对动物克隆技术的探索及研究.doc

对动物克隆技术的探索及研究 贺 鹏 程 （商丘师范学院 生命科学系 080911-2 班 080911011）摘要：动物克隆是目前生物技术领域研究的热点之一，具有重大的科学意义和应用价值。本文综述了动物克隆技术及其原理、存在的问题以及研究进展，并对克隆技术在相关领域蕴藏的巨大应用价值及发展前景进行了展望。根据现有动物克隆技术理论和实践，着重对该技术的应用和新的发展与探索进行了综述和讨论关键词：核移植、动物克隆、克隆技术、基因印记、器官移植一、关于动物克隆 克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程。 1997年2月27日，英国(Nature杂志，报道了英国罗斯林研究所Rodin Institute，Uk的威尔穆特(I.Wilmut)博士及其同事的题为“从胚胎和成年哺乳动物细胞繁衍后代”的研究论文。宣布了首次成功地运用成年母羊乳腺上皮细胞作为细胞核的供体的移植技术。克隆了1头名叫“多莉”的小绵羊。这篇论文，通过媒体传播后，立即引起世界广泛的关注与争议，成为震惊世界的头条新闻。【1】 自从“多莉”羊问世以来，“克隆”一词广为人知，动物克隆这一领域也逐渐成为生命科学的研究热点。目前，在动物界进行过核移植研究的主要有变形虫、两栖类、鱼类、昆虫、脊索椎动物和哺乳类等六大类动物。 克隆技术根据核供体的来源不同，可分为胚胎细胞克隆技术及体细胞克隆技术，包括胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植、胎儿成纤维细胞核移植、体细胞核移植。二、动物克隆的发展历史 2.1 胚胎细胞克隆阶段 胚胎细胞克隆是指所用供核细胞为发育至不同阶段的胚胎细胞进行克隆的技术。1952年，美国研究所的科学家将分化程度较高的囊胚细胞注入去核的卵中，得到重构胚卵裂并发育到蝌蚪，后让明经变态变成幼蛙，这是较早的成果之一。但到1983年，美国科学家利用核移植技术结合细胞融合方法获得了克隆小鼠才真正拉开了哺乳动物克隆的序幕。此后，其他科学家也相继成功地克隆出小鼠、绵羊、牛、兔等。 2.2 同种体细胞克隆阶段 在此阶段，所用供核细胞均属同物种的高度分化的体细胞。英国罗斯林研究所用成年羊高度分化的乳腺细胞进行了核移植获得了克隆羊“多莉”，这是第一次用成年体细胞作为供核细胞，说明高度分化的成年动物的体细胞可在适当条件下发生逆转恢复全能性，是生物技术史上具划时代意义的重大突破，是克隆技术的一个里程碑。 2.3异种体细胞克隆阶段 濒危物种数量日益减少，很难提供用于克隆的卵母细胞和代孕受体，促使科学家提出了异种克隆的设想：将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核(遗传物质)卵母细胞中，来得以实现克隆的技术。但此阶段技术还处在实验探究阶段，还没有完全成熟。【2】三、国内外克隆技术成果与进程 动物克隆技术发展历史悠久。早在1938年，Spemann就通过蝾螈胚胎分割实验证明了自己的核移植设想。 1952年，Briggs和King将青蛙卵进行核移植，获得重组胚并发育形成小蝌蚪。20世纪六七十年代两栖类，鱼类也相继克隆成功。 1981年，Hoppcs克隆小鼠成功标志首例哺乳动物克隆成功。随后，他采用显微去核和病毒介导相继获得克隆羊、克隆兔、克隆猪。 1996年，美国克隆猴获得成功，这是人类首次灵长类克隆成功，并引发克隆人与伦理争论。1997年，英国克隆绵羊“多莉”的诞生，标志体细胞克隆进入一个新的时代。1998年，Wilmut等利用核移植和转基因技术，成功获得转基因克隆绵羊。1999年，华裔科学家赖良学等通过基因工程和体细胞克隆相结合，成功获得“基因敲除”克隆猪。2002年，华裔科学家杨向中宣布成功获得具有两种人类凝血因子的“双基因”克隆猪。【3】 我国动物克隆技术早在上个世纪60至70年代就已开始。著名实验胚胎学家童第周曾用囊胚细胞进行鱼类核移植，并于70年代获得属间和种间核移植鱼，其利用的“核移植”技术即胚胎细胞克隆技术。20世纪90年代起，我国科学家开始进行哺乳动物克隆研究，并先后获得克隆山羊(西北农大)，克隆兔(1991年江苏农学院)、克隆牛(1995、1996年广西农学院、中国农科院畜牧所)和克隆猪(西北农业大学)，其中克隆山羊的研究和应用处于国际领先水平，只是供体细胞均为胚胎细胞。体细胞克隆方面起步比较晚，但这项技术目前我国已经与国际先进水平站在了同一起跑线上。【4】四、动物克隆技术原理与流程 早期，研究人员用受精卵作为受体细胞质。后来发现，成熟卵母细胞更适于用作核移植的受体细胞质，它能使各个发育时期胚胎甚至体细胞核的重构胚胎恢复到受精卵的状态，重新编序，正常发育到到期出生。完全去掉受体卵母细胞的核是进行细胞核移植克隆哺乳动物的前提。常用去核方法有盲吸法、半卵法和功能性去核法等。 由于通过胚胎作供核体移植培育克隆动物途径有局限性，故目前的大多数研究使用体细胞(已分化细胞)作为供核体。一个个体的体细胞的遗传物质是完全一样的，所以用其作供体，产生的后代完全一样。 目前，核质融合的最常用的方法是电融合法。将上述取得的核转移到已经人工去核的成熟卵母细胞卵周隙内，并施加微电流脉冲，使核质融合，形成重组胚。 重组胚胎首先经一定时间的体外培养，或放人中间受体输卵管内孵育。之后，将重组胚移入母体子宫，妊娠发育至分娩。【5】 目前对哺乳动物的克隆方法可分为以下几种：（1）胚胎分割：12胚胎移植妊娠率可达46，14胚胎移植妊娠率可达50；（2）胚胎干细胞的核移植；（3）胚胎细胞的核移植；（4）胎儿成纤维细胞核移植；（5）体细胞核移植；（6）胚胎嵌合。【6】五、克隆技术存在的问题 哺乳动物克隆近年来得到长足的发展，相继诞生了鼠、牛、山羊、猪等多种克隆动物，为家畜良种繁育、濒危动物拯救、人类疾病的治疗等开辟了广阔的前景。但哺乳动物克隆效率低下，克隆后代易出现一些表型异常，如呼吸和循环系统的问题、超重现象等。【7】克隆技术存在的问题具体有以下几方面：5.1 克隆效率太低， 克隆动物早衰严重 克隆动物健康问题很多，世界各地的克隆动物流产、夭折、畸形现象都非常严重。在克隆动物中常发生的发育异常有呼吸窘迫和循环系统的障碍，是导致克隆动物新生期死亡的主要原因。【8】核移植总体效率低，一般仅为1 6。这可能与供体核移人受体胞质后的重塑有关。供体核发生去甲基化、去乙酰化等多种变化，在核重塑过程中基因表达异常都可能导致克隆效率降低 。这说明应进一步明确供核基因组的甲基化和乙酰化与核移植胚胎发育的作用机制。克隆动物效率低与核移植胚胎细胞内的染色体异常、胚胎细胞凋亡、胚胎早期死亡、流产、胎盘发育异常 有关。重组胚胎的形态、发育潜能与胚胎细胞凋亡，囊胚的内细胞团之间，内细胞团同滋养层细胞之间的关系与细胞数量的比例之间关系及发育机制需进一步深入研究。染色体异常与核移植胚胎的妊娠失败和克隆动物的先天性畸形之间的关系尚不清楚。克隆动物早衰、存活率低现象是当今核移植技术的最大缺陷。而以成年体细胞核作核供体问题尤为严重，它突出表现为，孕期流产率高，围产期死亡率高，新生仔畜体重较重及出生后对环境适应性较差，出生后发病率高和畸形率高。这可能与核移植技术程序有关，对细胞膜和细胞超显微结构产生了机械和电击损伤以及一些物质对细胞产生的化学毒害作用，这些机理需进一步研究。5.2 端粒问题 在正常生理条件下的体细胞随着分裂次数的增加，端粒会逐渐缩短。克隆羊“多莉”细胞端粒较短，可能影响其寿命，据Shiels等报道克隆羊端粒较同年羊的短，据tian等报道以牛胎儿成纤维细胞作供体的核移植后代端粒比对照组长，Miyashita等报道克隆个体间端粒长度差异显著，Xu等的研究表明克隆动物端粒长度可以恢复，Lanza等报道体细胞克隆牛实验过程逆转了供体母牛体细胞的老化，端粒长度反而增加，克隆牛寿命延长，Kubota等指出，克隆胚胎流产不是端粒长短造成的。这一系列的研究结果表明，克隆后代端粒长度有差别。端粒长度可能不是造成克隆动物高死亡率的原因，在胚胎发育过程中的端粒机制还有待进一步深入研究。5.3 重新编程的问题重新编程的机制不明，缺乏基础理论支撑。有些学者认为卵母细胞内有重编程因子存在，也有学者认为，MPF和有丝分裂原激活蛋白激酶的活性与重编程没有直接调控关系。重编程程度尚不足以支持着床后胚胎的发育，需进一步探索核移植后重编程对克隆成功的影响因素。 最近的研究表明，重编程可能在核移植后的早期就已经启动，随着胚胎发育逐步深入会造成发育阻断或抑制，对不同阶段胚胎发育所需的最佳环境培养的深入研究有助于阐明重编程机制 。研究表明核移植后细胞核激活与早期胚胎原核发育类似，但基因组重新编程的机制详细信息尚不清楚。其中，MPF、核膜破裂和早熟染色体凝集在基因组重编过程中的作用还需明确。5.4 基因印迹机理不清 基因印迹是同源染色体上基因表达活性不同的遗传现象。基因印迹现象在哺乳动物的发育过程中普遍存在，它与胚胎的生长发育和胎盘功能等都有关系。有研究表明被检测的核移植胚胎基因表达不正常，也有报道核移植胚胎均有几百个非印迹基因表达异常。印迹基因异常表达是造成克隆动物不正常的原因。由此看来，合子前不完全重新编程影响着印迹基因和大多数非印迹基因的表达，从而导致克隆动物异常。基因印迹对核移植后基因组重新编程的影响不明确。基因印迹与动物克隆技术的成功及关系值得深入研究，克隆动物种属及其细胞的差异，不同种属动物的克隆难易不同，其中的原因目前人们还不清楚。5.5 克隆技术条件有待完善 动物克隆研究已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得很大进展，但该技术目前还很不完善，克隆机理性的相关理论研究还很薄弱。另外，克隆胚胎与正常胚胎发育有何异同；胚胎细胞超显微结构及其功能等；线粒体与核移植胚胎发育的关系；细胞核移植的克隆动物在发育生物学中的一些基础问题，如细胞核质关系、细胞核发育全能性和多能性等，对这些问题的深入研究，将有助于加深人们对动物胚胎发育过程中分子机制的认识。动物克隆技术的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。因此，要提高动物克隆的成功率尚需不懈的努力。【9】5.6 X一染色体灭活问题 雌雄哺乳动物的基因剂量补偿是通过灭活雌性动物的一条X一染色体来实现的。正常情况下，着床前胚胎的两条X染色体都活动。后来，上胚层中X染色体随机灭活，而滋养层细胞则专门灭活父系X染色体。Eggan等发现，小鼠克隆胚胎胚体的X染色体灭活方式是随机的；即体细胞中活动X染色体与灭活X染色体之不同的标志在核移植后被擦除了，重新发生随机灭活，但克隆胚的滋养层则保留了原有体细胞的X染色体灭活状态。然而，XRe等发现，死亡克隆牛X一连锁基因在同一器官中有的表达，有的不表达，说明X染色体灭活不完全。死亡克隆胎盘X染色体随机灭活，但活克隆为父亲X染色体灭活。【10】5.7 部分个体生理或免疫缺陷问题 目前大多数研究发现体细胞克隆动物有半数多有严重缺陷或是畸形，包括心脏、肺脏等器官携有罕见的缺陷，其中许多未出生就胎死腹中，或出生后不久突然死亡，出生后一周的死亡率最高可达100。还发现许多克隆动物胎盘畸形，大量脐带异常，或有严重的免疫缺陷。Hilll 克隆了13头牛，4头牛胎流产，3头出生时或出生后死亡，大部分牛胎或牛仔的肺脏畸形，心脏肥大，心室壁极薄，特大的胎盘充满了过多的羊水生物学家认为，克隆动物产生畸胎、器官缺陷、猝死等问题可能与遗传“印迹作用”受到破坏有关。除了“印迹作用”之外，产前及围产期死亡率增加可能与目前的体外培养有关，因为在体外培养胚胎的卵裂球核移植过程中也发现有类似的现象。比如：培养基中血清的存在，导致早期胚胎基因表达发生改变，可能会导致克隆动物出生重量增加，也可能是由于供体细胞DNA不完整，不具备发育的全能性，无法使克隆胚胎发育成完整的个体。这些原因都是研究人员推测而来的，真正确切的原因有待进一步研究。【11】5.8 破坏自然界的多态性 因为克隆动物的供体细胞可在体外培养繁殖数代，如用这些基因塑相同的细胞克隆动物，就会导致个体之间没有差异，使动物失去遗传的多样性，最终破坏了自然界的多态性。【12】六、动物克隆技术的应用前景6.1 培育优良畜种和生产实验动物 在动物杂种优势利用方面，哺乳动物的克隆技术费时少，选育的种畜性状稳定，通过克隆胚胎的方法能大量繁殖畜群中特别优秀的个体，而且易于优良性状的保存。同时，由于克隆是从细胞开始的，这将使不同地区之间的物种交流很便利。因此，通过克隆，可迅速使优良畜禽的基因进行整合，培养出优良的畜种，也可把所需基因全部拷贝下来，建立数目可观的具有相同遗传背景的与基因病相关的实验动物。6.2保护珍稀濒危动物 珍稀濒危动物一般都是受环境或内在医素影响繁殖力，因此个体数减少，但随着克隆技术的发展，将突破这些因素，大量无性繁殖个体将有利于它们种群的壮大和延续。同时，在“复制生命”过程中甚至可以用技术手段“存优去劣”，即去掉原物种的缺点，保留原物种的优势，从而有利于物种的优化。6.3 生产出能被人体接受的移植器官 器官移植可救人于生死之际，现代医学几乎能对所有人类器官和组织实施移植手术，但排斥反应和供应缺乏仍是难题。排斥反应的原因是组织不配型，导致相容性差。克隆技术可以改变动物器官组织相容性基因属性，从而降低对人类免疫系统的危害，甚至直接利用克隆技术生产出人类心脏、乳房、耳朵等各种组织器官，供临床使用。【13】6.4 科研方面 用转基因的方法可以将某一基因转化到细胞核基因组里，比如某一致癌基因。用同源基因重组的方法可以从细胞核基因组里去掉某一基因。用这些细胞的细胞核进行核转移克隆所得到的动物可以被用来研究这些被加入的基因或敲除的基因在整个动物体内的生物功能，从而研究一些基因的致病机理，对现代医学的研究提供难得的实验动物模型。【14】七、关于克隆人的思考 克隆人技术的难点必然被彻底地攻破，不论人们愿意与否，克隆人在本世纪必然会成为现实。只要规范其应用，克隆人技术不仅将为不育家庭带来福音，也为器官移植者和迄今临床上许多难以治愈的疾病带来治愈的希望。利用患者自身体细胞克隆出的胎儿的组织、器官，替代、修复患者功能衰竭或缺失的组织、器官，既解决了移植器官供体来源的问题，又不会产生排异反应，使患者避免冒患癌症的危险长期应用免疫抑制剂，对患者更加安全。利用自体细胞克隆出的胎儿的心、肝、肾、肺等器官替代严重病变、丧失功能的器官，可治疗这些器官功能衰竭的患者，有望使之完全康复。 利用移植自体细胞克隆的胎儿的胰腺组织，可用于治疗糖尿病患者。利用自体细胞克隆出的胎儿的神经组织，可以治疗外伤所致的神经损伤、瘫痪患者以及治疗帕金森氏病等神经系统疾病。利用自体细胞克隆出的胎儿的皮肤组织，可以治疗烧伤或其他原因引起的皮肤缺损，甚至美容。移植自体细胞克隆出的胎儿的角膜，可以修复患者病变的角膜，使因角膜病变而失明的患者重见光明。自体细胞克隆出的胎儿的造血干细胞，可用于治疗再生障碍性贫血、白血病、特发性血小板减少性紫癜，甚至艾滋病。由于胚胎干细胞可以发育成身体的任何组织、器官，利用患者体细胞克隆出的胚胎的干细胞，可以培养出肢体、耳廓等用于修复肢体、耳廓缺损的患者。动物克隆技术的成熟以及克隆人技术的发展，已使该技术应用于临床指日可待。【15】八、动物克隆的发展新趋势8.1 转基因克隆 转基因克隆即应用动物克隆和转基因技术，将目标基因导人动物体细胞，再通过胚胎性别鉴定，大量、高效生产出所期望性别的转基因动物。利用该技术可以进行DNA同源重组和CisTrans调控及基因定点突变，实现外源基因的定点整合一 ；也可以进行基因剔除、特异基因导入等操作，同时为基因功能分析、动物模型的建立以及疾病发生的基因机制的深入研究提供了新方法。据报道，我国已经开始将太湖猪的增瘦肉基因转染到猪胎儿成纤维细胞，再将其作为核供体进行克隆研究一 。英国科学家已经成功将水母的发光蛋白基因转入克隆猪，并充分证明转基因克隆技术的可行性。另外，美籍华人杨向中与台湾科学家合作，将两个治疗血友病的基因转入猪体细胞，并成功获得“双基因克隆猪”。该技术将成为21世纪创建遗传工程动物的主导性技术，该领域的研究将成为国际生物工程的竞争热点。8.2 重复克隆 以克隆动物的胚胎细胞或体细胞作为核供体，用其卵细胞作为受体进行再次克隆、并获得二代、三代及按此繁殖后代的过程即为重复克隆。目前，重复克隆应用在国外发展较为迅速，而且研究也比较深入。日本已连续成功获得克隆第六代牛胚胎，并获得了第三代成活牛犊。美国夏威夷大学的国际科学小组(1998)在Nature杂志上宣布采用成年鼠体细胞和卵丘细胞成功培育出三代共50余只克隆鼠，这是人类第一次用克隆动物的体细胞克隆出新的克隆动物一 。在我国，山羊核移植胚胎的重复克隆研究相对较为突出，可连续克隆5代，并获得成活后代总之，该技术的应用在动物迅速扩群、物种改良方面具有明显优势8.3 异种克隆 很多科学家在探索异种动物间细胞核移植、相近动物胚胎的寄养等方法中，发展起来一种新的克隆技术异种克隆。即利用濒危、珍稀动物体细胞或胚胎细胞作为核供体，然后以与之有相近亲缘关系的物种做代孕母体，大量孕育、繁殖该物种的过程。美国威斯康星大学的科学家(1998)利用牛的卵子作孵化器，成功地克隆出猪、牛、羊以及灵长目的猕猴等5个不同物种的胚胎，虽然胚胎最终还是全部流产，但也说明异种克隆具有可实践性。在我国，以陈大元院士为首的专家正在研究应用异种克隆技术保护大熊猫。其工作分为： 将大熊猫的体细胞核放入兔去核卵母细胞之中，形成大熊猫早期胚胎； 将囊胚放人猫的子宫中着床并发育成小胚胎； 检验大熊猫的胚胎能否在猫或黑熊的子宫中发育成新个体。目前，克隆大熊猫正在向第三步冲刺。总之，异种克隆技术的出现，对珍稀物种和仅存单一性别的濒危动物来说，这是它们延续种群的惟一希望。8.4 治疗性克隆治疗性克隆即将动物克隆和现代医学相结合，利用患者的体细胞作为核供体，去核人卵细胞作受体进行核移植，将重构胚胎培育到囊胚期，取出囊胚内细胞团胚胎干细胞系（Es），然后把它诱导分化成具有高生理活性的功能细胞，用于治疗性细胞移植当前，治疗性克隆研究主要集中在Es细胞研究，主要包括几个方面： 治疗性细胞移植：将定向诱导分化的成熟Es细胞，直接注射入血管或内脏实质中，应用于老年心脑血管疾病的治疗 组织或器官重建:以生物材料为构建器官的模型，然后将诱导分化的特定类型Es细胞移植上去，进行体外培养至器官形成。Oberpenning(1999)等成功重建了小猎兔犬膀胱； 去衰老研究：将定向分化的组织ES细胞移植入衰老的器官，以更新人体器官的衰老细胞，让患者青春永驻。总之，Es细胞也成为世界医学界研究的热点，在医学上具有不可估量的应用价值。【16】九、关于克隆动物的原则 我国虽然在动物克隆方面取得了很大成绩，但与英、美等国家相比我国在高等动物无性克隆方面还处落后地位。因此国家应从政策上坚定地支持克隆技术，加强对动物克隆技术研究的投资力度，同时应尽快制定国家发展动物克隆技术的目标、方向和战略。我国的克隆研究应重视将克隆技术应用于人体医学科技领域的研究；鼓励克隆技术为畜牧业发展、为生物医药开发作出贡献。另外应鼓励将克隆技术应用于珍稀动植物物种的保护。国家对克隆人问题的原则应该是：对用于医疗等正当目的的克隆人的研究和应用进行严格的管理和控制；禁止商业目的和其他不良目的的克隆人研究；认真研究克隆人问题，立即开始制定克隆人方面的政策和技术规范。【17】十、由动物克隆到“长生不老”（仅我个人之见） 既然我们已经看到了动物克隆的巨大作用，那么我们不妨这样来做假设：我们应用克隆技术在我们年轻的时候克隆几个体细胞，当然我们可以通过一些技术让这些克隆出来的自己没有思维，这样会不太违背伦理道德。之后，当我们年老，我们的所有器官衰竭，而我们克隆出来的身体却正好长成了年轻人，那么我们不妨将我们身体头以下的器官全部换掉，来个“头移植”，听起来有点恐怖啊。可是，我认为它是非常有可能实现的，其一，自己克隆出来的身体与自己没有排异反应，所以可以长期共存使用;其二，心脏移植、手指移植已成为家常便饭，“头移植”并无太大技术难度，并且，我们都知道我们的免疫功能主要是靠胸腺来实现的，一旦换上了新的身体，那么我们的免疫力也便大幅提升，疾病也便离我们远去，“长生不老”或者多活个二三十年应该不成问题。虽然其中也存在着一些问题，比如说动物克隆技术还不够完美、有关克隆人的伦理性问题、需要大量资金等等，然而，随着时间的延长，我的这个想法应该很快会被实现，人真的可以做到“长生不老”了，不是通过别的技术，这正是通过动物克隆技术实现的。综上所述，动物克隆研究已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得很大的进展。但该技术目前还很不完善，相关理论研究还很薄弱，我们应密切地注视着这项技术的发展及l变化，更加清醒地认识人类以及自身的命运，为正在进行和将要进行的克隆人研究和应用提供更完善的法律和道德规范，更好地认识克隆技术的作用和限度，更客观地评价和选择克