（麻醉学专业论文）七氟烷预处理对急性肺损伤大鼠的肺保护作用.pdf

一 一 徐州医学院硕士学位论文 缩略词 a l i a r d s a i b s a b c l 2 c a s p a s e d a b f a s f a d d f c m h e l p s m a c p b s t u n e l t n f a 吣 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文全称 a c m el u n gi n j u r y 中文全称 急性肺损伤 a c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e急性呼吸窘迫综合征 b o v i n es e r u ma l b u m i n 凋亡指数 牛血清白蛋白 b c e l ll y m p h o m a l e u k e m i ag e n e 2 b 细胞淋巴瘤 白血病基因 2 c y s t e i n ea s p a r t a t e s p e c i f i cp r o t e n i n a s e 天门冬氨酸特异性半胱氨蛋 白酶 d i a m i n o b e n z i d i n e二氨基联苯胺 f i b r i na d h e s i o ns y s t e m纤维蛋白粘连系统 f a s a s s o c i a t e dd e a t h d o m a i nf a s 相关死亡结构域 f l o wc y t o m e t r y流式细胞术 h e m a t o x y l i n e o s i n 苏木素一伊红 l i p o p o l y s a c c h a r i d e 脂多糖 m i n i m a la l v e o l a rc o n c e n t r a t i o n最低肺泡气有效浓度 p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e 磷酸盐缓冲液 t d t m e d i a t e dd u t pn i c ke n dl a b e l i n g原位缺口末端标记 t u m o rn e c r o s i sf a c t o r a肿瘤坏死因子 a w e t d r y 湿干比 徐州医学院硕士学位论文 实验第一部分 l p s 致肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡时程变化 中文摘要 目的 观察急性肺损伤 a c u t el u n gi n j u r y a l i 大鼠肺组织细胞凋亡的时 程变化 方法 3 0 只雄性s d 大鼠随机均分为5 组 对照组 l p s l 6 1 2 2 4 h 组 l p s 组气管内滴注l p s 5m g k g 对照组气管内注入等量生理盐水 分别观察 1 h 6 h 1 2 h 2 4 h 后放血处死 取肺组织 行肺组织苏木精一伊红 h e 染色 光镜 观察组织学变化 测定肺湿重 干重 w d 比值 透射电镜观察超微结构 t u n e l 法检测细胞凋亡 结果 h e 染色可见 l p s 组肺泡间隔增宽 问质充血水肿 肺泡腔变窄 炎 出及小气道塌陷 肿胀随着时间逐渐加重 肺w d l p s 组分别为 4 8 0 6 7 4 0 2 6 4 7 l o 5 7 6 4 7 o 3 6 比对照组 4 3 5 0 3 7 明显 0 1 透射电镜发现细胞凋亡的特征性样改变 t u n e l 法检测发现 1 2 h 2 4 h l p s 组 2 8 0 1 2 7 4 3 7 2 2 2 9 5 1 5 8 5 1 9 9 4 8 1 3 肺组织内细胞凋亡指数 a i 较对照组明显 1 1 2 3 2 3 1 升高 其 值最高 2 4 h 时间点其a i 有所下降 对照组a i 低于试验组 与试验 较 尺0 0 1 l p s 导致大鼠肺组织细胞大量凋亡 其凋亡指数在1 2 h 时达到最高 升后降的过程 且凋亡程度和肺损伤呈现一致性变化 内毒素 急性肺损伤 凋亡 2 徐州医学院硕士学位论文 实验第二部分 七氟烷对急性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡的影响 中文摘要 目的 观察吸入七氟烷对脂多糖 l p s 致急性肺损伤 a c u t el u n gi n j u r y a l i 大鼠肺组织细胞凋亡的影响 探讨可能机制 方法 1 8 只雄性s d 大鼠随机均分为3 组 对照组 模型组 l p s 组 七 氟烷l p s 组 l p s 组气管内滴注l p s 5 m g k g 正常对照组气管内注入生理盐水 七氟烷组吸入l b t a c 2 5 七氟烷3 0 分钟后气管内滴注l p s 5m g k g 1 2 h 后放 血处死 取肺组织 行肺组织h e 染色 光镜观察肺组织形态学变化 测定肺湿 重 干重 w d 比值 透射电镜 流式细胞仪 t u n e l 法检测细胞凋亡 免疫组 化检n f a s w e s t e r n 检钡q b c l 2 表达含量 结果 h e 染色可见 l p s 组较对照组肺泡间隔明显增宽 问质充血水肿 肺 泡腔变窄 炎症细胞渗出及小气道损伤 七氟烷l p s 组损伤明显减轻 l p s 组肺 w d 比对照组明显增加 p o 0 1 七氟烷l p s 组肺w d 明显低于l p s 组护 0 0 1 透射电镜证实细胞凋亡样改变 七氟烷l p s 组肺损伤明显减轻 流式以及t u n e l 徐州医学院硕士学位论丈 p a r t l t h et i m ec o u r s eo fp u l m o n a r y a p o p t o s i si nl p s i n d u c e d a c u t el u n gi n ju r y a b s t r a c t o b l e c t i v e t oi n v e s t i g a t et h et i m ec o u r s eo fp u l m o n a r ya p o p t o s i si na c u t e l u n gi n j u r y m e t h o d s t h i r t y m a l es dr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t of i v eg r o u p s c o n t r o l g r o u p l p s ih 6 h 12 ha n d2 4 hg r o u p l p s 5 m g k g w a si n s t i l l e di n t ot h et r a c h e a i nl p sg r o u p w h i l et h ec o n t r o lg r o u pr e c e i v e dn o r m a ls a l i n e l u n gt i s s u es a m p l e s w e r eh a r v e s t e da tlh 6 h 12 ha n d2 4 ha f t e ri n s t i l l a t i o no fl p s a n dh i s t o l o g y e x a m i n e db ym i c r o s c o p y w dw a sc a l c u l a t e d a p o p t o s i sw a sd e t e r m i n e db y t u n e lt e s t t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e m e d i a t e dd u t pi l i c ke n d l a b e l i n g a n de l e c t r o nm i c r o s c o p y r e s u l t s i n t e r s t i t i a le d e m ao c c u r r e dw i t hm a s s i v ei n f i l t r a t i o no ft h e i n f l a m m a t o r yc e l l a n d t h e p u l m o n a r y s t r u c t u r ew a sd a m a g e d w dw a s s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc o m p a r e dw i n lt h ec o n t r o lg r o u p 4 3 5 0 3 7v e r s e4 8 0 0 1 3 6 7 4 4 0 2 6 4 7 1 0 5 7 6 4 7 4 0 3 6 r e s p e c t i v e l y c h a r a c t e r i s t i cf i n d i n g so f a p o p t o s i sw e r ed e m o n s t r a t e db ye l e c t r o nm i c r o s c o p e t u n e la s s a ye x h i b i t e d i n c r e a s e da p o p t o s i si n d e xc o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u pa n dm o r ep o s i t i v ec e l l sa t12 hc o m p a r e dw i t l lc o n t r o lg r o u p 11 2 34 2 31v e r s e2 8 0 14 2 7 4 3 7 2 24 2 9 5 15 8 5 1 9 9 4 8 1 3 1 8 8 c o n c l u s i o n l p si n d u c ea p o p t o s i si nl u n gc e l l s t h ea p o p t o s i si n d e xs h o w s t h a ti t si n c r e a s i n gi ne a r l yd a m a g eo f l u n gt i s s u e d e s c e n d i n ga tl a s t t h ep e a kv a l u e e m e r g e da tt h e 12 t hh o u ra f t e ri n s t i l l a t i o no fl p s a n dt h ee t e n to fa p o p t o s i sa n d 4 徐州医学院硕士学位论文 l u n gi n j u r ys h o w e dc o n s i s t e n tc h a n g e s k e yw o r d s l i p o p o l y s a c c h a r i d e s a p o p t o s i s a c u t el u n gi n j u r y 5 徐州医学院硕士学位论文 p a r t 2 t h ee f f e c to fs e v o f l u r a n eo nt h ea p o p t o s i so fp u l m o n a r yc e l l si nr a t sw i t h a c u t el u n gi n j u r yi n d u c e d b yl i p o p o l y s a c c h a r i d e a b s t r a c t o b j e c t i v e t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c ta n dt h ep o s s i b l em e c h a n i s mo fs e v o f l u r a n e o nt h ea p o p t o s i so fp u l m o n a r yc e l l si nr a t sw i t ha c u t el u n gi n j u r yi n d u c e db y l i p o p o l y s a c c h a r i d e m e t h o d s e i g h t e e nm a l es dr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s c o n t r o lg r o u p l p sg r o u p s e v o f l u r a n el p sg r o u p t h ea l lg r o u pr e c e i v e dl p s5 m g 瓜g w h i l et h ec o n t r o lg r o u pr e c e i v e dn o r m a ls a l i n e a n dt h es e v o f l u r a nl p s g r o u pi n d u c e db yl p s 5m g k g a f t e rr e c e i v e ds e v o f l u r a n 2 5 f o r3 0 r a i n l u n g t i s s u es a m p l e sw e r eh a r v e s t e da t12ha f t e ri n s t i l l a t i o no f l p s a n dh i s t o l o g i c a l e x a m i n a t i o nc a l c u l a t e db yw da n d l i g h tm i c r o c o p yw a sp e r f o r m e d a p o p t o s i sw a s d e t e r m i n e db yf l o wc y t o m e t r y f c m t u n e lt e s t t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e m e d i a t e dd u t pn i c ke n dl a b e l i n g a n de l e c t r o nm i c r o s c o p y f a s b c l 2 p r o t e i ne x p r e s s i o nw e r es t u d i e du s i n gi m m u n o c y t o c h e m i s t r ya n dw e s t e r nb l o t r e s u l t s p u l m o n a r yh e s t a i ns h o w e de d m a b o t hi n t e r s t i t i a la n da l v e o l a r a n d n u t r o p h i li n f i l t r a t i o ni na l v e o l a rt i s s u e i ns e v o f l u r a n el p sg r o u p t h ei n j u r yw a s s i g n i f i c a n t l ya t t e n u a t e dw i t hs e v o f l u r a nr e c e i v e d t h ew d a i f a si na l ig r o u p w e r es i g n i f i c a n th i g h e rt h a nt h o s ei nc o n t r o lg r o u p p 0 0 1 c o m p a r e dw i t hl p s g r o u p w d a i f a so fr a t ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e di ns e v o f l u r a nl p s g r o u p c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p l p sg r o u pi n h i b i t e dt h ee x p r e s s i o no fb c l 一2 p r o t e i ns i g n i f i c a n t l y p 0 01 a n ds e v o f l u r a n el p sg r o u pi n c r e a s e dt h ee x p r e s s i o n o fb c l 2p r o t e i ns i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dw i t hl p sg r o u p 尸 0 01 6 徐州医学院硕士学位论文 c o n c l u s i o n s e v o f l u r a n ei n h a l a t i o np r o t e c t sl u n gf r o mi n j u r yb yi n h i b i t i n g e x c e s s i v ec e l la p o p t o s i s d o w n r e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no ff a sa n du p r e g u l a t i n g b c l 一2e x p r e s s i o n t h o s em a yp l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h ep a t h o g e n e s i so f l p s i n d u c e da l i k e yw o r d s s e v o f l u r a n l i p o p o l y s a c c h a r i d e s a p o p t o s i s a c u t e l u n gi n j u r y f a s 7 徐州医学院硕士学位论文 前言 急性肺损伤 急性呼吸窘迫综合征 a c u t el u n gi n j u r y a c u t er e s p i r a t o r y d i s t r e s ss y n d r o m e a l i a r d s 是指由心源性以外 肺内外各种致病因素导致的急 性 进行性 缺氧性呼吸衰竭 感染是该病的主要诱因 革兰氏阴性杆菌感染是 a l i 最常见的原因n 1 革兰氏阴性杆菌的感染占a l i 病死原因的5 0 革兰氏阴性细 菌外膜上的脂多糖 l p s 成分 又叫内毒素 是革兰氏阴性杆菌类致病的抗原物 质 在a l i 中占有着十分重要的角色 尽管已进行了大量的研究口 4 1 但a l i a r d s 的病死率仍然很高 a l i a r d s 的发病机制目前还不是十分清楚 这成为其疗效不 佳的主要原因之一 细胞凋亡又称为程序性细胞死亡 p r o g r a m m e dc e l ld e a t h p c d 是通过各种诱 因激活自身固有的凋亡程序 是机体控制细胞数量 保持组织结构稳定 实施单细 胞死亡并且不伤及邻近细胞 将炎症反应限制在最小范围的一种高级调节过程 近年研究表明 内毒素导致的细胞凋亡在急性肺损伤中的作用f i 益受到人们 重视 细胞凋亡在急性肺损伤发病过程中起着重要作用 但其确切的发生 发展 机制还不是很清楚 在a l i 发病过程中 各种损伤因素直接或间接的促进肺血管 内皮细胞和肺泡上皮细胞凋亡 加重肺组织损伤 而参与a l i 的炎症反应过程心1 研究显示 吸入麻醉药预处理在重要脏器损伤时具有一定的抗凋亡作用 从 而达到保护脏器的目的 但对于吸入麻醉药的抗凋亡作用的具体机制目前还不是 很明确 七氟烷是一种新型吸入麻醉药 具有诱导迅速 循环稳定 肌松良好等 优点 从而被临床广泛采用 目前关于七氟烷对肺损伤的抗凋亡保护作用还知之 甚少 本研究采用气管内滴注l p s 的方法建立肺损伤模型 旨在观察肺损伤时肺 组织的凋亡及凋亡时程变化和七氟烷对肺组织细胞凋亡的影响 观察细胞凋亡在 大鼠a l i 发生 发展中的作用 探讨吸入七氟烷对凋亡的影响及可能机制 为进一 步探讨急性肺损伤的发病机理 以及治疗提供实验依据 徐州医学院硕士学位论文 实验第一部分 l p s 致肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡时程变化 材料和方法 1 材料 1 1实验动物 健康雄性s p r a g u e d a w l e y s d 大鼠 清洁级 2 5 0 9 2 8 0 9 由徐州医学 院实验动物中心提供 相对清洁 恒温环境中 适应性喂养7 l o 天 1 2 h 明暗 昼夜循环 给予标准实验鼠粮 自由饮水 1 2 主要试剂和器材 1 2 1 主要实验试剂 内毒素 e s c h e r i c h i a c o l io l l l b 4 s i g m a 美国 七氟烷 abbott 日本 戊巴比妥钠 s i g m a 美国 t u n e l 检测试剂盒 r o c h e 公司 德国 a n n e x i nv p i 试剂盒 杭州联科公司 p b s 缓冲液 武汉博士德生物工程有限公司 牛血清蛋白 b s a r o c h e 公司 德国 其余试剂均为国产分析纯a r 级 1 2 2 主要试剂的配制 0 0 1 mp b s 的配制 n a c l8 0g k c l0 2g n a 2 h p 0 4 7 h 2 01 5 6g k h 2 p 0 4 0 2 9 双蒸水l l 调p h 值在7 2 7 4 l p s 溶液的配制 l p s l 0 0 r a g 溶于2 0 m l 灭菌生理盐水 4 c 保存 电镜固定液 用0 2 m p b sp h 7 4 配制 2 5 戊二醛1 2 m l n a 2 h p o 1 2 h 2 0 9 徐州医学院硕士学位论文 2 9 9 n a h 2 p 0 4 2 h 2 00 2 9 6 4 9 去离子水 j h 至 0 0 m 电镜冲洗液 用o 2 mp b sp h7 4 配制 含0 1 8 m 蔗糖 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 2 9 9 n a h 2 p 0 4 2 h 2 00 2 9 6 4 9 蔗糖6 4 5 9 去离子水加至1 0 0 m l 1 2 3 实验器材 手术用器械 操作台 纱布 l 4 号丝线 1 8 号套管针 一 次性注射器 1 5 2 0 m 1 1 3主要的实验设备 光学显微镜 透射电镜 微电脑电热恒温水槽 电热恒温干燥箱 电动匀浆器 高速冷冻离心机 7 1 0 0 麻醉机 气体监护仪 生物光学显微镜 电子天平 超低温冰箱 移液微量器 组织匀浆机 电子计时器 日本o l y m p u s 公司 日本日立h 6 0 0 型 上海搏迅实业有限公司医疗设备厂 上海精宏实验设备有限公司 g l a s c o l 公司 美国 b e c k m a n 公司 美国 d a t e x o h m e d a 芬兰 d a t e x o h m e d a 芬兰 o l y m p u s 日本 m e t t l e r 公司 瑞士 s a n y o 公司 日本 l a b s t s t e r n s 公司 芬兰 德国 中国上海 2 方法 2 1 动物模型的建立 气道滴注l p s 参照c l l i n j a e y o n g 和焦光宇的方法 5 1 大鼠称重后以3 戊巴 比妥钠4 0m g k 岔1 腹腔注射麻醉 麻醉满意后仰卧固定于操作台 剪除颈部鼠 毛 碘伏消毒 颈部正中作约l c m 长度纵向切口 钝性分离组织 轻柔暴露气 l o 徐州医学院硕士学位论文 管 大鼠头侧抬高约6 0 直视下以2 5 号针从气管环间隙 沿从头至尾方向与 气管呈l o 穿刺 气管内注射针留置约0 4 c m 滴入新鲜配置的l p s 溶液0 4 m l o i i i b 4 5m g k g 1 对照组 n s 组 依同法滴入等体积n s 旋即直立 旋转 大鼠 尽量使药液在肺内均匀分布 保持头高6 0 体位5 m i n 防止液体返流 逐层缝合切口后 将大鼠放回鼠笼 自由供食水 2 2 实验分组 将3 0 只大鼠随机分成5 组 空白对照组 ns 气管内滴入与l p s 组相同剂量的n s 一l p s 组 l p s 气管内滴入l p s s t a g k g 1 各组 n 6 下分4 组 根据处死时间分为四个时间点 即1 h 组 6 h 组 1 2h 组和2 4 h 组 2 3 动物处死 以3 戊巴比妥钠4 0 m g k g 腹腔注射麻醉大鼠 仰卧位固定于操作台 颈部 正中切开皮肤 游离出右侧颈总动脉 穿刺放血处死大鼠 2 4 观察指标 2 4 1 肺组织病理学观察 各组大鼠处死后开胸后取右肺下叶组织 浸泡于1 0 中性甲醛溶液中固定 然后用石蜡包埋制成蜡块 切成厚4 p m 的连续石蜡切 片 经苏木素一伊红 h e m a t o x y l i n e o s i n h e 染色 1 切片常规脱腊至水 二甲苯i 二甲苯i i 1 0 0 酒精i 1 0 0 酒精i i 各 l o m i n 9 5 酒精 9 0 酒精 8 0 酒精 7 0 酒精各1 0m i n 蒸馏水冲洗 2 苏木精染色l m i n 自来水冲洗 3 1 盐酸分化 自来水冲洗 4 伊红染色2 m i n 5 常规梯度酒精脱水 7 0 酒精 8 0 酒精 9 0 酒精 9 5 酒精 各2 m i n 1 0 0 酒精i 1 0 0 酒精i i 各1 0 m i n 二甲苯透明 中性树胶封片 请不知分组情况的病理科医师双盲法进行h e 染色组织学读片 记录病理学变 化 徐州医学院硕士学位论文 在光镜下观察肺组织的病理学变化 2 4 2 肺组织细胞透射电镜观察 1 将置入2 5 戊二醛溶液中固定4 8 h 的肺组织 用双剃须刀片对切 制成l m m 3 大小 的组织颗粒后再固定于4 的2 5 戊二醛溶液中6 h 2 将组织固定于1 饿酸中l h 3 3 0 5 0 乙醉脱水各1 5 m i n 4 7 0 醋酸铀乙醇饱和液中6 h 5 8 0 9 5 乙醇脱水各1 5 m i n 6 1 0 0 乙醇4 0 m i n 2 次 7 环氧丙烷3 0 m i n 8 1 i t 氧丙烷 环氧树脂 2 h 9 l 2 环氧丙烷 环氧树脂 1 h 1 0 浸环氧树脂 2 h 1 1 环氧树脂包埋 4 5 烤箱1 2 h 1 2 6 5 烤箱4 8 h 1 3 取出包埋好组织进行超薄切片 片厚7 0 n m 切片机 徕卡 德国 1 4 将切好的片子水洗后放入醋酸铀乙醇饱和液中 3 0 m i n 1 5 双蒸水洗涤 1 5 m i n 3 次 1 6 放入枸橼酸铅染液中 1 5 m i n 1 7 双蒸水洗涤l o m i n 3 次 1 8 透射电镜 日本日立s 一4 5 0 观察摄片 2 4 3 肺水含量测定 气管结扎后取右肺中叶 吸水纸吸干表面水分及血液 称量 肺湿重 置于8 0 c 烤箱7 2h 后 称量肺干重 计算湿干重比 w d 2 4 4 肺组织细胞凋亡 t u n e l 凋亡检测即脱氧核苷酸末端转移酶 t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e t d t 介导的d u t p 缺口末端标记 t d t m e d i a t e dd u t p n i c ke n dl a b e l i n g t u n e l 技术 1 2 徐州医学院硕士学位论文 切片 载玻片洗净 烘干后 用多聚赖氨酸处理5 m i n 制备4um 石蜡 切片备用 标本预处理 切片置于二甲苯中2 0 m i n 然后换入新鲜二甲苯2 0 m i n 无水酒精洗两次 每次3 m i n 9 5 和9 0 酒精各洗一次 每次3 m i n 蒸馏水洗两次 t u n e l 反应液的配制 将5 0 ul 酶液 t d t 移入4 5 0 p1 标记液 荧光 素标记的核苷酸 每5 0 0plt u n e l 反应液设计用于1 0 分标本 反应 液应于用前配制 并置于冰上备用 d b a 显色液的配制 d b a 用双蒸水配制l m l 避光保存 工作浓度为 染色步骤 组织切片置湿盒中 滴加3 h 0 室温孵育3 0 m i n 阻断内源性过氧化物 酶 切片置蛋白酶k 2 0 ug m l p h 7 4 中 室温孵育1 5 m i n 标记 滴加5 0u1t u n e l 反应液 0 1 5 mp b s p h 7 4 冲洗三次 信号转化 滴加5 0i i1 转化剂p o d 连接荧光素抗体的过氧化物酶 3 7 孵育3 0 m i n 0 1 5 mp b s p h 7 4 冲洗三次 加底物 5 0 ll 二甲基联苯胺 d a b 室温孵育l o m i n 0 1 5 mp b s p h 7 4 冲洗三次 苏木素复染5 m i n 蒸馏水充分冲洗 依次7 0 9 5 1 0 0 酒精脱水 干燥 中性树胶封片 阳性对照 取组织切片 标记前先用外源性d n a s ei 1 0 0 0 0 u l 将 细胞d n a 随机切除许多切口 模拟凋亡内源d n a s e 的作用 阴性对照 全部过程与正常标记相同 只是标记液中只有d u t p 标记液而 l 2 3 4 5 6 7 徐州医学院硕士学位论文 不加t d t 酶液 8 镜检 阳性细胞细胞核呈棕红色 阴性细胞核为蓝色 每张切片于光镜下随 机选则1 0 个高倍视野 计算视野中的平均阳性细胞数为凋亡指数 a i 凋 亡阳性细胞数 凋亡阳性 凋亡阴性细胞数 1 0 0 4 3 统计方法 采用s p s s l 3 0 统计软件分析 计量资料以均数 标准差 x 士s 表示 采用单 因素方差分析 方差不齐时采用d e n n e t t s 方法作多重比较 组间比较使用s n k s t u d e n t n e w m n a n k e u l s 法 p o 0 5 认为有显著差异 1 4 徐州医学院硕士学位论文 结果 l 肺组织光镜检测 对照组肺泡结构完整 肺泡腔内清晰 胞壁光滑 肺泡腔及间质内无渗出 图 5 l p s 组l h l j 有肺泡腔及间质内炎症细胞浸润 肺泡腔内有渗出液 肺泡隔增厚 肺泡及间质充血 出血 部分肺泡塌陷 这些变化在6 h 1 2 h 逐渐加重 2 4 h 时肺泡 间隔增厚不明显 渗出及炎性细胞减少 水肿有所减轻 图9 其中以1 2 h 组改变 最明显 图8 2 肺组织电镜检测透射电镜下观察 对照组大鼠肺泡壁完整 边缘整齐 肺泡i i 型上皮细胞表面微绒毛排列整齐 板层小体数目 结构基本正常 图1 0 l p s 组从1 h 开始 出现肺泡壁增厚 肺泡上 皮细胞水肿 i 型肺泡上皮细胞轻度肿胀 呈退行性变 i i 型上皮细胞微绒毛脱落 减少或变短 板层体排空 可见胞体脱落 血管内皮细胞肿胀 吞饮小泡增多 肺泡 隔间质增宽 电子密度减低 肺泡腔还可见红细胞等物质 1 2 h 时肺泡隔间质明显 增宽 肺泡进一步受到损伤 水肿渗出液充满肺泡腔 肺泡内有蛋白质 细胞碎片 肺泡i i 型细胞板层小体丰富 有排空 空泡化迹象 染色质凝集在细胞核周围 出 现凋亡样变 图1 3 3w i 比值 l p s 组大鼠肺组织w d l h 4 8 0 0 1 3 即开始升高 1 2 h 6 7 4 0 2 6 时升高显 著高于其他l p s 组 与对照组 4 3 5 0 3 7 比较 有统计学意义 以o 0 1 表1 4 肺组织细胞凋亡的变化t u n e l 分析 l p s 处理后 肺组织中t u n e l 阳性细胞1 h 2 8 0 1 2 7 4 即明显增加 图1 6 至 1 2 h 4 8 1 3 1 8 8 时凋亡数达到最大 图1 8 2 4 时 1 5 8 5 1 9 9 凋亡数有所下 降 图1 9 但仍高于对照组 图1 5 l p s 组与对照组 1 1 2 3 2 3 1 组比较 均 有统计学意义 p o 0 1 表1 徐州医学院硕士学位论文 讨论 急性肺损伤 a c u t el u n gi n j u r y a l i 是各种直接或间接致病因素导致的肺 泡上皮细胞以及毛细血管内皮细胞损伤 造成弥漫性肺间质及肺泡水肿 导致的 急性低氧性的呼吸功能不全 以肺容积减少 肺顺应性降低 通气 血流比例失调 为病理生理特征 临床上表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫 尽管a r d s 已研究了 近4 0 年 临床重症监护也取得了长足的进步 然而a r d s 的死亡率仍高达4 0 6 0 口1 a r d s 与因腹部等疾病导致的a r d s 在很多方面有明显差异 因此将a r d s 分为肺 内源性的a r d s 和肺外源性的a r d s 而a l i 属于a r d s 早期阶段阳1 肺内源性a l l 的主要 病因有 肺部感染 细菌 病毒等 淹溺 吸入有毒气体 肺创伤西t 1 0 3 等 大约占至j j a l i 的5 7 革兰氏阴性菌 g r a m n e g a t i v eb a c t e r i u m g 一 细胞壁的主要成分脂多糖 1 i p o p 0 1 y s a c c h a r i d e l p s 是a l l 的主要的致病因素 利用l p s 复 i j a l i 的动物 模型进行研究是科研工作中的常用方法之一 l p s 进入体内后 激活巨噬细胞等炎 性细胞释放炎性介质 趋化 激活中性粒细胞 使其在肺内扣押 触发局部炎症 反应 从而产生肺损伤 且l p s 本身对肺上皮和血管内皮也有直接损伤作用 由此 可建立确切的直接肺损模型n 本研究病理检查发现 肺组织充血明显 大量炎性 细胞浸润 肺泡壁严重水肿 肺泡完整性破坏 肺泡腔内可见出血和渗出 肺呈 现急性弥漫性炎症表现 病理形态证实急性肺损伤炎症模型建立成功 本实验还 发现处理组病理损伤程度随着时间的增加呈现逐渐加重的趋势性变化 急性肺损伤发病过程中细胞凋亡的作用日益受到人们的重视 各种损伤因素 可以通过抑制炎症细胞凋亡 延长炎症反应时间 促进肺血管内皮细胞以及肺泡 上皮细胞凋亡 加重毛细血管一肺泡损伤而参与a l i 的炎症反应过程n 刳 而当a l i 发展到修复期时 肺泡i i 型细胞以凋亡的方式参与其结构重建 同时大量的凋亡 细胞被吞噬细胞清除 故细胞凋亡是一个动态发展的过程n 3 1 c h o p r a 等 3 发现 在脓毒血症导致的外源性肺损伤时 切片提示凋亡细胞逐渐增加 本实验发现 1 6 徐州医学院硕士学位论文 在大鼠气管内滴入l p s 后 肺组织的整体凋亡率的改变与病理组织形态改变呈现一 致性改变 试验组凋亡率在1 h 时 肺泡以及支气管区 血管内皮凋亡细胞数即比 对照组增加 并持续至2 4 h 凋亡在1 2 h 时达到峰值 此后逐渐减轻 至2 4 h 但仍高 于对照组水平 结合电镜下观察所见 其肺损伤病理改变仍然明显 综上所述 l p s 可导致a l i 大鼠肺组织细胞的凋亡 其凋亡程度随时间的延长而 增长 在所研究的时间点中 1 2 h 时凋亡率最高 2 4 h 有所下降 但仍高于对照组 这就为肺损伤选择药物的作用时间以及预后提供了一定的科学依据 但其具体凋 亡发展机制仍待进一步研究 1 7 徐州医学院硕士学位论文 实验第二部分 七氟烷对急性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡 的影响 第一部分证实l p s 导致a l i 的凋亡率在1 2 h 时最高 为进一步研究七氟 烷对急性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡的影响及其机制 选用该时间点取材 采 用流式细胞术 免疫组化 w e s t e r nb l o t 法检测凋亡相关指标的表达 材料和方法 1 材料 1 1实验动物 健康雄性s p m g u e d a w l e y s d 大鼠 清洁级 2 5 0 9 2 8 0 9 由徐州医学 院实验动物中心提供 相对清洁 恒温环境中 适应性喂养7 1 0 天 1 2 h 明暗 昼夜循环 给予标准实验鼠粮 自由饮水 1 2 主要试剂和器材 1 2 1 主要实验试剂 内毒素 e s c h e r i c h i a e o l i0 1 1 1 b 4 s i g m a 美国 七氟烷 abbott 日本 戊巴比妥钠 s i g m a 美国 t u n e l 检测试剂盒 r o c h e 公司 德国 牛血清蛋白 b s a r o c h e 公司 德国 a n n e x i nv p i 试剂盒 杭州联科公司 p b s 缓冲液 武汉博士德生物工程有限公司 兔抗f a s 蛋白多克隆抗体 武汉博士德生物工程有限公司 抗体稀释液 中国碧云天生物技术研究所 s p 免疫组化试剂盒 北京中山生物技术有限公司 徐州医学院硕士学位论文 兔抗b c l 2 多克隆抗体 多克隆内参抗体 碱磷酶标记山羊抗兔i g g w e s t e r n 及i p 细胞裂解液 b c a 蛋白浓度测定试剂盒 s d s p a g e 蛋白上样缓冲液 4 x s d s p a g e 凝胶配制试剂盒 b c i p n b t 其余试剂均为国产分析纯a r 级 1 2 2 试剂配制 c e l ls i g n a l i n g 公司 北京中山生物技术有限公司 碧云天生物技术研究所 碧云天生物技术研究所 碧云天生物技术研究所 碧云天生物技术研究所 碧云天生物技术研究所 碧云天生物技术研究所 0 0 1 mp b s 的配制 n a c l8 0g k c l0 2g n a 2 h p 0 4 7 h 2 01 5 6g k h 2 p 0 4 0 2 9 双蒸水l l 调p h 值在7 2 7 4 l p s 溶液的配n l p s l 0 0 m g 溶于2 0 m l 灭菌生理盐水 4 c 保存 1 2 3 实验器材 手术用器械 操作台 纱布 1 4 号丝线 1 8 号套管针 一 次性注射器 1 5 2 0 m 1 1 3主要的实验设备 光学显微镜 透射电镜 流式细胞仪 微电脑电热恒温水槽 电热恒温干燥箱 电动匀浆器 高速冷冻离心机 7 1 0 0 麻醉机 气体监护仪 生物光学显微镜 1 9 日本o l y m p u s 公司 日本日立h 6 0 0 型 美国f a c s c a n 公司产品 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 上海精宏实验设备有限公司 g l a s c o l 公司 美国 b e c k m a n 公司 美国 d a t e x o h m e d a 芬兰 d a t e x o h m e d a 芬兰 o l y m p u s 同本 徐州医学院硕士学位论文 电子天平 超低温冰箱 移液微量器 m o d e l5 5 0 酶标仪 t s 一1 型脱色摇床美国 石蜡切片机 w e s t e m b l o t 套件美国 组织匀浆机 电子计时器 t s 1 型脱色摇床 m e t t l e r 公司 瑞士 s a n y o 公司 日本 l a b s t s t e m s 公司 芬兰 b i o r a d 公司 美国 b i o r a d 公司 美国 l e i c a 公司 德国 b i o r a d 美国 德国 中国上海 江苏海门市麒麟医用仪器厂 2 方法 2 1 动物模型的建立 参照第一部分 2 2 七氟烷预处理 参照c h i n j a e y o n g 和焦光宇的方法自制一个透明密封箱 规格6 0 2 5 2 0 c m 两端各有一进气孔和出气孔 底部铺薄层钠石灰 进气端接麻醉机 设 置载气氧浓度为4 0 出气端接麻醉气体监测仪 调整挥发罐和新鲜气流至出 气端七氟烷浓度为2 2 0 旷2 5 将大鼠迅速放入密封箱 3 0 m i n 后取出 于空气 中待其苏醒 预处理过程中大鼠保持自主呼吸 2 3 实验分组 将1 8 只大鼠随机分成3 组 对照组 气管内滴入与l p s 组同剂量的n s l p s 组 气管内滴 x l p s 5 m g k g 1 七氟烷l p s 组 n 及 x 2 2 2 5 七氟烷3 0 m i n 后气道内滴入l p s 5m g k g 1 各组 z 6 徐州医学院硕士学位论文 2 4 动物处死 以3 戊巴比妥钠4 0m g k g 一腹腔注射麻醉大鼠 仰卧位固定于操作台 颈 部正中切开皮肤 游离出右侧颈总动脉 穿刺放血处死 依据第一部分试验结 果 选取1 2 h 放血处死大鼠 2 5 观察指标 2 5 1 肺组织病理学观察 各实验组大鼠 在1 2 h 时开胸后取右肺下叶组织 浸 泡于1 0 中性甲醛溶液中固定 然后用石蜡包埋制成蜡块 切成厚4 1 x m 的连续 石蜡切片 经苏木素一伊红 h e m a t o x y l i n e o s i n h e 染色 具体步骤同试验一 请不知分组情况的病理科医师协助进行h e 染色组织学读片 记录病理学变化 在光镜下观察肺组织的病理学变化 2 5 2 肺水含量测定 气管结扎后取右肺中叶 吸水纸吸干表面水分及血液 称 量肺湿重 置于8 0 烤箱7 2 h 后 称量肺干重 计算湿干重比 w d 2 5 3 肺细胞凋亡的流式细胞仪法观察 1 收集细胞 右上叶肺组织用组织分离器制作成单细胞匀浆1 0 0 0r m i n 离心不 5 m i n 弃去上清液 2 3 m l 的p b s 洗涤1 次 3 再次1 0 0 0 r m i n 离心去除p b s 加入冰预冷7 0 乙醇固定 4 c l h 4 再次离一t 二 1 0 0 0 r m i n 弃去上清液 3 m l 的p b s 重悬5 m i n 5 用7 0 的冷乙醇4 c 固定 过夜 6 r n a s e a 0 5 m g m 1 3 7 0 c 消化3 0 m i n 7 1 1 入p i 5 0 u g m 1 5 u l 避光反应5 m i n 1 l k 4 m l 的标记缓冲液 8 用f a c s c a n 进行流式细胞术定量检测 9 流式细胞仪检测 以4 8 8 n m 氢激光激发 双通道接收a n n e x i n v p i 测定 每样本计数1 0 0 0 0 个细胞 绘制细胞数周期分布图 计算正常二倍体峰前凋亡 细胞