小分子药物Kartogenin诱导骨髓间充质干细胞定向分化中基质金属蛋白酶2的表达.doc

www.CRTER.org王呈，等. 小分子药物Kartogenin诱导骨髓间充质干细胞定向分化中基质金属蛋白酶2的表达小分子药物Kartogenin诱导骨髓间充质干细胞定向分化中基质金属蛋白酶2的表达王 呈，薄其玉，戴国锋，杨伟巍(山东大学齐鲁医院，山东省济南市 250012)引用本文：王呈，薄其玉，戴国锋，杨伟巍. 小分子药物Kartogenin诱导骨髓间充质干细胞定向分化中基质金属蛋白酶2的表达J.中国组织工程研究，2016，20(50):7475-7480.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.004 ORCID: 0000-0002-5005-1207(王呈)文章快速阅读：小分子药物KGN在骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的过程中的诱导作用王呈，男，1980年生，山东省烟台市人，汉族，2011年北京大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨关节退变及运动损伤研究。通讯作者：戴国锋，山东大学齐鲁医院，山东省济南市 250012中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)50-07475-06稿件接受：2016-10-11Kartogenin (KGN)软骨细胞II型胶原表达增强KGN促进软骨增殖的同时抑制软骨细胞的凋亡MMP-2表达减少增殖表达 文题释义：Kartogenin：长期以来科学家们都致力于寻找可再生软骨的方法，这是对抗骨关节炎的核心难题，2012年4月5日，Science在线报道了Kartogenin(KGN)的发现，该小分子是一种smad4/smad5通路激活剂，拥有极强的促软骨分化能力，能有效地促进间充质干细胞向软骨细胞分化。这些研究成果为软骨修复提供了新的线索。基质金属蛋白酶2：基质金属蛋白酶可降解关节软骨中的胶原蛋白、蛋白多糖和其他细胞外基质大分子，在骨关节炎的发展过程中起重要作用，软骨细胞外基质的主要成分为II型胶原和蛋白聚糖，MMPs家族中基质金属蛋白酶2(MMP-2)作为进一步分解代谢胶原裂解产物的明胶酶，近年来被认为与软骨损伤和退变的病理过程明显相关。摘要背景：体外实验发现小分子药物Kartogenin(KGN)能诱导间充质干细胞转变成为软骨细胞，KGN的发现为人们找到了修复软骨的新途径，未来很有希望成为新型骨关节炎治疗药物。 目的：通过体外实验观察小分子药物KGN 在骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的过程中的诱导作用。方法：体外传代培养人骨髓间充质干细胞至对数生长期，分为空白对照组、1 mol/L KGN组和10 mol/L KGN组，3组KGN的终浓度分别为0，1 和10 mol/L，培养72 h后通过显微镜检骨髓间充质干细胞的增生和分化情况，用酶联免疫吸附实验检测上清中软骨代谢降解标记物基质金属蛋白酶2水平，用免疫荧光染色技术观察型胶原蛋白表达情况。结果与结论：镜检发现随着KGN药物浓度的增高能明显促进骨髓间充质干细胞的增生和分化；免疫荧光染色结果显示随着KGN浓度的增高型胶原蛋白的表达增加；而随着KGN药物浓度增加，基质金属蛋白酶2的表达随之降低。提示小分子药物KGN能诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化，且随着药物浓度的增加，软骨细胞外基质的破坏也随之被抑制。关键词：干细胞；骨髓干细胞；骨关节炎；Kartogenin(KGN)；基质金属蛋白酶2；型胶原；软骨分化主题词：干细胞；基质金属蛋白酶2；胶原型；组织工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 基金资助：山东省科技攻关计划项目(2013GSF11826)缩略语：基质金属蛋白酶：matrix metalloproteinases，MMPsVariation of matrix metalloproteinase 2 levels during Kartogenin-induced directional differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cellsWang Cheng, Bo Qi-yu, Dai Guo-feng, Yang Wei-wei (Qilu Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China)AbstractBACKGROUND: Kartogenin can induce chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells as reported in in vitro experiments. The discovery of Kartogenin finds a novel path to cartilage repair, and it is expected to develop into a new drug to treat osteoarthritis.OBJECTIVE: To observe the inductive role of Kartogenin in the process of human bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into chondrocytes in vitro.METHODS: In vitro cultured human bone marrow mesenchymal stem cells were grown to the logarithmic phase, and then divided into control group (0 mol/L Kartogenin), 1 mol/L Kartogenin group, and 10 mol/L Kartogenin group. After 72 hours of culture, cell proliferation and differentiation were observed microscopically. Matrix metalloproteinase 2 and type II collagen levels in the cell supernatant were detected by enzyme linked immunosorbent assay and immunofluorescence staining, respectively.RESULTS AND CONCLUSION: Under the microscope, Kartogenin was shown to significantly promote the proliferation and differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. With the increase of Kartogenin concentrations, the level of type II collagen was increased, while the level of matrix metalloproteinase 2 was decreased. These findings indicate that Kartogenin can induce human bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into chondrocytes, and with the increase of Kartogenin concentration, destruction of the cartilage extracellular matrix may be inhibited. Subject headings: Stem Cells; Matrix Metalloproteinase 2; Collagen Type IIFunding: the Science and Technology Plan of Shandong Province, No. 2013GSF11826Cite this article: Wang C, Bo QY, Dai GF, Yang WW. Variation of matrix metalloproteinase 2 levels during Kartogenin-induced directional differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(50):7475-7480.Wang Cheng, M.D., Attending physician, Qilu Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, ChinaCorresponding author: Dai Guo-feng, Qilu Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China7479ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction关节软骨在关节活动中起传导分布及承受关节应力重要作用，创伤或运动损伤常导致关节软骨的急性损伤，引起关节疼痛、肿胀及功能障碍。软骨损伤比例高达膝关节损伤中的63%1。而慢性软骨损伤、退变会导致继发的软骨下骨改变和骨赘增生，从而发展成为骨性关节炎，在60岁以上老年人群中，有症状的膝骨关节炎发病率高达37%2，晚期的骨性关节炎表现为严重的疼痛、畸形和功能障碍甚至病废。由于软骨本身结构缺乏血管、淋巴和神经等组织，损伤后再生非常困难。目前对于关节软骨损伤的治疗手段包括口服软骨营养药物和外科手术。关节镜辅助下手术占据软骨损伤外科治疗手段的主流，如关节清理、微骨折、自体或异体软骨移植等，但对于复杂严重的软骨损伤，上述治疗方法的效果多差强人意3-4；而适用于老年重度骨关节炎的关节置换手术，由于人工关节本身的使用寿命限制，无法广泛应用于软骨重度损伤并且具有较高运动需求的巨大年轻患者群体。鉴于上述缘由，软骨损伤的修复一直是医学界研究的重大热点，近二十年来，建立于细胞生物学和生物材料学基础上的新兴学 科组织工程学的蓬勃发展为软骨修复研究带来了新的曙光，不断有鼓舞人心的科研成果问世。2012年5月Science杂志报道了小分子物质kartogenin(KGN)的发现，KGN在实验室研究中能够通过与细丝蛋白A相结合，从而干扰其与转录因子CBF相结合，调控CBF-RUNX1转录程序诱导间充质干细胞转变成为软骨细胞，该成果为致力于软骨修复研究的科学家带来极大鼓舞5。该研究作者Kristen Johnson报道了KGN在体外实验中能够促进人骨髓间充质干细胞样本中的金属蛋白酶组织抑制剂I(TIMP-I)、型胶原、聚焦蛋白聚糖的mRNA表达，意味着能够显著诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化；而对软骨代谢降解的标记物如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族中的MMP-3、13和聚焦蛋白聚糖酶(Aggrecanase)的表达水平没有显著影响，研究者认为这表明KGN在促进间充质干细胞向软骨细胞分化的过程中并没有出现软骨细胞的加速凋亡。MMPs可降解关节软骨中的胶原蛋白、蛋白多糖和其他细胞外基质大分子，在骨关节炎的发展过程中起重要作用，软骨细胞外基质的主要成分为型胶原和蛋白聚糖，MMPs家族中MMP-2和MMP-9作为进一步分解代谢胶原裂解产物的明胶酶，近年来被认为与软骨损伤和退变的病理过程明显相关6-8。因此，MMP-2表达水平可以反映出软骨细胞破坏凋亡的水平。但目前KGN相关研究中未见有关人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞时MMP-2表达水平的报道，KGN诱导人骨髓间充质干细胞分化的软骨细胞是否具备良好的生物活性仍有待实验验证。实验体外培养人骨髓间充质干细胞进行KGN诱导分化实验，并检测MMP-2的表达水平。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 以细胞为观察对象的对照实验研究。1.2 时间及地点 实验于2014年5至8月在山东大学齐鲁医院完成。1.3 材料 骨髓间充质干细胞：Cyagen Biosciences (赛业生物科技有限公司)；骨髓间充质干细胞培养基：Cyagen；消化液：Cyagen；免疫荧光检测二型胶原试剂盒：博士德；MMP-2检测试剂盒：博士德；KGN (Kartogenin)：山东大学药学院提供；超净工作台：Boxun；倒置显微镜：Motic；CO2培养箱：SELECTA；荧光显微镜：Leica；酶标仪：北京朗普新技术有限公司。1.4 实验方法1.4.1 人骨髓间充质干细胞培养 从液氮中取出存放人骨髓间充质干细胞的冻存管，37 水浴解冻(3 min内完成)，经乙醇表面消毒之后在超净工作台里转移至15 mL无菌离心管中，用完全培养基清洗冻存管3次，全部转入15 mL离心管中，离心力250g离心5 min，弃上清，将细胞沉淀用培养基悬浮，转移至T25细胞培养瓶中，37 ，体积分数5%CO2培养。细胞长满T25培养瓶后，进行13传代。细胞传代至对数生长期时进行药物诱导。1.4.2 诱导实验 将等量的骨髓间充质干细胞按照密度2.0105/cm2分别传代至9个T25培养瓶中，并按表1分组情况标记，贴壁24 h后，加用DMSO稀释的KGN至终浓度为表1实验分组所示浓度，培养72 h。根据Kristen Johnson的研究，KGN浓度至100 mol/L时软骨细胞增生仍呈递增性表现，将本实验B组和C组的药物浓度设定为1 mol/L和10 mol/L。表1 实验分组情况表Table 1 Experimental grouping实验分组KGN终浓度编号空白对照组0 mol/LA1A2A3实验组1 mol/LB1B2B310 mol/LC1C2C31.4.3 实验结果观察与检测 镜检：药物诱导72 h之后倒置显微镜观察细胞生长情况；酶联免疫吸附实验(Elisa)检测MMP-2质量浓度：取诱导培养72 h后的细胞培养上清液，用试剂盒检测是否含有蛋白MMP-2，严格按照试剂盒说明书操作；免疫荧光检测型胶原：对各组细胞进行细胞爬片后免疫荧光法染色检测型胶原蛋白，严格按照试剂盒说明书操作。1.5 主要观察指标 镜下观察细胞生长情况、MMP-2表达水平及型胶原蛋白免疫荧光显示1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 5 Demo进行数据处理，3组间比较用one way ANOVA分析，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 细胞的形态学观察 倒置显微镜下可见大部分细胞呈梭形或不规则形贴壁生长，随着药物浓度的增加，细胞生长更加旺盛，融合增加，呈鱼群样聚集成集落(图1)。空白对照组细胞伸展较好，增殖较慢，排列于皿底呈铺路石状，细胞呈三角形、多角形或梭形，有明显突起，立体感较强。随着药物浓度的逐渐增加，细胞数目逐渐增加，排列紧密，形态逐渐变为细长，胞质丰富，细胞间隙愈加紧密，部分区域重叠生长形成细胞簇。组间差异比较明显。2.2 MMP-2质量浓度的检测 Elisa法检测各组样本中 MMP-2的吸光度A值，结果见图2。1 mol/L KGN组(B组)和10 mol/L KGN组(C组)软骨细胞培养上清中MMP-2水平较空白对照组(A组)明显升高(P=0.001，0.047)，C组与B组比较MMP-2水平明显降低(P=0.016)，统计学结果表明KGN浓度升高可明显降低样本内软骨细胞MMP-2表达。根据Elisa法检测各组样本中MMP-2的吸光度A值，经标准曲线换算为MMP-2的质量浓度值，检测结果显示随着KGN药物浓度增加，MMP-2的表达也随之降低(P=0.03)，见表2。2.3 型胶原蛋白荧光染色结果 免疫荧光染色结果显示，随着KGN浓度的增加，KGN能够明显促进型胶原蛋白的表达(图3)，细胞数目亦随着KGN浓度增加而递表2 各组细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)的质量浓度值Table 2 Concentration of matrix metalloproteinase 2 in cells in each group组别样本MMP-2质量浓度(ng/L)空白对照组A12 216A 22 237A 32 3481 mol/L KGN组B11 672B22 066B31 49310 mol/L KGN组C11 471C21 392C31 192增，呈短梭形或多边形，细胞膜及胞浆呈蓝色荧光，细胞核未见明显显示。荧光染色结果可知，KGN能够明显促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化和型胶原蛋白的表达，药物浓度为10 mol/L时较1 mol/L时作用更加显著，通过检测蛋白MMP-2的结果显示，随着KGN药物浓度增加，MMP-2的表达也随之降低，这一结果提示随着诱导药物浓度的增加，软骨细胞外基质的破坏水平也可能得到进一步抑制。空白对照组 1 mol/L KGN组 10 mol/L KGN组0.500.450.400.350.3050.100.050A值样本1 样本2 样本3图2 Elisa法检测各组样本中基质金属蛋白酶2(MMP-2)的吸光度A值Figure 2 Matrix metalloproteinase 2 levels in different groups as detected by ELISA method图注：结果显示小分子药物KGN诱导后软骨细胞培养上清中MMP-2 水平升高(P 0.05)，但KGN浓度升高可明显降低样本内MMP-2表达(P 0.05)。 B C A图1 小分子药物KGN诱导人骨髓间充质干细胞软骨分化后细胞形态变化(200) Figure 1 Morphological changes of human bone marrow mesenchymal stem cells under chondrogenic induction with Kartogenin (200)图注：图中A-C分别为空白对照组、1 mol/L KGN组、10 mol/L KGN组。 A B C图3 小分子药物KGN诱导人骨髓间充质干细胞软骨分化中型胶原蛋白的表达(免疫荧光染色，200) Figure 3 Expression of collagen type II during Kartogenin-induced chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells (immunofluorescence staining, 200)图注：图中A-C分别为空白对照组、1 mol/L KGN浓度组、10 mol/L KGN组。3 讨论 Discussion由于关节软骨自身修复能力有限，即使是小的关节软骨损伤也可能导致关节软骨退行性病变直至转归骨性关节炎9。而目前临床上的治疗软骨损伤和退变的药物及外科治疗方法皆无法获得理想的远期效果，寻找关节软骨组织的修复方法就成为运动医学专家关注的焦点。组织工程技术的出现为修复全层大面积的软骨损伤提供了全新的思路，通过种子细胞的分离培养，构建支架为细胞生长提供临时空间和预构三维形态，最终形成再生的软骨，已经取得了可喜的成就10。但该技术仍然存在技术操作的局限性，并且受到应力、微重力、氧浓度、细胞因子等众多因素的影响11-13。据Lim等14认为现有的治疗软骨损伤的方法的效果并没有显著的差别，在该作者的随机对照研究中，关节镜检并微骨折术的优良率为80%、自体骨软骨移植优良率为82%、组织工程化技术自体软骨细胞移植优良率为80%。近年来治疗软骨损伤和骨性关节炎的研究重点逐渐聚焦于组织工程技术中生物靶向调控药物的研发，如金属蛋白酶抑制剂、软骨细胞代谢拮抗药物、软骨细胞或其前体细胞的增生分化诱导药物。选择性基因转录调节小分子药物KGN从亚细胞水平调控软骨细胞的生化过程，在体外和体内实验中皆被证实具有明显的促软骨细胞分化增生作用，随着KGN得到愈来愈多研究软骨损伤与退变的学者们的关注，相关的科研成果近年来逐渐增多，奠定了KGN在软骨修复过程中“改变游戏规则者”的地位15。软骨细胞外基质的代谢失衡和降解是骨性关节炎的是关节软骨变性的重要基础，而MMPs对细胞外基质的降解作用被认为在骨性关节炎发病机制中发挥关键性作用。MMPs家族可分为胶原酶、基质溶解素和明胶酶等亚家族。其中MMP-1、8、13属于胶原酶亚家族，MMP-3、7、10属于基质溶解素亚家族，MMP-2和MMP-9属于明胶酶亚家族。关节软骨细胞外基质的主要成分为型胶原、其次为蛋白聚糖，MMP-1、7、8、10、13作用于型胶原使之变性，MMP-3则对蛋白聚糖有高度的裂解活性，MMP-2、9则对型胶原的代谢产物进一步降解。骨性关节炎的基础研究中证实，MMPs家族的多个成员在软骨细胞降解凋亡的病理变化密切相关16-18。在Kristen Johnson的研究中，对KGN诱导人骨髓间充质干细胞分化的软骨细胞样本进行了MMP-3和MMP-13表达水平检测，未发现这两种小分子标记物的表达增加。作者认为这一研究结果反映出KGN在显著促进人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的同时并没有加速软骨细胞的凋亡过程。多数KGN相关科研成果以蛋白聚糖及其代谢产物氨基聚糖(GAG)、润滑素(lubricin)、SOX-9、型胶原蛋白等小分子标记物评价软骨细胞增生程度，或者以动物实验中的软骨大体评分、病理切片评估软骨修复的效果19-21。而MMP-2在MMPs家族中表达最为广泛，易于检测，而且对维持软骨细胞的正常生理代谢功能同样具有重要的意义，近年来相关文献已经证实在骨性关节炎的软骨细胞中MMP-2表达水平显著升高22-23。但目前KGN的相关文献中未检索到MMP-2表达水平的变化的报道。因此作者选择MMP-2作为研究对象，进一步研究KGN诱导作用下人骨髓间充质干细胞分化的软骨细胞是否有MMP-2表达水平的变化，以评价该软骨细胞是否具有稳定的生物活性。实验结果证实了KGN对人骨髓间充质干细胞的软骨细胞分化定向诱导作用，软骨细胞增殖和型胶原的表达与药物浓度增加呈正比效应，跟Kristen Johnson的研究结果一致，MMP-2水平随着药物浓度的增加也出现表达降低，是目前有关KGN的系列研究中未被发现报道的，作者认为随着KGN浓度增加，其诱导分化的软骨细胞的数目也会随着增加，而测得的MMP-2水平反而随之降低，这一发现可以作为KGN能够促进软骨修复并进一步抑制其凋亡水平的另一佐证。在应用KGN作为骨性关节炎的治疗药物时需要对其作用浓度进行精确的控制，但由于本研究局限于体外实验，KGN的体内应用最佳浓度以及其他影响其诱导人骨髓间充质干细胞分化效应的因素仍然需要后续的大量动物实验进行进一步研究。作者贡献：王呈进行实验设计、杨伟巍进行实验实施，戴国锋、薄其玉进行实验评估。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验符合伦理学标准。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：戴国锋对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。7479ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Curl WW, Krome J, Gordon ES, et al. 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