（植物学专业论文）绞股蓝细胞培养的初步研究.pdf

ab s t r a c t t h e c e l l c u l t u r e w a s s t u d i e d i n g y n o s t e m m a p e n t a p h y l l u m t h u n b ma k i n o t h i s p a p e r r e p o rt s t h e i n d u c t i o n a n d s c r e e n o f c a l l u s a n d i t a l s o e x p l a i n s t h e c a l l u s g r o w t h s o m e p h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r s a n d t h e s e c o n d a r y p r o d u c t i o n a c c u m u l a t i o n u n d e r t h e d i ff e r e n t c o n d i t i o n s t h e r e s u l t s we r e as f o l l o ws 1 b y e x p e r i m e n t s t h e o p t i m a l m e d i u m w as c h o s e n f o r t h e c a l l u s i n d u c t i o n a n d g r o w t h o f g y n o s t e m m a p e n t a p h y l l u m i t i s b s w i t h t h e a d d i t i o n o f 2 0 m g l 2 4 d a n d 0 5 m g l k t 2 t h e e ff e c t s o n t h e c a l l u s g r o w th b y t h e d i ff e r e n t f a c t o r s 1 i n t h e w h i t e l i g h t a n d t h e d a r k t h e c a l l u s g r o w t h w e r e f o r a b o u t 2 7 d a y s a n d t h e g r o w t h c i r c l e c u r v e w a s l i k e s i t c o u l d b e d i v i d e d i n t o l a g p h a s e e x p o n e n t i a l g r o w t h p h a s e a n d s t a t i o n a ry p h as e t h e c e l l g r e w m o r e r a p i d l y i n t h e w h i t e l i g h t t h a n i n t h e d a r k 2 i n t h e s o l i d c u l t u r e t h e i n o c u l u m q u a n t i t y o f 3 g f w 5 0 m l m e d i u m w a s b e s t t h e o p t i m a l c o n c e n t r a t i o n o f s u r o s e w as 3 0 g l a n d t h e o n e o f g l u c o s e w a s 4 0 g l a s t h e s o u r c e s o f c a r b o n t h e e ff e c t i v e n e s s o f g l u c o s e w as b e t t e r t h a n s u r o s e o n t h e c e l l g r o w t h t h e 0 0 5 a g a r o s e w a s b e s t t o t h e c e l l g r o w t h 3 i n t h e w h i t e l i g h t a n d t h e d a r k t h e c o n t e n t s o f s o l u b l e p r o t e i n t h e a c t i v i t i e s o f p e r o x i d a s e a n d s u p e r o x i d e d i s m u t a s e a l l s h o w e d t w o p e a k s o n t h e d i ff e r e n t d a y s t h e s o l u b l e p r o t e i n c o n t e n t w a s h i g h e r i n t h e w h i t e l i g h t 4 t h e s e c o n d a r y p r o d u c t i o n o f t h e c a l l u s w a s a c c u mu l a t e d p r i m a r i ly i n s t a t i o n a ry p h as e i n t h e w h i t e l i g h t a n d t h e d a r k t h e g s a p o n i u m c o n t e n t s w e r e a l m o s t t h e s a m e l e v e l b u t t h e fl a v o l o i d s c o n t e n t w a s h i g h e r i n t h e f o r m e r c o n d i t i o n 硕士学位论文 6 1 a s t l r s i i i l s i s i n t h e c a s e s o f t h e 3 g f w 5 0 m 1 m e d i u m i n o c u l u m q u a n t it y t h e 3 0 g l s u c r o s e o r t h e 4 0 g l g l u c o s e a n d t h e 0 1 a g a r o s e t h e s e c o n d a r y p r o d u c t s c o n t e n t s r e a c h e d t h e h i g h e s t l e v e l r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s c a l l u s i n d u c t i o n l i g h t p h y s i c a l a n d c h e m i c a l f a c o r s c e l l g r o w t h p h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r s fl a v o l a i d s c o n t e n t g s a o i n i u m c o n t e n t 硕士学位论文 八 认s i t r s 1 7 1 e s i s 第一章前言 绞股蓝 g y n o s t e m m a p e n t e p h l l u m t h u n b m a k i n o 又名七叶胆 为 葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物 茎蔓状柔弱横生 具多分枝 具棱 节 间疏生细毛或无毛 茎长3 5 米 粗4 6 毫米 大多为掌状复叶膜质 互生 柄长2 5 6 厘米 被着糙毛或无毛 叶大多为卵状披针型 也缘具锯齿 齿 头 具芒 t 0 绞 股蓝 广布于 我国 秦 岭 长 江以 南 地区 2 1 绞 股 蓝不 仅 营 养丰 富 而且具有比人参更广泛的保健 医疗价值 全草入药 生理活性广泛 对机体 调节免疫系统 抗肿瘤 降血脂 镇 静 痛 防衰老和延年益寿等均有良 效 深受人们青睐 被誉为 南方人参 长寿保健珍品 3 近几年来 许多学者 尤其国内 学者对绞股蓝进行了以下广泛的研究 1 绞股蓝植物活性成份的研究 1 1 绞股蓝植物的总皂贰及其含量 绞股蓝皂试 g s a p o n i n 是绞股蓝属植物的有效活性成分 其结构与人 参皂贰结构相似 自1 9 7 6 年日 本学者竹本常松等人发现该植物含有类似人参 皂贰以来 己经鉴定出8 4 种皂试 总皂贰含量高达 1 3 6 所有绞股蓝皂贰都 有达玛烷型的基本结构 如图 1 图1 绞股蓝皂贰的结构 绞股蓝总皂贰中的 6种与人参皂贰相同 构成绞股蓝皂贰的贰元共有 1 8 种 最主要的是原人参醇和原人参二醇 至今并未发现有原人参三醇 而人参 三醇组皂试和人参二醇组皂试对中枢神经分别有兴奋和抑制作用 所以绞股蓝 不具有人参那样的双重功效 这就是绞股蓝与人参药理作用的最大不同之处 4 1 1 5 1 不同种绞股蓝原植株所含的总皂贰含量不同 同一种绞股蓝原植物因产地 不同所含总皂试的含量有较大差异 同一产地的同种绞股蓝原植物的不同生育 期所含的总皂贰含量有所差异 盛叶期的总皂试含量高于其他各期 而不同种 的盛叶期的时间不同 同一株绞股蓝原植物的不同器官所含的总皂贰含量存在 差异 以叶的总皂贰含量为最高 6 1 7 1 1 2 绞股蓝的药理作用 中药绞股蓝因含有人参皂试 人们对它进行大量研究 药理与临床研究表 明绞股蓝有抗肿瘤 抗溃疡 抗疲劳 降血脂 免疫调节作用18 1 绞股蓝总皂 贰 g p s 有广泛的药理作用 近几年的主要研究成果是 g p s在心 脑 血管 方面的保护作用及其对血脂代谢的调节改善作用 1 2 1 心脑 血管方面的 作用 绞股蓝能 对抗氧自 由 基 对心脏的损伤 保持心肌细胞膜的完整性 9 1 改善 急性心肌缺血时 心肌舒张功能 1 o 还能 对抗心肌缺血所致心肌不 可逆坏死 使 s o d 活性升高 心肌释放p ic k 减少o q 绞股蓝水提物能松弛主动脉平滑肌 降低血压 对自由基损伤的主动脉舒 张 功能 有保护 作 用 12 1 能 明 显 改 善 脑血 管a c h 舒 血管 反 应 提高s o d 活 性 及 n 0 一 含量 抑制血管壁丙 二 醛生 成对 氧自 由 基所致的 脑血管 痉挛具 保护作用 t 13 1 绞股蓝对脑缺血有较好的保护作用 能显著提高脑细胞对急性缺氧的耐受 性 这可能与其能升高s o d 活性 降低p l a 2 活性有关 1 4 1 绞股蓝能降血脂 治疗动脉粥样硬化 g p s 能抑制甘油三脂升高 能显著 降低胆固醇 磷脂质 过氧化脂质 并提高高密度脂蛋白 从而使高脂血症得 到改善o 5 1 l e l i l 1 2 2抗诱变 g p s 有较强的 抗诱 变且具 有明 显的 量 一效关系 p a 1 2 3 抗衰老 绞股蓝既能促进生长发育 又能延缓衰老过程 主要与其提高s o d 活性 提高肌体免疫力有关 19 1 1 2 4 提高免疫 g p s 具有广泛的增强肌体免疫力的能力 可抑制排斥反应 对抗环磷酞胺 所致免疫力低下等等 1 9 1 1 2 5 神经系统 绞股蓝能对抗利血平化对动物的抑制作用 改善体温 活动性 体重的明 显下降 抑制海马5 轻基叫垛乙酸 5 h i a a 5 h t 的比值明显升高 使利血 平化小鼠 单胺递质回升 这说明g p s 可能发展为一种新型抗精神病药 2 0 1 1 3 绞股蓝植株的总黄酮及其含量 绞股蓝之所以 有如此神奇的治疗和保健功效 也是由于绞股蓝植株还含有 多种黄酮类化合物 许多黄酮类成分具生理活性 分析其与绞股蓝的现代药理 作用 可知二者在许多方面相符 绞股蓝中的黄酮类化合物的生理活性被忽视 是因为多年来人们注意力的焦点只集中于绞股蓝皂贰 特别是人参皂贰 我国 学者进行绞股蓝的药理作用研究多采用总提取物而非纯净皂贰 纹股蓝药理作 用可能与其所含的黄酮类成分有关 因此 研究绞股蓝中黄酮类成分具有一定 的现实意义 在1 9 8 7 年和1 9 8 9 年 刘国 樵和方乍浦等 在绞股蓝植物中 分别首次发现 商陆素 芦丁和商陆贰三种黄酮类化合物 这三种黄酮类化合物的结构式如图 2 2 1 1 e or2 图2 黄酮类化合物的结构通式 近年来对绞股蓝中的黄酮类化合物含量的研究报道仍然很少 王志芬用薄 层色谱法和紫外吸收光谱分析了两种绞股蓝植物茎不同时期的黄酮成分 结果 表明 两 种黄酮 类成分不甚一 致 含量 均以7 月 份最高 1 1 月 份最 低 2 2 1 李 兰芳等对河北引 种绞股蓝中的总黄酮进行了分析 2 3 1 从结果可知 不同时期的 绞股蓝的不同部位 均以茎的总黄酮含量最高 以8 月份盛叶期的绞股蓝的全 植株的总黄酮含量最高 1 绞股蓝的组织培养的研究 2 1繁育 江泽慧等通过组织培养技术在短期内获得了 大量幼苗 他们是用改进的培 养基诱导芽分化和生根 即 在 m s b a o 5 m g l和 m s b a 1 o m g l n a a 0 0 5 m g l 培 养基诱导芽分 化 后将 产生的不定芽转入1 2 m s i b a 2 m g l b a 0 0 5 m g l 生根 培 养基中 培养 试管苗 通 过炼苗 温室栽培即 可成活即 可 转栽 2 4 1 张航宇首次报道了绞股蓝悬浮细胞原生质体再生植株 他们利用绞股蓝幼 茎 在m s 2 4 d l o m g l k t o 2 m g l 固 体培养基上诱导 愈伤组织 愈 伤组织转移 到m s 2 4 d 0 5 m g l n a a 1 o m g l k t o l m g l 液体培养基中 振荡培养 建立悬 浮培养系统 将继代培养的绞股蓝细胞原生质体再生植株进行游离和培养后 将小细胞团转移到m s 2 4 d 0 5 m g l k t o l m g l 固体培养基上 长到0 5 c m 后 转移到 m s k t i o m g l 十 i a a o 5 m g l固体培养基上 出现的胚状体再转移到 m s 6 b a 1 o m g l i a a o 5 m g l的培养基上分化出 茎叶 最后在不含激素的 m s 培养基上发育成完整的植株12 5 1 2 2 愈伤组织的培养及其次生物质的含量 在组织培养中 对绞股蓝愈伤组织所产生的总皂贰含量的影响较大的是 激素 俞旭平在他的实验中 发现同时附加生长素和细胞分裂素 n a a 1 o m g l k t o 5 m g l 于 培养基时 所培养出 来的 愈伤组织的 总皂贰含量是最 高的 2 6 1 李春刚等发现皂贰含量随着b a 等细胞分裂素的量的增加 可使愈伤 组织分化加强 生长周期相对延长 皂贰生产和积累相应延迟 在实验中 她 同时附加n a a o i m g l 2 4 d 0 l m g l b a i o m g l 于m s 培养基中 结果证明培 养出 来的愈伤组织的总皂贰含量较为理想 2 7 1 对不同无性系绞股蓝原植株茎诱导产生愈伤组织测定其总皂贰含量 可 见不同产地的绞股蓝均有合成总皂贰类代谢产物的能力 只是在程度上有所差 别 同一产地不同株系绞股蓝愈伤组织的合成皂贰能力也有差别 原植株合成 皂试能力强的愈伤组织 仍含有较高含量的总皂贰 经原植株茎诱导产生的愈 伤组织 其总皂贰的含量大多高于原植物的皂贰含量 但均低于原植物叶的含 量 经原植物叶诱导产生的愈伤组织的总皂试的含量也低于原植物叶的含量 这些结果说明绞股蓝器官均有合成皂贰的能力 只是分配上的差异 从而造成 了原植物不同 器官皂贰含量上的差异 6 7 1 至今尚未见到有关对绞股蓝的愈伤组织的黄酮含量测定的报道 3 农杆菌介导的绞股蓝遗传转化研究 用发根农杆菌 a g r o h a c t e r i u m r h i z o g e n e s 转化植物 产生生长迅速 生产效能高而稳定的毛状根培养物 从而用于生产次生物质 已有不少报道 2 8 2 9 3 0 3 1 1 费 厚 满等 用发根农杆菌r 1 6 0 0 菌 株感染 绞股蓝叶外 植体1 0 天 后 在外植体切口处便出现毛状根 2 8 天后 转化率高达9 4 毛状根生长速度很 快 在无激素的m s 培养基中悬浮培养2 0 天 其生物量增加9 倍 并无愈伤组 织产生 毛状根中总皂贰含量约为自 然根的2 倍 在悬浮培养过程中 毛状根 向 培养基中 分 泌一 定 量的 皂贰 3 2 1 徐文昭 用1 7 种 工艺培养出 绞股 蓝毛 状根 并对组织培养的绞股蓝中皂贰进行了定性和定量分析 他筛选出两种培养工 艺 这些工艺得率较高 含量分别为9 9 1 5 和9 1 4 5 比自 然生态生长的绞 股蓝根和愈伤组织中的 含量均要高得多 3 3 1 综上所述 用发根农杆菌r 1 6 0 0 诱导的绞股蓝毛状根培养物具有生长速度 快 合成皂贰能力强 可以向培养基中分泌皂贰及培养基中无须补加外源激素 等特性 利用毛状根培养物来生产次生物质 将为开发利用绞股蓝皂贰提供一 个新的途径 4 前景与展望 随着分子生物技术与植物学研究的结合 在对绞股蓝的研究中将会用到更 多的分子生物技术 例如 利用基因工程技术从自 然界克隆分离出适应性基因 或优良品质的基因 把抗各种环境条件的性状导入绞股蓝植物中 就有可能改 良其品质 提高其产品和产量 目前有学者试图应用转基因技术把甜蛋白 t h a u m a t i n 基因导入绞股蓝植物内并表达之 来改良 绞股蓝的口味 而甜 蛋白还是一种低热量 安全无毒 甜味纯正的非糖类新型甜味剂 分子生物技 术还为从绞股蓝植物获取活性成分提供了 新的方法一转基因器官培养技术 常 用的有转基因器官培养和代谢途径的基因工程等技术 我国己 建立了绞股蓝毛 状根培养系统 但工业化生产还有待于深入研究 代谢途径是目 前研究的热点 并取得了 很大的 进展 3 4 1 相信不久也用于绞股蓝的 研究 总之 绞股蓝总皂贰应用范围不断扩大 已 使开发 利用绞股蓝成为一个 备受瞩目 的课题 随着分子生物学 基因工程方面研究的不断深入 进行工业 化生产以制备高品质的绞股蓝总皂贰的药物将为期不远 目前 可用的获得高细胞培养和次级代谢物产量的最令人满意的方法是两 步法 第一阶段尽可能地获得高水平的细胞生物量 第二阶段是使次级代谢处 于活性状态 大量生产次级代谢物 这样通过两步法 在离体条件下植物次生 代谢物的生产可以 达到或超过原植物的产量 从而达到商业化生产 植物本身 的遗传特性 生长状况 和形态分化等因素对所建立的细胞培养物中的次级代 谢物的含量有很大的影响 通过调节环境中的物理和化学因素不仅可以影响细 胞的生长量 还可以调控次级代谢物的合成和积累的程度 外界环境条件包括 光照 温度 搅拌以 及接种量的大小等 内环境条件包括培养基成分 前体 胁迫因子 通气和培养的成分的混合以及培养基的p h 值 随着因气候 环境 社会 经济 饮食因素而影响的疾病谱的改变 亚健 康的普遍 人口的老龄化 化学药对这些现代疾病己 经无能为力 传统医药在 医疗中发挥越来越大的作用 回归自 然成为世界性的潮流 也是现代社会发展 的必然趋势 但是 重金属含量和农药超标是我国中药材存在的问题 笔者认为植物细胞工程并结合其他生物技术将会是解决这个问题的途径 之一 因此 对绞股蓝 g y n o s t e m m a p e n t a p h l l u m t h u n b m a k i n o 的组 织培养方面做了一些初步的研究 以期为绞股蓝今后的进一步开发和利用提供 基本材料 本文以 绞股蓝幼嫩叶片为材料 初步探讨了光照 激素 理化等部分因子 对绞股蓝愈伤组织诱导和生长 以及对培养细胞中次生物质含量的效应 为获 得高水平的绞股蓝细胞生物量打下基础 第二章绞股蓝愈伤组织的诱导 1 材料和方法 1 1 实验材料 供试材料为实验室内 盆栽的绞股蓝 叹 v n o s t e m m a p e n t a p h l l u m t h u n b m a k i n o 幼嫩叶片 1 2 培养基 采用b 培养基 附加2 蔗糖及不同 浓度的2 4 d n a a 6 b a 和k t 调至 p h 5 8 加0 9 琼脂 在高压灭菌锅中下1 2 0 0 c 消毒 1 5 分钟 1 3 愈伤组织的诱导 取绞股蓝幼嫩叶片 用清水冲洗干净 在用 7 0 乙醇漂一下 放入 0 1 升汞溶液中消毒6 分钟 无菌水冲洗数次 将叶片剪成4 x 4 m m 大小的小方块 接种于附加有各种激素的b 培养基上 每日 光照1 0 1 2 小时 光强为1 0 0 0 r u x 温度为2 5 摄氏 度左右 2 0 天以后 统计各培养基中愈伤组织的诱导率 愈伤 组织的诱导率 愈伤组织的块数 接种外植体块数x 1 0 0 并观察愈伤组 织的生长情况 2 结果与讨论 2 1 植物生长调节物质对愈伤组织的效应 2 1 1 单因子的诱导作用 本实验选取了n a a 2 4 d 6 b a k t 等4 种生长调节物质附加培养基中 用幼嫩叶片作为外植体接种 观察不同植物生长调节物质分别在不同浓度下对 绞股蓝愈伤组织的诱导效应 培养 巧天后统计结果 1 n a a 的效应 n a a 的诱导效应见表 1 表 1 n a a 对叶片愈伤组织的诱导效应 t a b l e l e f f e c t s o f n a a n o c a l l s i n d u c t i o n n a a 浓度 m g 1 诱导率 生长势 注 一 死亡 0 0 2 0 5 1 0 2 0 5 0 0 3 3 33 8 9 5 5 6 3 3 6 8 1 1 0 0 7 1 7 从表 1 可以看出 差 一般 较好 旺盛 下同 不同浓度n a a的对绞股蓝叶的愈伤组织及其生长的作用 不显著 诱导频率不同 且愈伤组织生长缓慢呈黄绿色 2 2 4 d 的效应 2 4 d 对叶片愈伤组织诱导的效应见表2 e 表2 2 4 d 对叶片愈伤组织诱导的效应 t a b l e t e f f e c t s o f 2 4 d o n c a l l u s i n d u c t i o n 2 4 d 浓度 m g l 0 0 2 0 5 1 0 2 05 0 1 0 0 诱导率 生长势 0 4 0 十 5 7 5 7 5 9 2 9 8 1 8 5 8 3 从表2 可以知道 不同浓度的2 4 d 对叶的愈伤组织及其生长的影响 以 2 0 效果最佳 愈伤组织呈淡黄绿色 湿润 疏松 3 6 b a的效应 实验证明不同浓度的6 b a 对叶的愈伤组织的诱导不起任何作用 外植体 仍然保持绿色 没有很大变化 4 k t的效应 实验证明不同浓度的k t 不能诱导出叶的愈伤组织 外植体膨大 变形 变黄以至死亡 硕士学位论文 n t a s 7 t a s 1 1 i e s i e 2 1 2组合因子的诱导作用 表3 2 4 d 与k t 不同配比对愈伤组织诱导的效应 t a b l e 3 e f f e c t s o f 2 4 d a n d k t o n c a l l u s i n d u c t i o n 2 4 d x k t y 浓度 m g l 诱导频率 生长势 odcu 咋 一了 一了0口 1 0 0 2 1 0 0 5 1 0 1 0 2 0 0 5 7 3 1 1 0 0 2 0 1 0 2 0 2 0 8 9 6 8 1 3 结果表明 2 4 d k t 比 例较大更易诱导愈伤组织 且愈伤组织生长状况较 好 将表2 与表3 相比较 说明激素组合比单激素更能有效地诱导出愈伤组织 其中以2 4 d 2 o m g l k t o 5 m g l 诱导效果最好 愈伤组织湿润 均匀 疏 松 呈淡黄绿色 第三章不同理化因子对绞股蓝愈伤组织增殖的效应 1 材料和方法 1 1实验材料 绞股蓝愈伤组织由绞股蓝叶片诱导 继代而来 1 2培养方法 1 2 1 不同 光照对愈伤组织增殖的效应 以b 2 4 d 2 0 十 k t o 5 为基本培养基 实验中 每支试管分装5 0 m 1 培养基 每管接种量约为2 g 的愈伤组织 约2 5 下分别于有光和黑暗条件下培养 1 2 2不同理化因子对愈伤组织增殖的效应 培养基同前 实验中每1 5 0 三角瓶分装5 0 m 1 培养基 每瓶接种2 g 鲜重愈 伤组织 每日 光照1 0 1 2 小时 光强1 0 0 0 r u x 温度为2 4 0 c 左右 1 3 增殖鲜种的测定 接种后每隔三天 取不同光照下培养的愈伤组织 称重并计组织的生长量 鲜重 绘出愈伤组织增殖曲线 实验重复三次 取平均值 1 4生长速率测定 细胞培养周期中收集培养物称重 换算成每天每升增加的细胞鲜重毫克 数 即m g l d 表示细胞生长速率 实验重复3 次 取其平均值计算结果 2 结果与讨论 2 1 不同光照处理的变化 将绞股蓝愈伤组织分别置于光照和黑暗环境下进行继代培养 以鲜重增加 作为生长指标 作出图 3 二jq山只d lla八u 0 11 n n 八u ucn 的n州州司叻铀 李匕as门a ul 帜 侧节侧介黔易娜领 0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1 2 4 2 7 培养时间 天 c u l t u r e t i m e d a y s 图3 不同光照对愈伤组织生长的效应 f i g 3 e ff e c t s o f t h e l i g h t a n d t h e d a r k o n c a l l u s i n d u c t io n 从图3 可以看出 在光照和黑暗条件下 细胞增殖周期为2 7 天 培养细 胞的生长曲线均呈 s 形 并分为延迟期 0 一天 指数期 9 2 1 天 静止 期 2 1 2 7 天 在延迟期 细胞鲜重增加的速率较小 这可能是因为在操作过 程中 细胞受到器械的切割 消毒剂和灼烧等的损害 细胞的正常功能需要逐 步恢复 并且对新的环境 培养基 尚 未完全适应不能很好的吸收营养物质 从图3 还可以看出 在光照条件下 其细胞生长速率较快 在黑暗条件下 其生长速率较慢 这与郑光植 梁峥在三分三愈伤组织生长的研究中结论相似 13 5 1造成这种现象可能是因为光照能促细胞能促进细胞的生长 而黑暗相对抑 制了细胞的生长 2 2不同理化因子处理愈伤组织的生长变化 2 2 1不同浓度蔗糖对细胞生长的效应 由 表4可以 看出 在蔗糖浓度为2 0 4 0 g l 时 细胞生长最快 低于或高 此浓度范围 其细胞生长速率都将明显下降 表4 不同浓度蔗糖对细胞生长的影响 t a b l e 4 e f f e c t s o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f s u c r o s e o n c e l l g r o w t h 蔗糖浓度 9 鲜重 m g f w 0 1 0 2 0 3 04 0 5 0 死亡 生长率 m g l d 一 2 7 9 0 2 9 6 0 3 1 5 6 3 0 6 9 2 8 1 6 2 0 6 6 7 2 1 8 5 2 2 3 3 0 4 2 2 7 3 3 2 0 8 5 9 2 2 2不同的浓度葡萄糖对细胞生长的效应 表 5 不同浓度葡萄糖对细胞生长的影响 t a b l e 5 e f f e c t s o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f s u c r o s e o n c e l l g r o w t h 葡萄糖 9 鲜重增加 m g f w 生长率m g f w l d 1 02 03 0 4 0 5 0 3 2 2 95 7 8 0 2 3 9 1 9 4 0 5 0 3 0 0 04 2 8 1 5 6 1 7 3 4 5 7 2 6 5 0 9 3 4 3 7 2 6 表5 看出 以葡萄糖为碳源的培养基中 细胞生长率大于以 蔗糖为碳源的 在葡萄搪浓度为4 0 g 1 时 生长率最大 低于或高于此浓度 细胞生长率均下 降 这可能是葡萄搪比蔗搪更容易吸收利用的缘故 2 2 3不同浓度琼脂糖对细胞生长的效应 表6 不同浓度琼脂糖对细胞生长的影响 t a b l e 6 e f f e c t s o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f a g r o s e o n c e l l g r o w t h 琼脂糖 鲜重增加 m g f w 生长率m g f w l d 0 0 1 0 0 2 0 0 5 0 1 0 2 2 8 2 1 2 0 8 9 7 3 1 6 7 2 3 4 5 9 5 0 1 0 3 5 3 0 3 0 1 5 3 7 1 1 1 2 6 1 4 8 2 2 3 3 3 表 6 可以看出 向培养基中添加的0 0 5 琼脂糖能提高愈伤组织的生长率 低于或高于此浓度均不利于细胞生长 在本实验中 通过对绞股蓝细胞培养的一些基础研究 使培养细胞的生长 高于愈伤组织的生长 为进一步深入开展绞股蓝的培养研究打下了基础 第四章不同光照下的培养细胞生理生化的特性 1 材料和方法 绞股蓝愈伤组织接种后 每隔 三天取材一次 按1 2 v w 加双蒸水4 0 c 下 冰浴匀浆 低温离心 1 2 o o o r p m 2 0 分钟 取上清液供分析用 1 1可溶性蛋白质含量的测定 用 f o l i n 酚 试剂 法 3 6 进 行测 定 单 位为 毫克 克 鲜种 m g g f w 以 小 牛血清蛋白坐标准曲线 f o l i n 酚试剂甲 将溶液a 5 0 m l 与溶液b l m l 混合即成 现配现用 溶液a l g 碳酸钠溶于5 0 m l o l m o l l 氢氧化钠 液b 将1 硫酸铜和2 酒石酸钠等体积混合 f o l i n 酚试剂乙 在 1 5 l 容积的磨口回流瓶中 加入 1 0 0 g 钨酸钠 n a w 0 2 h 1 0 2 5 g 铝酸钠 n a 1 m o o 2 h 2 0 以 及7 0 0 m 1 蒸馏水 再加入5 0 m 1 8 5 磷酸 及 1 0 0 m 1 盐酸 充分混合后 接上回流冷凝管 以小火回流 1 0 小时 回流完 毕 加入1 5 0 8 硫酸锉 5 0 m 1 蒸馏水及数滴液体澳 开口 继续沸腾1 5 分钟 以 除去过量的澳 冷却后用蒸馏水稀释至1 0 0 0 m 1 过滤 滤液呈微绿色 置于棕 色试剂瓶中保存 使用时用标准氢氧化钠滴定 以酚酞作为指示剂 最后用蒸 馏水稀释 约 1 倍 使酸度为1 o m o l l o 1 2过氧化物酶活性测定 采 用 愈 创木 酚法 3 7 1 将培 养 细 胞的 酶 粗 提 取液 适当 稀 释 后 与愈 创 木 酚 一 一过氧化氢试剂反应 在分光光度计上准确记录下来反应了6 分钟的吸光率变 化 波长为4 7 0 n m 酶活性以每毫克鲜重每分钟吸光率的变化表示 即单位为 a m i n m g f w 1 3 超氧化物歧化酶活性测定 按b e a c h a m p 1 9 7 1 3 g 所建立 b e w l e y 等 1 9 7 9 3 9 1 改 进的 方法 以 抑 制氮蓝四哇 n b t 光还原反应达5 0 为一个超氧化物歧化酶活力单位 u g f w 反应混合液总体积为3 m 1 其中5 x 1 0 z m o l l 磷酸缓冲液 p h 7 8 1 3 x 1 0 m o l l 蛋氨酸 7 5 x 1 0 m o l l n b t 1 0 0 n m o 1 l e d t a以及 2 x1 0 翁o f l 核黄素 结果与分析 可溶性蛋白质含量的变化 蛋白 质是细胞中的重要组成成分 在细胞的生命活动中起着重要的作用 2 l 在培养细胞生长 分裂 分化的过程中 细胞的可溶性蛋白 质的含量也发生一 定的变化 在不同光照作用下 培养细胞中可溶性蛋白 质含量变化如图4 门 n oc卜匕d通n nu 11孟 澄 卿 匕 留 5衬uo但oou叫 口 d 一qnlos叫如妈扭幽到块甘 0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1 2 4 2 7 培养时间 天 c u l t u r e t i m e d a y s 图4 不同光照条件下可溶性蛋白 质含量 f i g 4 s o l u b l e p r o t e i n c o n t e n t s i n t h e w h i t e l i g h t a n d t h e d a r k 从图4 可以看出 在光照和黑暗条件下 培养细胞中可溶性蛋白质含量在 培养过程中均呈双峰曲线变化 这与杨和平等在马唐及其他植物的愈伤组织增 殖过程中研究的结果一致 4 0 14 1 4 2 j 4 3 在光照和黑暗条件下 两个峰值分别出 一 一闷夭七尹片 现在第1 5 天和第2 1 天 但黑暗条件下蛋白质含量较低 这可能是因为黑暗条 件下细胞生长速度和分化程度较低的原因 对照不同光照下愈伤组织增殖曲线 发现 蛋白质含量变化曲线与增殖变化曲线的变化相吻合 这说明了可溶性蛋 白质含量峰值的高低及出现时间的不同 可能与各自条件下细胞生长速度等因 素有关 因为只有细胞中合成大量的蛋白质 才能满足细胞快速生长的需要 2 2 过氧化物酶 p o d 的变化 在两种光照条件下 绞股蓝培养细胞中的过氧化物酶活力变化如图5 d人q乙1工r卜ba二9白n 1工10八ijncu 0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1 2 4 2 7 侧 誉 帜 众 卜甲百的 分 vood 只妈谧翠嘛划 培养时间 天 c u l t u r e t i m e d a y s 图5 不同光照条件下过氧化物酶活力变化 f i g 5 v a r i a t i o n s o f p o d a c t i v i t i e s i n t h e w h i t e l i g h t a n d t h e d a r k 过氧化物酶是高等植物体内的重要代谢酶 参与的反应与植物体内一些极 其重要的生理活动相关 如植物的抗机械损伤 抵抗病原物侵入 细胞的分裂 分化 组织器官的分化及生长发育 4 4 1 4 5 4 6 4 7 1 图5 表明 在黑暗和光照两种条件下 过氧化物酶活性变化曲线相似 在 愈伤组织继代初期 0 3 天 过氧化物酶活性上升 出现第一个高峰 是切割损 伤及接种所引起的一种反应 说明 这种酶在植物体内易被诱导 为诱导酶 4 8 1 第6 天开始 酶活力呈逐渐上升趋势 在培养的第 1 5 天 即细胞生长的指数 1 7 期 出现了第二个高峰 期间细胞主要处于不断地分裂分化的细胞指数期中 酶活性较高 之后有所下降 从培养细胞的过氧化物酶活性来看 细胞处于分化状态时 酶活性较高 而脱分化的细胞 酶活性较低 实验表明 过氧化物酶活性与细胞分化有关 2 3超氧化物歧化酶 s o d 的活性变化 不同光照下 超氧化物歧化酶活性变化如图6 所示 八uc06d 八乙nuq内od口乙 q妇11 几1 上1111 的 衬一 训护逻乙05 麦 之 塑华 5 0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1 2 4 2 7 培养时间 天 c u l t u r e t i m e d a y s 图6 不同光照条件下超氧化物酶活性变化 f i g 6 v a r i a t i o n o f s o d a c t i v i t i e s i n t h e w h i t e l i g h t a n d t h e d a r k s o d 普遍存在于动植物体内 被认为与植物叶片衰老 种子老化以 及植物 抗老化 抗盐 抗s o 0 等均有一定的关系 s o d 在控制脂质过氧化 减轻膜 系 统的 伤害 上 起保 护作 用 4 9 1 由图6 可以 看出 光照和黑暗条件下的活力变化相似 均出现两个高峰 细胞在其生长的延迟期的0 3 天期间 酶活性下降 随逐渐进入细胞生长的指 数期 酶活性呈上升趋势 在光照条件下 酶活性的第一个高峰出现在第 巧 1 8 天 而在黑暗条件下却滞后 3 天 即出现在第 1 8 天 这时候的培养细胞正处 于细胞生长指数期间 细胞分裂速度很快 此高峰的出现可能是s o d 与细胞分 裂频率有相关性 在两种情况下酶活性的第二个高峰都出现在第2 4 天 可能 是与培养基中营养物质消耗殆尽导致的细胞老化有关 是由于成熟 衰老过程 中氧自由基活动增强而产生的一种适应现象 即s o d 的抗衰老作用 第五章 绞股蓝培养细胞的总皂贰和总黄酮的初步分析 1材料和方法 1 1 实验材料 绞股蓝细胞无性系由绞股蓝幼嫩叶片诱导 继代而来 1 2 试验方法 1 2 1培养细胞中总皂贰的 初步分析 1 2 1 1提取 纯化及浓缩 参 考文 献 5 0 每 三天 取 培 养 细 胞 6 0 下 烘 千 研 细 称取l g 于索氏 提 取器中用甲醇回流6 小时 将甲醇抽干 用 1 0 1 5 m l 蒸馏水分次将残渣洗出 石油醚萃取去脂两次 再用水饱和正丁醇萃取5 次 合并正丁醇5 次 将其减 压抽干 用少量甲醇将残渣溶解 然后定容5 m 1 1 2 1 2定性分析 参考 文 献 5 0 根 据 皂 贰的l i b e r m a n n 反 应 l i b e r m a n n b u r c h a r d 反 应 氯 仿一 浓硫酸反应检识样品中的皂贰 l i b e r m a n n f a n 反应 将皂贰样品溶于乙酸醉中 加入浓硫酸几滴 观察 溶液的颜色反应 l i b e r m a n n b u r c h a r d 反应 将皂贰样品溶于氯仿 加入浓硫酸一 乙配 1 2 0 数滴 观察溶液颜色变化 氯仿一 浓硫酸反应 将皂贰样品溶于氯仿 加入浓硫酸后 观察氯仿层和 硫酸层的颜色 1 2 1 3定量分析 参考 何心亮的 方法 进行测定 f s i 取l o m l 的甲 醇 溶 液置具塞试管内 用热 风吹去溶剂 加香草醛冰醋酸溶液0 2 m l 高氯酸0 8 m l 混匀 密塞 置6 0 2 0 水浴加热 1 5 分钟 提出冷却至室温 加冰醋酸 5 m l 摇匀于 5 5 0 n m 波长处测 定光密度 与人参总皂贰所测得的标准曲线对照 求出总皂贰含量 1 2 2 培养细胞中总黄酮的初步分析 1 2 2 1 提取 纯化及浓缩 参考 文献 5 2 1 5 3 1 采用甲 醇回 流的 方法 提取绞股蓝黄酮 每 三天取 培养 细胞 6 0 下烘干 研细 称取3 g 于索氏 提取器中 加入甲 醇 水浴加热 温度控制在8 0 8 5 之间 回流约8 小时 将甲醇回流液过滤 滤液减压蒸馏 回收甲 醇 得到浓缩的提取物 取上述黄酮粗提物2 0 2 m g 加入4 m l 甲 醇 4 m l l 5 m o l l 盐酸 混匀 加热回流1 2 0 分钟后 冷却定容至l o m l 过滤 待 测 1 2 2 2定性分析 按文献 5 4 1 的方法进行 1 2 2 3定量分析 参照 庄向 平 5 5 的 方法 进行 测定 于5 1 0 波长处测定 吸光 值 与芦丁 所测定 的标准曲线作对照求出总黄酮含量 2 结果与分析 2 1绞股蓝总皂贰的定性分析 绞股蓝皂贰的基本化学结构为达玛烷型结构 皂贰与浓硫酸作用后 发生 分子内脱水 脱梭 氧化缩合 双键位移及形成多烯阳碳离子而显色 因此 能用浓硫酸试剂检识皂贰的产生 在l i b e r m a n n f a n 反应中 观察到了溶液的颜色变化 即从浅红到深红到 兰色到紫黑色 在l i b e r m a n n b u r c h a r d 反应中 溶液亦呈现浅红到紫色的颜 化 在氯仿一 浓硫酸反应中 氯仿层呈现红色 硫酸层有绿色荧光出现 这些 颜色反应表明 样品中有皂试存在 2 2 绞股蓝总黄酮的定性分析 黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚轻基及r 毗喃酮环有关 这些 基团遇f e a l 分别显污绿色 黄色 从而可以证明样品中有黄酮的存在 2 3培养细胞在生长周期中的总皂试和总黄酮含量的定量分析 1 总皂贰的含量 在培养细胞的生长周期中 从0 2 7 天分别测定可各期绞 股蓝总皂贰的含量 结果表明 皂贰的积累主要在培养细胞的静止期 见图7 从图中可以看出 在细胞培养的0 i 8 天 即培养细胞的延迟期和指数生 长前期 细胞中总皂贰含量均处于较低水平 1 8以后 即培养细胞的的指数生 长期末期和静止期 总皂贰含量达到最高水平 随着培养的继续进行 总皂贰 含量又逐渐降低 2 总黄酮的含量 在培养细胞的生长周期中 从0 2 7 天分别测定了各期绞 股蓝总黄酮的含量 结果表明 黄酮的积累主要在培养细胞的静止期 见图7 0 1 0 5 0 iu luo uo一尸 二po d卜 勺uo 的 冰 叫枕馒娜矛记 0 3 fi9 1 2 1 5 1 8 2 1 2 4 2 7 培养时间 天 c u l t u r e t i m e d a y s 图7 生长周期中次生物质的含量化 f i g 7 v a r i a t i o n o f s e c o n d a r y p r o d u c t i o n s i n t h e c e l l g r o w t h c i r c l e 从图7 中可以看出 细胞黄酮的含量变化与其皂贰含量变化相似 在细胞 2 2 硕士学位论文 6a s t r s i i i f s i s 培养的延迟期和指数生长期前期 培养基中营养物质丰富 细胞的初级代谢活 跃 可能次级代谢受到抑制 因而次生物质积累较少 在指数生长期末期 一 些营养物质被逐渐消耗而减少 初级代谢受到抑制 大部分细胞停止分裂 开 始分化 细胞内源激素水平发生改变 合成次生物质的前体物质的浓度增加 这些导致了次生代谢物的合成增强 培养细胞中次生物质的合成受基因控制 在整个生长周期中 基因的表达 可能是在一定形式的去阻抑和阻抑机制之下 基因表达的基理尚未完全弄清 楚 可能与培养条件有关 在工业化生产过程中 为了获得更大的经济效益 需进一步提高细胞系中 皂贰和黄酮的含量 细胞内皂贰和黄酮的合成受许多因素的控制 如何进一步 调整外源条件以开启合成皂贰和黄酮的基因从而提高两者的含量 是我们进一 步研究的方向 2 4 刊司 找职 丁 撞 养 细 胞 的 总 皂 贰 和 总 黄 酮 的 含 量 分 析 车 屠 瓢撇羲 量 如 表 7 表 7 t a b l e 7 不同光照下皂贰含量 g s a p o n i n c o n t e