（营养与食品卫生学专业论文）谷物中玉米赤霉烯酮酶联免疫检测方法的研究.pdf

天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集 体已经发表或撰写的成果内容。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 l 作者签名：刘漪 日期：妯堵年局驴日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天 津科技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：芡q 清 日期：如啦年；月冶日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 i ( 请在方框内打t v ，) ，在 年解密后适用本授权 书。 本学位论文属于- 不保密【曼( 请在方框内打“v ，) 。 作者签名：交心清 日期：肼扩年乡月功日 聊鹕：酸 醐一钆月? 日 摘要 本论文对生物毒素玉米赤霉烯酮的免疫分析方法进行了深入系统的研究， 合成出玉米赤霉烯酮的半抗原，研究了半抗原与载体蛋白结合的方法，制备了 高效价和高特异性的玉米赤霉烯酮抗体。通过对免疫分析形式与免疫分析的特 异性、灵敏性的关系以及谷物基质中干扰物对酶联免疫分析方法的影响，建立 了一种简便、快捷、实用的玉米赤霉烯酮免疫分析方法一一直接竞争酶联免疫 检测方法。此法灵敏度较高，i c 5 0 为0 0 6p g 】【g ，i c l 5 为0 0 1 g l 【g 。在对实际 样品进行检测的研究中，由于玉米赤霉烯酮广泛存在于各种谷物中，选取大麦、 小麦、玉米、燕麦作为研究对象考查了它们的基质影响及其去除方法。四种样 品经过甲醇提取后，大麦、小麦、燕麦样品的甲醇提取液用掩蔽剂稀释后可消 除基质影响，玉米样品的甲醇提取液直接用p b s 稀释后可消除基质影响。在 方法的准确性实验中，在3 0 ，6 0 ，1 2 0 肛g k g 三个加标水平上，直接竞争酶联 免疫检测方法的回收率在7 0 - 1 0 0 。 通过高效液相色谱检测方法，对建立的玉米赤霉烯酮直接竞争酶联免疫检 测方法的准确性进行了验证。两种方法检测结果具有较高的相关性，线性相关 系数r z 值为0 9 8 2 8 。 根据本研究，进一步开发并制成检测玉米赤霉烯酮的试剂盒。所研制的玉 米赤霉烯酮9 6 孔板式快速检测试剂盒检测结果稳定、准确，抗干扰能力强， 可用于大量样品的快速现场检测。 关键词：玉米赤霉烯酮；谷物；直接竞争酶联免疫分析法；高效液相色谱 。_ a bs t r a c t i nt h i s p a p e r ，t h ed i r e c tc o m p e t i t i v ee n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e d e l i s a ) m e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no fz e a r a l e n o n e ( z e n ) i nc e r e a l sh a d b e e nd e v e l o p e d w es y n t h e s i z e dah a p t e no fz e na n di n v e s t i g a t e dt h em e t h o do f c o u p l i n gt h eh a p t e nt oc a r r i e ra l b u m e n s t h ea n t i - z e na n t i b o d yw i t hh i g ha f f i n i t y a n ds p e c i f i c i t yw e r eo b a i t n e d t h ec d e l i s au s e di n t h i s s t u d ye x h i b i t e dh i g h s e n s i t i v i t y t h ei c 5 0a n di c l 5w e r e0 0 6 址g k ga n d0 0 1 肛g 】【gr e s p e c t i v e l y a s i m p l e ，r a p i da n de f f i c i e n te x t r a c t i o nm e t h o df o rt h er a p i dd e t e c t i o no fz e ni n c e r e a l sw a sd e v e l o p e dw i t hr e c o v e r i e sb e t w e e n7 0 - - 一1 0 0 m a t r i xe f f e c t sc a nb e a v o i d e dw h e nb a r l e y , w h e a ta n do a td i l u t e dw i t hs h e l t e rb u f f e ra n dm a i z ed i l u t e d w i t hp b s i no r d e rt ov a l i d a t ec d e l i s a ，s a m p l e sw e r ea n a l y z e db yh i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) s a m p l ee x t r a c t sw o r ea n a l y z e db ye l i s aa n d h p l c ，a n dt h er e s u l t so b t a i n e db yt w om e t h o d sc o r r e l a t e dw e l l ，t h ec o r r e l a t i o n w a s0 9 8 2 8 t h ee l i s am e t h o da n dt h er a p i de x t r a c t i o nm e t h o dd e s c r i b e di nt h i sp a p e ri s f e a s i b l ef o rp r e p a r i n ge l i s ak i t s ，w h i c hc a nd e t e r m i n ez e ni nc e r e a l sr a p i d l y t h i sr e s e a r c hw i l lb eu s e f u lf o rt h ed e v e l o p m e n to fa n t i z e ne l i s a k i t k e y w o r d s ： z e a r a l e n o n e ，c e r e a l s ，d i r e c t c o m p e t i t i v ee n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y , h p l c 。 目录 1 前言1 1 1 真菌毒素引起的食品安全问题1 1 2 真菌类生物毒素简介“3 1 2 1 玉米赤霉烯酮3 1 2 2 黄曲霉毒素抽“3 1 2 3 赭曲霉毒素：4 1 2 4 伏马毒素：- - - - - - - 4 1 2 5 单端孢霉烯族毒素一- - - - - - - - 4 1 2 6 杂色曲霉菌素4 1 2 7 展青霉素”5 1 2 8 串株镰刀菌素5 1 2 9 桔霉素5 1 3 玉米赤霉烯酮简介 5 1 3 1 理化性质及代谢6 1 3 2 毒1 生6 1 3 3 治疗及预防”8 1 3 4 玉米赤霉烯酮的限量o 8 1 4 玉米赤霉烯酮检测方法简介及其研究进展9 1 4 1 薄层色谱法9 1 4 2 高效液相色谱法9 1 4 3 气相色谱法1 1 1 4 4 酶联免疫检测法1 1 1 4 5 其他检测方法1 2 1 5 酶联免疫分析方法简介”1 3 1 5 1 酶联免疫分析方法原理1 3 1 5 2 酶联免疫分析方法的主要类型1 4 1 5 3 酶联免疫方法的建立1 5 1 5 4 多克隆抗体简介1 6 1 5 5 单克隆抗体简介1 6 1 5 6 重组抗体简介1 6 1 5 7 酶联免疫分析方法在食品检测中的应用1 7 1 5 8 酶联免疫分析方法研究现状”1 8 1 5 9 酶联免疫分析方法展望1 9 1 6 本课题的研究意义1 9 2 材料与方法2 1 2 1 实验材料- 2 1 2 1 1 主要药品和试剂：“2 1 2 1 2 仪器及材料2 2 2 1 3 待测样品2 2 2 1 4 常用溶液的配制? 2 2 2 2 实验方法2 3 2 2 1 玉米赤霉烯酮半抗原的合成：”2 3 2 2 2 人工免疫原( z e n k l h ) 的制备2 3 2 2 3 包被抗原( z e n o r a ) 的制备2 4 2 2 4 抗体的制备2 4 2 2 5 酶标抗原的制备”2 6 2 2 6 直接竞争酶联免疫检测方法的建立- “2 6 2 2 7 玉米赤霉烯酮抗体特异性的测定2 7 2 2 8 样品处理方法2 8 2 2 9 玉米赤霉烯酮直接竞争e l i s a 检测方法性能指标的评价2 8 2 2 1 0 仪器分析法确证2 8 2 2 1 1 玉米赤霉烯酮直接竞争e u s a 稳定性实验2 9 3 结果与讨论3 0 3 1 合成玉米赤霉烯酮半抗原3 0 3 1 1 玉米赤霉烯酮合成方法的选择”3 0 3 1 2 半抗原z e n - c m o 偶联物的表征3 0 3 2 人工免疫原的制备”3 1 3 3 抗体的制备3 1 3 3 1 抗血清效价的测定”3 2 3 3 2 抗体的纯化以及抗体浓度的确定”3 3 3 4 直接竞争酶联免疫检测方法的建立3 4 3 4 1 酶标抗原浓度优化3 4 3 4 2 直接竞争e l i s a 抗体包被浓度优化”3 4 3 4 3 直接竞争e l i s a 标样稀释液离子强度优化3 5 3 4 4 直接竞争e l i s a 标样稀释液p h 优化”3 6 3 4 5 玉米赤霉烯酮直接竞争e l i s a 标准曲线的绘制一”3 6 3 5 玉米赤霉烯酮抗体特异性的测定3 7 3 6 样品基质影响及消除3 8 3 6 1 不同提取方法、不同稀释倍数对实验结果的影响3 8 3 6 2 不同掩蔽剂对实验结果的影响3 9 3 7 样品处理方法的确定及添加回收实验及检出限3 9 3 7 1 不同提取方法对样品添加回收实验的影响3 9 3 7 2 样品处理方法的确定”4 0 3 7 3 样品添加回收实验4 1 3 8 四种样品的检出限4 2 3 9 玉米赤霉烯酮直接竞争e l i s a 检测方法性能指标的评价4 2 3 9 1 e l i s a 方法的检出限4 2 3 9 2 e l i s a 方法的精密度4 2 3 1 0 高效液相色谱法检测玉米赤霉烯酮4 3 3 1 0 1 高效液相色谱检测玉米赤霉烯酮标准曲线的建立j 4 3 3 1 0 2 样品处理4 4 3 1 0 3 玉米赤霉烯酮直接竞争e l i s a 检测结果与仪器分析结果的一致性4 5 3 1 1 玉米赤霉烯酮直接竞争e l i s a 稳定性实验4 6 。 3 1 1 1 抗体稳定性实验”4 6 3 1 1 2 酶标抗原稳定性实验4 7 4 结论4 9 5 展望5 0 6 参考文献5 1 7 攻读硕士学位期间发表论文情况5 8 8 致谢一5 9 m 了 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 真菌毒素引起的食品安全问题 食品中的毒素是目前人们极为重视的食品安全问题，目前对人类健康危害最大的 天然毒素是真菌毒素，常见的引起食物中毒的真菌毒素有数十种。真菌毒素不仅会引 起人和动物的急性中毒，而且还可以对机体产生严重的慢性伤害和致畸、致癌、致突 变的“三致效应刀。真菌毒素是侵染植物的真菌在生长过程中产生的可引起病理变化 或生理变态的有毒代谢产物。被真菌毒素污染的食品，可以通过直接进入食物链的方 式危害人类健康，也可由进食被真菌毒素污染饲料的动物，在动物体内蓄积，并通过 动物源性食品进入食物链，危害人类健康。因此，真菌毒素对于植物源性和动物源性 食品的安全都是严重的威胁，由于目前尚未研制出有效的脱毒措施，因此加强粮食和 食品中真菌毒素的监控，尽量减少被污染食品流入市场显得尤为重要i l 捌。 但是目前我国食品安全检测仍然以经典的、传统的常规检测手段为主，过程复杂， 耗时长，这些方法检测精确度高，但是时效性差，无法满足食品安全管理对检测方法 快速、高效的要求。因此，研究建立新型、快速、高效、灵敏的快速检测方法是及时 发现和防范食品安全问题的必然要求。 1 9 6 0 年6 月至8 月间，英格兰南部及东部地区死亡1 0 万只火鸡，解剖见肝脏出 血及坏死，肾脏肿胀。组织学检查发现胆管上皮细胞广泛增生。当时病因不明，称为 “火鸡x 病 。经过2 年多的研究调查，从饲料和巴西进口的花生饼粉中分离出黄曲 霉，进一步研究，发现正是黄曲霉产生的一种荧光物质造成火鸡的死亡，并将其命名 为黄曲霉毒素( a f l a t o x i n ) 。其后许多学者证明黄曲霉毒素不但引发急性中毒症，而 且长期少量食用可引起实验动物的癌症。这一结果被广泛重视，并由此带动了对食品 中常见真菌代谢产物的研究，在食品毒物学方面开辟了新的领域。1 9 6 6 年w h o f a o 首次规定了食品中黄曲霉毒素的最高允许量。1 9 7 3 年1 0 月，w h o f a o 召开的化学 污染会议将黄曲霉毒素的研究，列为1 6 个优先研究项目中的首要项目。1 9 7 6 年1 0 月在美国马里兰州召开第一届国际真菌毒素会议，2 9 个国家和地区的代表与会，会议 对黄曲霉毒素研究的动向进行了重点介绍和讨论。1 9 8 7 年，w h o f a o 、u n e p 在泰 国曼谷召开第二届国际真菌毒素会议，会上已经统计到5 6 个国家控制真菌毒素污染 的立法情况。除了对黄曲霉毒素普遍提出了控制标准，许多国家还制订了呕吐毒素、 赭曲霉毒素、t - 2 毒素、玉米赤霉烯酮等真菌毒素的最高允许量标准。 1 9 7 0 年以后，由于国际上对真菌毒素研究的进展和外贸部门提出必须对进出口粮 食提交真菌毒素的分析报告，卫生部开始将真菌毒素及其检测技术的研究列入重点科 研项目。1 9 7 2 年至1 9 7 4 年由中国医学科学院卫生研究所组织各省市卫生防疫站及有 关院校对2 2 个省、市、自治区的粮油食品中的a f b l 含量进行普查，采集、分析了约 3 万份样品。综合此次普查和毒理实验结果并参照国际通行标准，1 9 7 5 年全国食品卫 1 前言 生工作会议提出了我国第一份有关真菌毒素的强制性法规a f b l 最高允许量试行标 准，经过几年试行，于1 9 7 8 年6 月1 日作为国家标准( g b 2 7 6 1 8 1 ) 正式实施。鉴于 1 9 7 3 年全国小麦赤霉病的特大流行，卫生部组织了由江苏、上海等8 省市参加的赤霉 病麦科研协作组，对赤霉病麦中毒的病原菌、真菌毒素及检测方法，动物毒性试验及 卫生标准进行了广泛研究，分离出脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮两种真菌毒 素。近年来，有关单位对杂色曲霉毒素、赭曲霉毒素a 、三硝基丙酸、串珠镰刀菌素、 黄曲霉毒素m 1 以及丁烯酸内酯等真菌毒素先后进行了研究和区域性污染调查。 f a o w h o 、食品添加剂联合专家委员会( 肥c f ：a ) 及欧盟等国家都对赭曲霉毒 素a ( o t a ) 进行了深入研究，调查并评价了o t a 在各类食品中的污染水平及本国 居民o t a 膳食暴露量，制定出食品中o t a 的最大允许限量值，以保护本国居民的身 体健康。由于o t a 主要污染粮谷类食品，而我国又是农产品大国且饮食传统是以粮 谷类食品为主，因此o t a 对消费者健康可能构成潜在性危害，并可能对我国农产品 的进出口贸易产生影响。我国目前还没有关于人群o t a 膳食摄入量的评价研究，无 法评价o t a 对我国居民产生的健康危害，也不能采取有效的干预措施，保护我国居 民的身体健康和在国际贸易中的经济利益。在评价人群o t a 膳食摄入量时，食品添 加剂和污染物法典委员会( c c f a c ) 要求的分析方法的最低检出量要低于5 g k g 。 伏马毒素对玉米的污染率和污染水平受国家和地区、玉米品种、季节的影响。1 9 9 5 年至1 9 9 6 年，a m r a 等对从埃及不同省份收集的1 2 0 份样品进行了检测，结果显示， 冬季收集的白玉米和黄玉米f b l 污染率均为最高。伏马毒素还可以污染其他粮食及其 制品，且不同地区污染状况也存在差异。1 9 9 6 年我国对玉米、小麦等粮食作物中f b l 污染进行调查，发现不同地区均有不同程度污染。我国食道癌高发区的玉米中伏马毒 素污染率为4 8 。 由于我国传统饮食习惯中谷物比例大大高于西方，使得真菌毒素的危害更为突 出。在7 0 年代全国普查中发现在我国北纬3 1 0 线以南地区采集的玉米、花生、花生油 样品的阳性检出率为2 2 9 - 6 8 1 。1 9 7 3 年，湖北省黄岗、天门等1 0 县发生赤霉病中 毒3 0 0 0 余人，安徽省也有2 0 0 余人中毒。1 9 9 1 年安徽、河南部分地区因特大洪涝灾 害造成粮食霉变而在灾区农民中引起较大范围的真菌毒素中毒，一些地区的发病率超 过7 0 ，霉变小麦样品中，t - 2 毒素的污染阳性率为9 6 9 。 但是，由于经济社会发展状况的原因，我国目前对真菌毒素的卫生监控工作无论 是立法还是执法的水平都还与国外先进国家存在差距1 4 】。真菌毒素卫生监控的立法即 国家标准的建立由两方面组成：一是建立真菌毒素检测方法的国家标准，主要为真菌 毒素允许量国家标准的建立和卫生防疫部门的执法、粮油食品和饲料贸易的货物品质 分析以及对引起真菌毒素中毒的污染物进行病因分析提供技术手段；二是建立食品和 饲料中真菌毒素的允许量国家标准。这类标准属于强制性执行的法规，在制订过程中 除了依据毒理实验的结果，还必须进行相当规模的毒素污染调查，以确保与所订指标 切合实际，与国家农业生产，食品、饲料供应的承受能力相符。在黄曲霉毒素b l 允 2 。_ _ _ _ _ 天津科技大学硕士学位论文 许量国家标准的制订中就体现出这种矛盾。a f b l 是强剧毒性、强致癌性物质，单纯 从毒理学的观念看待食品中的a f b l ，检出即视为有毒，但也只能根据普查的实际情 况，暂时按照目前规定的标准执行。当然，国外也存在同样问题。1 9 6 6 年至1 9 7 5 年 间，w h o f a o 就连续3 次修订了食品中黄曲霉毒素最高允许量标准，将其从3 0 眺g 逐步降低至1 5 肛g k g 。欧盟则规定从1 9 9 8 年起进口花生原料中的黄曲霉毒素限量由 2 0 比g k g ，花生制品由1 0 汪g k g 统一降至4l , g 肚g 。 1 2 真菌类生物毒素简介 真菌毒素是一些真菌( 主要为曲霉属、青霉属及镰孢属) 在生长过程中产生的易 引起人和动物病理变化和生理变态的次级代谢产物，毒性很高。按化学结构计算，估 计有3 0 0 种真菌代谢产物对人类和动物是有毒的，可能还会有其他真菌毒素被相继发 现。代表性的真菌毒素有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、单端 孢霉烯族毒素、展青霉素、杂色曲霉菌素、串株镰刀菌素、桔霉素等【5 】。 、 真菌毒素可通过污染谷物和那些来源于被真菌、毒素污染了的饲料喂饲的动物性 食物( 如牛奶、肉和蛋) 而进入食物链。真菌毒素的化学、生物学和毒理学性质多种 多样，其共同毒性主要是致d n a 损伤和细胞毒性2 个方面。不同种类的毒素有其各 “ 自的特点，因此其毒性作用的差别也很大，取决于其摄入水平、暴露时间、动物种属、 身体状况以及饲料或食物中同时存在的真菌毒素之间的协同作用等。主要的毒性作用 “ 包括致癌作用、遗传毒性、致畸作用、肝细胞毒性、中毒性肾损害、生殖紊乱和免疫 。二抑制。真菌毒素的致病，有时以地方性发病的形态出现，所以，遇到原因未明的地方 性疾病，必须注意真菌毒素中毒的可能性睁加j 。 ? 1 2 1 玉米赤霉烯酮 玉米赤霉烯酮( z e n ) 具有类似雌激素的毒作用，主要作用于生殖系统，中毒的 病理改变主要表现为阴道和子宫颈黏膜水肿、卵巢发育不全等【1 1 】。它对人体也有潜在 的危害，能引起人的中毒，其中毒症状主要出现明显无力、头痛、头晕、呕吐、腹泻 和中枢神经系统的严重紊乱。在对大豆异黄酮和玉米赤霉烯酮对卵巢癌细胞株p e i m 增殖的影响中发现：z e n 对p e 0 4 细胞增殖的影响与雌二醇类似，在较低浓度8n m o t l 条件下9 6h 就能促进p e 0 4 细胞增殖，且显著相关。同时在珏n 对乳腺癌细胞m c f 2 7 及 r 4 7 d 细胞增殖的研究结果也表明z e n 可模拟雌激素作用，促进雌激素依赖性乳腺癌细 胞m c f 2 7 及t 4 7 d 细胞增殖，是一种有效的促进有丝分裂因子。最近研究表明，z e n 除 了对繁殖机能造成影响外，还具有免疫毒性、肝毒性和细胞毒性，且对肿瘤发生也有 一定影响【5 1 。 1 2 2 黄曲霉毒素 这是一类毒性极强的物质，尤其是a f b l ，其毒性是氰化钾的1 0 倍，具有强致癌 性和强免疫抑制性，即使在含量极低时仍具有很大的毒性【| 刀。 黄曲霉毒素中毒症状主要为发热、呕吐、食欲减退、黄疸，严重的出现腹水、下 3 l 前言 肢浮肿、肝脾肿大。急性中毒主要损害肝脏，表现为肝细胞坏死和胆管上皮细胞增生 等；慢性中毒则表现为发育迟缓、肝细胞变性甚至肝硬化等。 1 2 3 赭曲霉毒素 赭曲霉毒素( o c h r a t o x i n ) 是由曲霉属和青霉属产生的一组结构类似的有毒代谢 产物，主要危及人和动物的肾脏。赭曲霉毒素分为a 、b 、c 、d 四种，其中毒性最大、 与人类健康关系最为密切、对农作物污染最严重、分布最广的是赭曲霉毒素a ( o c h r a t o x i na ，o t a ) 。o t a 是一种具有强肾脏毒和肝脏毒的真菌毒素，并有致畸、 致突变和致癌作用。在目前已知的真菌毒素家族中，根据其重要性及危害性排序，o t a 被认为仅次于黄曲霉毒素而列于第二位。用免疫荧光技术对喂养o t a 的大鼠各脏器 的分析结果表明，肾、肝、脾、心肌、肌肉、肠管等组织中均含有o t a ，其中以肝细 胞和肾小管残留较多。除特异性肾毒性作用以外，o t a 还对免疫系统有毒性，并有致 畸、致突变和致癌作用。 1 2 4 伏马毒素 伏马毒素( f u m o n i s i n ，f b ) 是一种霉菌毒素，是由串珠镰刀菌( f u s a r i u m m o n i l i f o r m es h e l d ) 产生的水溶性代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成 的结构类似的双酯化合物。1 9 8 8 年，g e l d e r b l o n 等首次从串珠镰刀菌培养液中分离出 伏马毒素。随后，l a u r e n t 等又从伏马毒素中分离出伏马毒素b 1 ( f b l ) 和伏马毒素 1 3 2 ( f b 2 ) 。f b 是一类细胞毒素，也是致癌物质，其中f b l 毒性最强，是一种较强的 肝脏、肾脏毒，但作用机制尚不明确。f b 通过抑制髓鞘醇酰基转移酶的活性而破坏 鞘磷脂的代谢，它还具有抑制一些细胞酶活性的作用，其后果是抑制了鞘磷脂、蛋白 和尿素的代谢。其致癌机制则是髓鞘碱基的堆积导致d n a 的非时序性合成【1 0 1 。另外， 被f b 污染的粮食常常伴有另外一种非常重要的霉菌毒素黄曲霉毒素的存在，这 更增加了对人和牲畜危害的严重性。 1 2 5 单端孢霉烯族毒素 单端孢霉烯族毒素包括t - 2 毒素和d o n 毒素等。在这类真菌毒素中，t - 2 毒素的 毒性最强：可抑制细胞蛋白质、d n a 的合成；干扰能量代谢、脂质代谢；具有相当 强的免疫毒性作用，可致畸、致癌；对细胞膜有较强的毒性作用，可导致溶血；可致 骨髓坏死、白细胞减少和软骨组织退行性变化等。在人类、动物中均有t = 2 毒素中毒 事件的发生。虽然d o n 毒素的毒性低于t - 2 毒素，但d o n 的毒素污染更为广泛。毒 索引起的急性中毒即赤霉病麦中毒症早在1 9 世纪世界各地就有记载，主要表现为头 痛、头晕、呕吐、腹泻和中枢神经功能紊乱等症状，其在前苏联被称为“醉谷症一， 在西欧被称为“醉黑麦病 。中国也早有记载，并指出此病多发生在江南潮湿地带。 目前已经确认d o n 毒素是赤霉病麦中的主要毒素。 1 2 6 杂色曲霉菌素 4 天津科技大学硕士学位论文 杂色曲霉菌素( s t ) 在自然界中广泛存在，因结构与a f b 相似，且可以转化为 a f b ，因此其毒性和致癌性受到世界各国的高度重视。s t 急性中毒的病变特征是肝、 肾坏死；亚急性与慢性毒性中毒特征性病变是皮肤和内脏器官高度“黄染 ，马属动 物“黄肝病 实质就是s t 中毒。许多试验已经证明，s t 是继a f b 之后具有较强致 癌作用的因子。据调查，在肝癌高发区居民的食物中，s t 污染较为严重1 8 j 。 1 2 7 展青霉素 展青霉素( p a t ) 具有较强的毒性，小鼠经口l d 卯为1 7 4 8m g k g ，皮下注射 为5 7 - - 2 5m g k g 。它是一种神经毒物，且具有致畸性和致癌性。p a t 急性中毒表现 为胃肠道充血扩张、水肿、出血和黏膜溃疡【1 2 1 3 1 。 1 2 8 串株镰刀菌素 在全球范围内，串珠镰刀菌是污染玉米等粮食作物的主要真菌，能产生多种毒素 并给人类和动物造成很大的危害。研究表明，串株镰刀菌素( m o n ) 对人和动物有强 烈的毒性，并以心血管系统损害为特征。m o n 对动物有较强的毒性作用，主要作用 于增殖活跃的细胞，如肝、脾、心肌、骨骸肌和软骨细胞等，抑制细胞蛋白质d n a 的合成，干扰细胞分裂增殖，对生物膜通透性和各种酶活性有明显影响，同时引起机 体过氧化损伤。 1 2 9 桔霉素 在红曲霉发酵晚期，易产生一种具有神经毒性的次级代谢产物桔霉素。桔霉 素是毒性很强的真菌毒素，它能引起肾毒性，导致肾脏肿大、肾小管扩张以及上皮细 胞坏死。此外，还发现其有致畸作用，但并非所有的红曲霉都会产生桔霉素。例如， 日本的研究人员用毛红曲霉、红色红曲霉、紫色红曲霉可以生产出不含桔霉素的产品。 桔霉素的产生与生产方法、工艺条件有关。 1 3 玉米赤霉烯酮简介 玉米赤霉烯酮( z c 砌c n o n c ，z e n ) 又称f 2 毒素，是由多种镰刀菌产生的一种 非类固醇结构，具有雌激素活性，主要对动物繁殖机能造成影响。z e n 是2 ，4 - 二羟 基苯甲酸内酯类化合物，化学名称为6 枷习臣基缶氧基碳烯基扣b 难掩| 酸碓r 棚旨r 殂! n 最初是从污染了禾谷镰刀菌的发霉玉米中分离得到，其主要产毒菌株为禾谷 镰刀菌和大豆镰刀菌。此外，粉红镰刀菌、尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、串珠镰刀菌等 也能产生z e n 。饲料和食品生产中所用的谷物( 如玉米、小麦等) 是冱n 产生的最好 基质，也广泛存在于豆类及其制品中。谷类原料在田间、收获过程i 收获后储藏期间 以及饲料和食品成品储存、使用等诸多环节中，都有可能受到硎的污染。p l a c m t a 等对二十多个国家的谷物和动物饲料及饲料原料中的霉菌毒素污染情况作了调查研 究，发现大多数国家的谷物和动物饲料中都不同程度地受到亚n 的污染。同时z e n 不 仅可直接污染谷类等作物，进而直接进入人或动物体内，还可通过被污染的肉、奶等 5 1 前言 动物性食品进入人体，危害人和动物的健康，造成巨大的经济损失。而且其本身具有 分布广、繁殖快、耐热、代谢产物多、毒性大、残留时间长、难处理等问题，正在引 起全世界的关注。 1 3 1 理化性质及代谢 z e n 最初于1 9 6 2 年由s t o b 等【1 4 】从污染了禾谷镰刀菌的发霉玉米中分离得到。 z e n 为白色晶体，分子式c 1 s i - i z 2 0 5 ，熔点1 6 1 - - - 一1 6 3 ，不溶于水，溶于碱性溶液、 乙醚、苯及甲醇、乙醇等。其甲醇溶液在紫外光下呈明亮的蓝色荧光。z e n 为2 ，4 - 二羟基苯甲酸内酯类化合物，具有雌激素活性。z e n 主要有两条代谢途径与葡萄糖醛 酸结合，还原为玉米赤霉烯醇( z c a r a l c n o l ，z e l ) ，z e l 有两种非对应立体异构体a 和b 。a = z e l 熔点较低( 1 6 8 - - 1 6 9 ) ，而b z e l 熔点较高 1 7 4 - 1 7 6 ) 。前者 的雌激素活性比z e n 高3 倍，后者与z e n 活性相同。 1 3 2 毒性 z e n 是谷类作物中常见的一种霉菌毒素，其对作物的污染可能给农业生产带来损 失，更重要的是，由于征n 具有拟雌激素作用、生殖发育毒性和免疫毒性，对肿瘤 发生也有一定影响，对动物和人类的健康可能产生较大危害。 1 3 2 1 对植物的影响 z e n 侵染作物主要是由于作物的耕作、收获、运输和贮存期间温度适中而湿度较 高时镰刀菌滋生产毒所致。镰刀菌的生长、产毒与环境条件关系密切，其最适生长温 度为2 0 , - - - 3 0 ，最适湿度为4 0 。在冷暖交替时镰刀菌产毒能力较强，秋收季节常 有显著的温度变化，可为镰刀菌的生长和产毒提供适宜条件【1 5 1 。有报道表明在美国、 加拿大、日本等国，z e n 污染玉米、小麦、燕麦和大麦的情况较为普遍。 z e n 对植物具有多方面的生理效应。在组织培养中，低浓度的z e n ( 0 1 1m g k g ) 可促进愈伤组织的形成和生长，促进再生植株的营养生长及茎尖分化：而高浓度的 z e n ( 1 - - 1 0m g k g ) 则可抑制愈伤组织的形成和生长1 1 6 】。 z e n 的生长情况与冬小麦的春化作用有关，当z e n 的积累量达到高峰时，标志 着春化作用的完成。冬小麦、玉米、棉花等作物内z e n 的含量，无论是雌蕊、雄蕊 都以开花时达到高峰，表明它可能与授粉、受精有判1 7 】 1 3 2 2 对动物和人的影晌 z e n 可直接污染谷类等作物，从而进入人或动物体内，也可通过被污染的肉、奶 等动物性食品进入人体。 ( 1 ) 生殖发育毒性 z e n 能与雌激素受体结合表现出弱雌激素活性，造成动物体内生殖激素紊乱，从 而破坏动物生殖发育系统，对动物繁殖机能造成严重的影响。在所有动物中猪对z e n 最为敏感。k o r d i c 等研究表明，在饲料中添加2 2m g k g 的玉米赤霉烯酮，显著降低了 青年母猪的繁殖能力。z e n 对猪繁殖能力的影响主要表现为生殖器官出现异常变化， 6 。_ 天津科技大学硕士学位论文 如阴唇红肿、乳头肿大、包皮肿大以及出现发情症状、不孕、假孕、流产、死胎、公 猪性欲降低等。m i n e r v i n i 等【1 8 】从3 2e 1 龄开始对公仔猪饲喂z e n ，在其1 岁时，发现公 猪的精液浓度显著降低，而且睾丸发生萎缩。母仔猪则表现为卵母细胞不能正常成熟， 染色体出现异常现象。 早在1 9 2 8 年，n u t t 等【1 9 1 就发现用发霉的玉米喂养猪易发生雌激素综合症，表现为 外阴和乳腺肿大，有的出现阴道和直肠脱垂。 1 9 8 8 至1 9 8 9 年，内蒙古的两个村发生了一种不明原因的乳房肿大症。病人的主要 症状为乳房肿大、疼痛，女性病人还有月经紊乱。病区母猪也有乳房肿大，还有流产、 死胎和产仔畸形等现象。从病区主食荞麦中分离到镰刀菌，其侵染率( 3 4 ) 显著高 于非病区荞麦( 1 ) 和小麦( 2 ) ，且病区养麦试样提取液中可检出z e n ，含量为 7 5 一2 0 0m g k g ，而非病区荞麦和小麦中未检出。 ( 2 ) 肝毒性 在大鼠肝细胞体外培养液中加入0 1 5 1 5 1 0m g m lz e n ，可使培养液中自蛋白 及细胞内d n a 含量下降刚，表明z e n 对体外培养大鼠肝细胞有损伤作用。 每日经口给予家兔z e n ，在第七天和第十四天，低剂量组( 1 0m g k gb w ) 碱性 磷酸酶( a l p ) 显著升高，高剂量组( 1 0 0m g k gb w ) 丙氨酸氨基转移酶( a l t ) 、 天冬氨酸氨基转移酶( a s t ) 、碱性磷酸酶( a l p ) 、丫- 谷氨酰胺转移酶( g g t ) 以 及乳酸脱氢酶( u ) ) 显著升高【2 1 】。 给雌性大鼠腹膜内注射z e n ( 1 1 5 - - - 5 1 0m g k gb w ) ，4 8h 后触玎、a s t 、创l p 、 血清肌酐、胆红素等生化指标，以及红细胞压积、平均红细胞容积( m c v ) 、血小板 和白细胞等血液学参数发生改变，表明z l z n 有一定的肝毒性，对血凝过程也有一定损 ? 害作用【捌。 ( 3 ) 细胞毒性 z e n 能与雌二醇受体结合，同时殂n 在体内还具有氧化性，导致脂质氧化，抑制 细胞内蛋白质和d n a 的合成，导致细胞死亡团l 。研究表明，巫n 和玉米赤霉烯醇对牛 卵母细胞减数分裂具有负面影响，可抑制卵母细胞的正常生长 2 4 1 。z e n 对v e r o 和 c a c o 2 细胞也产生严重的毒性作用。e s s e f i 等i z 5 】研究表明，z e n 导致d o k 、v e t o 、c a e o 2 细胞d 蜥裂，细胞萎缩及细胞周期紊乱。e s s e f i 掣冽也报道，z i n 造成v e r o 和c a c o 2 细胞周期紊乱、抑制其蛋白质和d n a 的合成以及增加细胞丙二醛的生成，从而降低 v e t o 和c a e o 2 细胞发育和生存能力。 ( 4 ) 免疫毒性 以拌饲方式给予小鼠1 0m g k gz e n ，可显著降低小鼠对单核细胞增生李斯特氏杆 菌的抵抗力，但未引起组织病理学改变 2 7 1 。已知t 细胞依赖性巨噬细胞对早期防御李 斯特氏菌有重要作用，宿主随后的抵抗力是由t 细胞介导的，并伴有特定致敏t 细胞和 活化的巨噬细胞的产生。在有殂狲存在时用十四烷酰醇乙酯( p m a ) 作用于胸腺瘤细 胞系e l u ，z e n 能显著升高e l 2 4 的白细胞介素2 ( 如) 和白细胞介素5 ( 如) 的水平 7 1 前言 【硎。z e n 能抑制植物血凝素刺激的血淋巴细胞增殖。 ( 5 ) 对肿瘤发生的影响 s c h o e n t a l 2 9 l 在进行致癌实验时发现，试验组大鼠出现由致癌剂处理而诱发的肿 瘤，此外，试验组大鼠还发生了乳腺的腺纤维瘤、腺瘤、腺癌，垂体腺癌，睾丸间质 肿瘤以及子宫纤维瘤等。在其他致癌试验中也有类似情况发生，这些肿瘤所涉及的器 官表明它们可能与动物饲料中的雌激素物质有关。因此s c h o e n t a l 认为它们是由污染饲 料的巫! n 或其代谢产物引起的。 t o m a s z e w s k i 等【3 0 1 在增生和乳腺癌发生的妇女子宫内膜中检出了z e n ，而正常子 宫内膜中未检出，提示压! 瞰于子宫腺癌的发生可能有一定作用。 以上研究表明，墨 n 对肿瘤发生有不同的作用，这可能与z e n 的剂量、人或动物 暴露于z e n 时的年龄及种属差异等因素有关。 1 3 3 治疗及预防 1 3 3 1 治疗 目前，对于动物玉米赤霉烯酮中毒尚无特效药治疗，生产中应立即停止饲喂可疑 饲料，并对饲料加以检测，确定饲料中是否含有玉米赤霉烯酮。对于已经中毒的家畜， 为了减少损失也应给予一定的治疗。对于急性中毒的动物，可采取静脉放血和补液强 心的方法。具体的方法是使用n a 2 s 0 4 配成的1 0 的浓度一次性内服，并根据动物的种 类和大小不同从静脉