见不同菌株的转化情况是不同的。容易 被转化的菌株主要集中在以下几株：苏芸金芽孢杆菌中的b t it - 1 8 9 7 ，b t i4 q 8 ，h d 一 1 x c u r 8 h d 7 3 以及蜡状芽孢杆菌中的b c 9 5 0 9 和b c l 1 2 6 。其他供试的菌株基本 未被三种质粒转化。 表3 1 三种质粒对所有供试黄株的电穿孔转化结果+ 堕堡! 璺! ! ! ! ! ! 型! q 坠坚! ! ! 型生1 2翌g ! ! ! 坚竺：2 b t h d - 2 - - b t h d - l - x -+ b t h d - l - x c u r 8 + + b t h d - 7 3 + - + b t7 4 0 4 - b t7 4 0 4 c u r l 4 一 - - b t7 3 0 4 - b t l - 7 6 0 1 - b t7 4 1 7 - - b t0 0 6 - -+ b t b t t 3 i 一 一 b t t 1 8 9 7 + b t4 q 8 + + b c9 9 4 5 -+ b c9 5 0 9 + b c1 1 2 6 + 一 b s u b n a t t o - 一一 b s u b 6 6 3 3 一 一 b m1 1 2 7 - 一 + “+ ”表示可以转化，“”代表不可以转化 ( 1 ) 以质粒p s b l 4 0 2 为供体，能够被转化的菌株有h d 一1 一x c u r 8 ，h d 7 3 ，t - 1 8 9 7 ，4 q 8 b c9 5 0 9 ，b c1 1 2 6 ，它们的转化率见表3 2 。表中可见，b c9 5 0 9 具有较高的转化率， 1 6 塑墅查堂堡主丛生竺兰些! 堂竺! 丝苎箜三苎坌二_ 皇堕竺! ! 丝l 最高可达2 x1 0 2 转化子ug d n a 。h d 1 一x c u r 8 ，t 一1 8 9 7 ，4 q 8 可以被p s b l 4 0 2 稳定 地转化，而h d 7 3 和b c l 1 2 6 虽然可得到转化子，但其数目极少而无法计算转化 率。 壅i ：! 巫塾2 1 墨! ! ! 堕至塑堕整鲤皇窒塾堑垡奎! 董垡型! ! 型垒! 电场强度 ( k v c m ) 堕楚! ：! ! ：! ! ：! ! ! ：! ! ：i h d 1 x c u r 81 2 1 6 12 70 0 4 h d 7 3 一 t - 1 8 9 73 3 5 68 1 3 51 8 4 q 8 0 3 3 1 1 70 3 3o 8 4 1 0 8 3 9 5 0 916 3 1 0 2 2 0 1 1 0 222 1 1 0 21 3 3 1 0 2 1 7 7 x 1 0 2 1 ：! 踅 ： ：! ：! ：二_ 一 ( 2 ) 以质粒p a m y 为供体，可以被转化的菌株主要有h d 一1 一x c u r 8 ，t - 1 8 9 7 ， b c 9 5 0 9 ( 表3 3 ) 。b c 9 5 0 9 依然保持了稳定的较高的转化率，而在表3 1 中可以被稳 定转化的4 q 8 和b c l 1 2 6 由于抗性标记的问题无法进行转化子的筛选和转化率的 计算。 表3 3 质粒p a m y 对不同菌株的电穿孔转化宰( 转化子，1 1g d n a ) 电场强度( k v c m ) 菌株 7 59 0 1 0 51 1 5 1 2 5 h d 1 x c u r 8 5 5 t 1 8 9 72 01 3 3 32 73 3 9 5 0 99 1 3 8 6 71 0 8 711 47 0 7 壅! ：! 垩塾型旦! 丝型至旦苎壁笪皇窒缝堡兰! 篓! 堕! 兰些垒! 电场强度( k v c m ) 菌株 7 59 01 0 51 1 5 1 2 5 1 7 塑堑查兰塑! 塑塑生兰些! 堂焦! 丝苎一釜兰塑坌二墨堡立堑! i ! 一 ( 3 ) 以质粒p n q l 2 2 为供体，能够被转化的菌株包括h d 一1 一x ，h d 一1 - x c u r 8 ，h d 7 3 ， 0 0 6 ，t - 1 8 9 7 ，4 q 8 ，b c 9 9 4 5 ，b c 9 5 0 9 ( 表3 4 ) 。结果中h d 一1x c u r 8 ，t - 1 8 9 7 ，4 q 8 ，b c 9 5 0 9 具有较高稳定的转化率，h d 1 x ，0 0 6 ，h d 7 3 虽然可以被转化，但是转化率较低。 2 电场强度与质粒转化率 以质粒p n q l 2 2 为例，( 选择p n q l 2 2 是因为该质粒上面不带有c r y 基因 从而排除了内源基因不相容性的干扰) 得电场强度一转化率曲线( 图3 1 ) 。 7591 0 51 1 51 25 电场强度( k v c m ) 一h d l x c u r 8 - t 一1 8 9 7 4 0 8 * b c 9 5 0 9 图3 1p n q l 2 2 在不同蕾株中的转化事与电场强度的关系 同一菌株的转化率随电场强度的变化而变化，t 1 8 9 7 的转化率在1 1 5 k v c m 时为2 0 6 1 0 4 ，在1 2 5 k v c m 时为7 6 x1 0 2 ，二者相差较大。不同的菌株往往具有 不同的最高转化场强，4 q 8 和b c 9 5 0 9 为7 5 k v c m ，t 1 8 9 7 和h d 一1 - x c u r 8 为1 1 5 k v c m ， 这是与菌株的本身性质及其对电脉冲的敏感程度密切相关的。并不是电场强度越 大转化率越高，场强的升高易于在细胞表面形成孔洞，有利于d n a 的进入和转化； 而同时随着场强的升高，细胞的存活率也会下降，从而降低转化率。 3 质粒本身的性质对转化率的影响 以t - 1 8 9 7 为例，( 选择t - 1 8 9 7 是因为它可以稳定的被三种供体质粒稳定地转 化，同时不带有c r y l 类基因，从而排除了同源基因排斥的影响) 得到三种质粒的 转化率曲线( 图3 2 ) 。 5 5 4 5 3 5 2 5 5 o 4 3 2 l o 一吾jm甚李毒v斛s毒毒普 南开大学硕i ：研究生毕业( 学位) 论文 第三部分：结果与分析 羞 耋 斗 甚 辩 。 僻 基 啦 竺 91 051 1 51 2 5 电场强度( k v c m ) 图3 2 三种质粒在t - 1 8 9 7 中的转化事与电场强【度的关系 卜p s b l 4 0 2 p a m y p n 0 1 2 2 小质粒比大质粒具有较高的电穿孔转化率。在三种质粒中，p n q l 2 2 ( 4 8 k b p ，不 带有c r y 基因) 最容易被转化，不仅对于t - 1 8 9 7 ，对h d 一1 一x c u r 8 ，4 q 8 ，b c 9 5 0 9 的 转化率都可达到1 0 3 转化子ug d n a ( 表3 4 ) 。而大小为1 0 k b p 左右，分别带有c r y l c ， c r y l a c 基因的p s b l 4 0 2 和p a m y 则转化率相对较低，一般只有几个到几十个，最 高也只有1 0 2 左右( 表3 2 ，表3 3 ) 。这说明质粒本身的性质，特别是当质粒带有 与受体菌相关或同源的基因时，会对质粒的转化率造成影响。 4 菌株的性质与质粒的转化率 ( 1 ) 消质粒作用与转化率消质粒经常被作为遗传工程准备受体菌株的一个重要手 段，实验证明同一菌株的消质粒株会比其野生株更容易接受外源d n a ，本实验中 的h d 1 x 和h d 1 一x c u r 8 的转化结果也支持了这一观点。h d 一】- x c u r 8 是h d - 1 _ x 的高温消质粒株，它失去了产生伴孢晶体的能力。在利用带有c r y 基因的质粒 p s b l 4 0 4 和p a m y 分别对h d 1 x 和h d 1 x c u r 8 进行转化时，前者无法得到两 种质粒的转化子，而后者则可以被二者稳定地转化( 见表3 2 ，表3 3 ) 。这说明受 体菌本身所带有的c r y 基因会对外源c r y 基因的转化和表达造成影响，而消质粒， 特别是削去带有c r y 基因的质粒会有利于外源d n a 的转化。在利用不带有c r y 基 因的质粒p n q l 2 2 对二者进行转化时，虽然二者都可以得到转化子，但h d 1 x c u r 8 的转化率要明显高于h i ) 一1 x ( 表3 ，4 ) ，这也说明受体菌内源质粒的消除也有利于 外源d n a 的进入。 1 9 南开人学颂l q i ) f 究生毕业( 学位) 论文 第三部分：结果与分析 ( 21 受体菌种类的影响。不同的受体菌接受外源质粒的能力不同。本文中供试菌 株中的可转化菌株主要集中在t - 1 8 9 7 ，4 q 8 ，h d 7 3 ，h d 一1 - x c u r 8 ，b c 9 5 0 9 和 b c l 1 2 6 。供试的其他菌株未被供体质粒转化，这主要也是由这些菌株本身的性质 决定的，特别是某些菌株带有多个c r y 基因，有的甚至与c r y l c 和c r y l a c 具有较 高的同源性，这种情况会影响到外源c r y 基因的转化和表达。 蜡状芽孢杆菌的两株菌b c 9 5 0 9 ，b c i 1 2 6 可以被带有c r y 基因的质粒稳定转 化，且转化率都比较高，这从一个侧面表明了b c 和b t 之间存在着密切的联系。 从各方面分析来看，b t 与b c 的差异仅仅在于是否产生伴孢晶体蛋白，也许j 下是 因为b c 本身不具有c r y 基因，同时二者又有亲缘，b c 才那么容易接受带有b t 的 c r y 基因的质粒。值得一提的是b c 9 9 4 5 ，这株菌对电脉冲很不敏感( 见表3 5 ) 却 仍有较低的转化率，充分说明b c 品系容易接受外源d n a ，这也许是它本身不具 有杀虫晶体蛋白及其编码质粒造成的。 ( 3 ) 供试菌株对电脉冲的耐受力及其对转化率的影响 不同的菌株对于高压电脉冲的耐受能力不同，同一菌株在不同强度的电脉冲 下存活率也不同( 表3 5 ) 。由表3 5 可见，不同的供试菌株对于高压电脉冲的耐 受能力不同，这种不同既表现为不同种间的差异，又表现为同种内不同菌株的 差异。b c 9 9 4 5 是对电脉冲最不敏感的一株菌( 各种场强下的存活率都在4 0 以 上) ，h d 2 ，t 一1 8 9 7 ，4 q 8 ，b c 9 5 0 9 ，b s n a t t o 对电脉冲的耐受力较低，存活率都在1 0 甚至5 以下。 对于同一菌株，电脉冲处理后存活率的总体趋势是：电场强度越高，存活率 越低。细胞存活率与电穿孔转化率的联系在表3 5 中可以看出，作为同一菌株 的消质粒株和野生株，h d 1 一x c u r 8 的存活率要明显低于h d 1 x ，特别是在场强 不是很高的时候，而在进行转化实验时h d 1 x c u r 8 可以被稳定地转化，h d 一1 x 却几乎无法转化。同为b t 的t - 1 8 9 7 和7 4 0 4 ，前者对电脉冲比后者敏感得多，二 者在转化实验中也表现为稳定转化和不能转化的差异。同为蜡状芽孢杆菌的 b c 9 9 4 5 和b c 9 5 0 9 ，二者的电脉冲耐受力的差别显而易见，转化结果表明b c 9 5 0 9 比b c 9 9 4 5 更容易接受外源质粒。从以上现象可以看出，菌株对于电脉冲的敏感程 度是决定其转化能力的一个因素。事实上，电穿孔转化过程中的穿孔，复原，复 活等过程都与菌株对电脉冲的耐受能力密切相关。菌株的耐受力越低，越容易被 高场强电流在其细胞壁和细胞膜上打出一个孔洞，从而有利于外源d n a 的进入和 转化。同时耐受力和存活率越低，得到的有效转化子的个数越少，所以我们在实 塑墅盔兰塑! ：塑塑生兰些! 兰垡! 堡茎笙兰塑坌二_ 兰堕兰堑! ! ! 一 验中应该综合考虑存活率和转化率二者的关系，才能得到某一菌株的最适转化电 场强度。综合电穿孔转化率和存活率的结果，可得到部分菌株的最适转化场强( 表 3 6 、。 壅! ：! 至旦堕堡垄至堕堑塑皇壁登王丝壹垩圭! 丝! 电场强度 ( k v c m ) 菌株7 5 9 01 0 51 i 51 2 5 h d 25 93 54 7 2 42 9 h d 1 x2 561 5 99 1 7 81 0 0 h d 1 - x c u r 81 051 0 4 9 9j i 28 8 h d 7 3l l6 6 68 45 96 6 7 4 0 41 2 67 48 3 1 0 03 5 7 4 0 4 c u r l 41 4 61 2 51 1 1 8 68 3 7 3 0 41 0 91 1 17 6 7 56 8 1 7 6 0 10 1 0 01 8 56 21 5 7 4 1 71 3 31 77 34 8 2 2 0 0 64 81 1 28 3 9 16 7 t 18 9 72 85 30 8 3 04 4 4 q 8 】8j 0 97 0 6 68 4 9 9 4 54 8 66 3 64 5 0 4 3 64 5 0 9 5 0 97 16 52 6 2 93 9 n a t t o6 、36 33 8 5 03 3 塞! ：! 堡塑整墅塑皇窒垡丝塑墼型! 竺! 菌株t - 1 8 9 74 q 8 h d - 1 - x c u r 8b c 9 9 4 5b c 9 5 0 9 墨垩些塑! ! ：! ! ：i! ! ：!：!：i 二。转化子的筛选和鉴定 1 显微镜镜检鉴定 伴孢晶体的产生与否，极其大小、类型是决定b t 杀虫毒力极其特异性的重 要标志。通过对p s b l 4 0 2 的转化子和p a m y 的转化子的镜检发现，大多数的转化 子的晶体形态只产生极小的变化，甚至没有改变。可以观察到晶体形态明显变化 的有t 1 8 9 7 的转化子，镜检发现其晶体形态由原受体株的不规则的小球形变为菱 形，小球形，镶嵌形等多种形态( 见图3 3 ) ，增加的菱形和镶嵌形晶体是对鳞翅 目有效的蛋白晶体类型。 2 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 第三部分：结果与分析 田3 3b t it - 1 8 9 7 和转化子1 瓠t 1 r 1 3 的停穗晶体形态( x 3 3 5 0 ) 但是，晶体形态不发生改变并不能表明检出的菌落不是所需的转化子。b t 的 伴孢晶体的形成是一个蛋白质大量积累的过程，可能的情况是所导入的外源c r y 基因得到了表达，但是没有达到积累形成晶体的表达量。因此应该通过进一步的 实验对转化子的基因和蛋白进行检测。 2 特异性p c r 检测外源c 删基因是否被导入受体菌 利用特异性引物对转化子中的c r y l 4 c 和c r y l c 基因进行特异性扩增，p c r 检 测是对特定的c r y 基因进行检测的最直接，最方便的手段。结果表明电穿孔转化 所得到的转化子都含有供体质粒的c r y 基因( 图3 4 ，3 5 ) 。 3 转化子质粒谱的检测 分别提取出发株极其转化子的质粒，琼脂糖凝胶电泳进行检测。从结果看， p s b l 4 0 2 和p a m y 的转化予的质粒谱中都在相应大小的位置附近多出了一条质粒 带( 图3 6 ，3 7 、。这条带往往比供体质粒略大，这种现象可能是受体菌株对转入的质 粒进行修饰和加工的结果。综合p c r 等检测的结果，可以肯定在转化子质粒谱中 出现的那条带是转化入受体菌株的供体质粒。 在对比出发株与转化子的质粒谱的时候偶然会发现电穿孔后的内源质粒的 南开人学坝i 研究生毕业( 学位) 论文 第二部分：结果2 1 分析 图3 4p c r 检测质粒p s b l 4 0 2 的转让| 子中的c 叫j c 基因 a l ：m a r k e r ( 1 d n ah i n d i i i + e c o r i 、a 2 ：9 5 1 0a 3 ：t - 1 8 9 7a 4 ：t - 1 8 9 7 t ia 5 ：t - 1 8 9 7 t 2 a 6 ：4 q 8a 7 ：4 q 8 t 2a s ：4 q 8 - t 6a 9 ：i 1 2 6a 1 0 ：1 1 2 6 t 1 8 b i ：m a r k e r ( k d n ah i n d l l l + e c o r l ) b 2 ：h d 7 3b 3 ：h d 7 3 - t ib 4 ：h d 7 3 t 2b 5 ：h d 1 x c u r 8b 6 ：h d 1 x c u r 8 t ib 7 ：h d - i - x c u r s - t 2m ：g s 0 9b 9 ：9 5 0 9 t 1 0 b 1 0 ：9 5 0 9 t 1 3 圈3 5p c r 检测质粒p a m y 的转化予中的c r y l a c 基因 1 ：m a r k e r ( z d n ah i n d l l l + e c o r i ) 2 ：7 4 0 4 3 ：h d 1 x c u r 84 ：h d 1 x c u r 8 t 1 4 5 ：h d i x c u r 8 t 1 9 6 ：t - 1 8 9 77 ：1 - 1 8 9 7 一t 1 3 8 ：t - 1 8 9 7 - t 2 09 ：9 5 0 9 1 0 ：9 5 0 9 t 1 71 1 ：9 5 0 9 t 2 0 南开人学坝i t 州究生毕业( 学位) 论义 第r 三部分：结果1 分析 圈3 6 质粒p s b l 4 0 2 的电穿孔转化子的质粒谱 a i ：p s b l 4 0 2 ( 1 0 3 k b p ) a 2 ：h d - l - x c u r s - t 2 a 3 ：h d - i x c u r 8 - t ! a 4 ：h d - i x c u r 8a 5 ：h d 7 3 - t 2 a 6 ：h d 7 3 t i a 7 ：h d 7 3b i ：p s b l 4 0 2b 2 ：t - 1 8 9 7b 3 ：卜1 8 9 7 - t 1 3b 4 ：t - 1 8 9 7 - t 2 1b $ ：4 q 8b 6 ：4 q 8 - t 2 b 7 ：4 q 8 - t 6b 8 ：p s b l 4 0 2c 1 ：9 5 0 9 - t 1 0c 3 ：9 卯9c 3 ：1 1 2 6 - t 1 8c 4 ：1 1 2 6 c 5 ：p s b l 4 0 2 图3 7 质