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38生物化学概述一、生物化学研究的基本内容研究生命体的化学组成与化学变化。二、生物化学发展简史 十八世纪下半叶法国化学家Lavoisier（1783）发现生物氧化过程十九世纪生物化学进展缓慢（德国领先） J.von Liebig (1803-1873) 新陈代谢 （1842） Hoppe-Seyler (1825-1895) Biochemie（1877）二十世纪初 德、美、英、法生物化学发展生物化学领域三大发现：酶、维生素、激素二十世纪中叶生物化学快速发展原因： 1. 生物化学研究方法的改进2. 跨学科的合作研究美国生物学家Watson , 英国物理学家Crick： 1953 DNA双螺旋（1962获诺贝尔奖）英国化学家 Sanger : 牛胰岛素结构（1958）英国物理学家 Kendrew: 解析肌红蛋白结构（1962）美国生物化学家 Nirenberg：破遗遗传密码（1969）美国生物化学家 Holly： 解析 tRNA结构（1969）法国生物学家 Jocob, Monod：遗传信息流（1965）英国化学家 Sanger : DNA测序（1983）我国科学家在生物化学领域中的贡献1965 生化所与有机化学所人工合成有功能的蛋白质牛胰岛素1973 X射线分析出猪胰岛素空间结构1983 酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合成(tRNAAla)2002 水稻基因组测序蛋白质化学一、蛋白质的概念与生物意义1、概念：是生活细胞含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。蛋白质是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸为基本单位,经肽键连接而成的生物大分子。2、意义：细胞中含量最丰实、功能最多的生物大分子。酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂，代谢反应几乎都是在酶的催化下进行的结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）物质运输（血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）激素功能（胰岛素）防御（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白）接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）二、氨基酸（一）氨基酸的基本结构和性质1、结构：氨基酸是蛋白质分子的基本组成单位。构成天然蛋白质分子的氨基酸约有20种，除脯氨酸为-亚氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外，其余氨基酸均为L-氨基酸。2、性质物理性质a、两性解离：氨基酸分子中有游离的氨基和游离的羧基，能与酸或碱类物质结合成盐，故它是一种两性电解质。b、等电点：氨基酸所带正电荷数与负电荷数相等时（净电荷为零时）的溶液pH值，称为等电点pI1/2 （pKa1pKa2）pHpI时，AA带负电，向正极移动pHpI时，带正电， 向负极移动pH=pI时，不带电， 不移动c、光学性质芳香族氨基酸在280nm波长附近有最大的紫外吸收峰，由于大多数蛋白质含有这些氨基酸残基，氨基酸残基数与蛋白质含量成正比，故通过对280nm波长的紫外吸光度的测量可对蛋白质溶液进行定量分析。化学性质（1）a氨基参加的反应（烃基化反应）a、桑格反应（Sanger reaction）桑格试剂：2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应：在弱碱性溶液中, DNFB 将a-氨基酸转变成黄色的2,4-二硝基苯基氨基酸（DNP-AA）。应用： 鉴定多肽链的氨基末端氨基酸b、艾德曼反应（Edman reaction）试剂：苯异硫氰酸酯（PITC）反应：弱碱条件下与PITC反应生成用途：鉴定多肽链氨基末端AA；蛋白质测序c、与亚硝酸的反应：反应：产物为相应的羟基酸和氮气，产生的氮气一半来自氨基酸的氨基氮，一半来自亚硝酸。用途：通过测定氮的体积可计算氨基酸的量.此方法叫范斯莱克定氮法d、与甲醛的反应：生成羟甲氨基衍生物e、酰化反应：与酰基供体生成一（二）酰氨 g基衍生物；用于-氨基的保护f、成盐反应：与酸成盐h、 与醛类的反应：生成弱碱（2）-羧基参加的反应a、 脱羧反应： 产物为CO2和相应的胺b、 具有机酸的通性：与碱成盐；与醇成酯；及成酰卤、酰胺（3）a氨基和a羧基同时参加的反应茚三酮反应(Ninhydrin reaction) 反应氨基酸的氨基与茚三酮水合物反应可生成蓝紫色化合物用途：可作为氨基酸定量分析方法。（4）巯基的反应a、 巯基不稳定，易被氧化成二硫键 2半胱氨酸胱氨酸 2 -SH-S-S-b、 与重金属反应 AASH Ag+AA-SAgc、 二硫键的打开氧化：Cys-S-S-Cys + HCOOOH2AA-SO3-（磺基丙氨酸）还原：Cys-S-S-Cysb-巯基乙醇2Cys-SHd、 巯基的保护巯基的烷基化试剂：碘乙酸、碘乙酰胺 SHICH2COOHSCH2COOHHI（二）根据R基团极性对20种蛋白质氨基酸的分类及三字符缩写按R基的极性分非极性AA（8种）：Ala丙、Val缬、Leu亮、Ile异亮、Met甲硫（蛋）、Phe苯丙、Pro脯、Trp色;极性AA(12种)：R-基不带电荷的AA（中性AA）：Gly甘、Ser丝、Thr苏、Cys半胱氨酸、Asn天冬酰胺、Gln谷氨酰胺、Tyr酪 R-基带正电荷的AA（碱性AA）：Lys赖His组Arg精R-基带负电荷的AA（酸性AA）：Glu谷Asp天冬亚氨基酸：脯，羟脯含硫氨基酸：半胱，胱，甲硫（蛋）含羟基氨基酸：丝，苏芳香族氨基酸：苯丙，酪，色脂肪族氨基酸：甘，丙，缬，亮，异亮三、蛋白质的结构与功能（一）肽的概念及理化性质1、肽的概念肽键：氨基酸的a-羧基与另一个氨基酸的a-氨基脱水形成的化学键。肽：氨基酸之间通过肽键联结起来的化合物称为肽。 由两个氨基酸形成的肽叫二肽，少于10个氨基酸的肽叫寡肽，多于10个氨基酸的肽叫多肽。2、肽的理化性质旋光性：一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。酸碱性质短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。在pH014范围内，肽键中的亚氨基不解离，因此肽的酸碱性质主要取决于端NH和端COOH以及侧链上可解离的基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。等电点（pI）肽中的末端COOH pK值比游离 a.a中的大一些，而末端NH的pK值比游离氨基酸中的小一些，R基变化不大。桑格反应、Edman反应、茚三酮反应肽的特征化反应：双缩脲反应：凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，且可用于定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。肽键的水解（二）蛋白质的初级结构1、一级结构要点：蛋白质中的肽键都是由-NH2和-COOH结合生成的。每一种蛋白质都有相同的肽主链结构，各种蛋白质间的差异是蛋白质的氨基酸种类、2、数量及排列顺序不同。氨基酸的-NH2和-COOH缩合，只有末端及侧链基团有化学活性。每个蛋白质或每个蛋白质的亚基只有一个-NH2 和-COOH分子量大于5000的活性肽才能称为蛋白质。 （三）蛋白质的高级结构 一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构） 是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序 二级结构 超二级结构 构象（高级结构） 结构域 三级结构(球状结构) 四级结构(多亚基聚集体)1、一级结构：共价结构、蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序(含二硫键)2、二级结构：多肽链主链中各个肽段形成的规则的或无规则的构象。主要有-螺旋、折叠、-转角、无规卷曲。-螺旋：其结构特征为：主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋；螺旋每上升一圈是3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm； 相邻螺旋圈之间形成许多氢键； 侧链基团位于螺旋的外侧。 影响-螺旋形成的因素主要是： 存在侧链基团较大的氨基酸残基； 连续存在带相同电荷的氨基酸残基； 存在脯氨酸残基。 -折叠：其结构特征为： 若干条肽链或肽段平行或反平行排列成片； 所有肽键的C=O和NH形成链间氢键；侧链基团分别交替位于片层的上、下方。 -转角：多肽链180回折部分，通常由四个氨基酸残基构成，借1、4残基之间形成氢键维系。 无规卷曲：主链骨架无规律盘绕的部分。 3、超二级结构：由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如、。结构域：大的球蛋白分子中，多肽链形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象是结构域，结构域是多肽链的独立折叠单位，一般由100-200个氨基酸残基构成。4、三级结构：多肽链通过盘旋、折叠，形成紧密的借各种次级键维持的球状构象。或：蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，不含亚基间或分子间的空间排列关系。5、四级结构：寡聚蛋白中亚基种类、数目、空间排布及亚基间相互作用力。单链蛋白质只有一、二、三级结构，无四级结构。 RNase 单条肽链 肌红蛋白 单体蛋白 胰岛素 多条肽链 蛋白质 胰凝乳蛋白酶 相同亚基 一种乳酸脱氢酶4 寡聚蛋白 不同亚基 血红蛋白22蛋白质一级结构(序列)中含有形成高级结构的全部需的信息，一级结构决定高级结构结构及功能。（四）蛋白质的结构与功能的关系1、蛋白质一级结构对高级结构的影响（1）蛋白质结构与功能的关系 蛋白质的顺序异构现象是蛋白质生物功能多样性和种属特异性的结构基础，如一个由20种氨基酸组成的20肽，有21018种顺序异构体。（2）蛋白质一级结构与生物功能的关系 蛋白质一级结构是空间结构的基础，特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成的次级键来维持，蛋白质的多肽链在体内被合成后，即可根据一级结构的特点自然折叠和盘曲，形成一定的空间构象。 因此，蛋白质的一级结构决定了它的二级、三级结构，即由一级结构可以自动地发展到二、三级结构。2、蛋白质的结构与功能的关系（1）同功能蛋白质中氨基酸的种属差异同工（同源）蛋白质：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质(如血红蛋白)。相关研究表明，不同来源的同功能蛋白质的化学结构基本相同，氨基酸种类和顺序也基本相同，只有少数几个氨基酸有相互差异，这些差异不影响功能，仅表现其种属的不同；（2）进化过程中同功能蛋白质在结构上的变化在生物进化过程中同功能蛋白质的结构随生物进化也在不断进化同源蛋白质是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质(如血红蛋白)。 同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有的种属是相同的，称不变残基；而其它位置的氨基酸对不同的种属有相当大的变化，称可变残基；同源蛋白质的氨基酸顺序中这样的相似性称为顺序同源。例如：不同种属来源的细胞色素C中，可以变换的氨基酸残基数目与这些种属在系统发生上的位置有密切关系，即在进化位置上相距愈远，则氨基酸顺序之间的差别愈大。亲缘关系越近的物种，其细胞色素C的结构差异越小；亲缘关系越远，结构差异越大。 所以可以通过细胞色素C的结构分析来核对生物进化的分类关系，以及各个物种在进化过程中的分歧时间；（3）蛋白质结构变化引起功能变化一级结构的变异与分子病:蛋白质有什么样的结构，就有相应的功能。如果结构发生了变化会引起相应的功能变化。这方面最突出的例子是分子病在蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基，即使在整个分子中发生一个残基的异常，该蛋白质的功能也会受到明显的影响。 例如：镰刀形贫血症变构蛋白：能通过构象变化来改变生物（生理）特性（活性）的蛋白质；（变构酶-分子构象变化-活性变化-生化反应变化）（4）一级结构的局部断裂与蛋白质的激活在动物体内的某些生化过程中，蛋白质分子的部分肽链必须先按特定的方式断裂，然后才呈现出活性蛋白质的这一特性是在生物进化过程中发展起来的，具有重要的生物学意义；四、蛋白质的理化性质1、蛋白质的相对分子量：蛋白质是大分子物质，分子量很大，相对分子质量一般在104106 （从一万到几百万）。蛋白质含量（%） 每克样品中的含氮量6.25100 2、蛋白质的两性解离与等电点：蛋白质分子中仍然存在游离的氨基和游离的羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质。蛋白质分子所带正、负电荷相等时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。和氨基酸不同，蛋白质的等电点不是一个常数。3、蛋白质的胶体性质：蛋白质具有亲水溶胶的性质。蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素。 4、蛋白质的紫外吸收：蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基对紫外光有吸收，以色氨酸吸收最强，最大吸收峰为280nm。5、蛋白质的变性及复性：（1） 变性:理化因素引起的蛋白空间结构解体及活性丧失;(可逆、不可逆) 引起蛋白质变性的因素有：高温、高压、电离辐射、超声波、紫外线及有机溶剂、重金属盐、强酸强碱等。变性因素常被应用于消毒及灭菌；保存蛋白质制剂时应注意防止蛋白质变性。绝大多数蛋白质分子的变性是不可逆的。变性蛋白质只有空间构象的破坏。 蛋白质变性的本质是：次级键，二硫键的破坏，并不涉及一级结构的变化。变性蛋白质的特点： 生物活性的丧失； 包藏在分子内部的侧链基团暴露；理化性质改变：如变性后疏水基外露，溶解度降低形成沉淀。球状蛋白质在变性后，分子伸展不对称程度增加，粘度加大，扩散系数降低；生化性质改变：蛋白质变性后分子结构伸展松散，因此，变性蛋白质比天然蛋白质更易受蛋白酶作用，这就是熟食易于消化的道理蛋白变性的本质：变性是由于二级结构以上的空间结构发生改变或破坏所致（即氢键等被破坏）。变性并不引起一级结构的破坏（肽键不被破坏），故组成成分及分子量不变。（2）复性：引起蛋白空间结构解体的理化因素消失，蛋白结构、活性恢复当变性因素去除后，有的变性蛋白质又可缓慢重新回复到天然构象，此现象称为蛋白质的复性。许多蛋白质变性时被破坏严重，不能恢复，称为不可逆性变性。五、蛋白质的分离与纯化1、蛋白质抽提原理及方法蛋白质分离、纯化的过程和一般原则 （1）前处理（Pretreatment）-细胞破碎，蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。（2）粗分级（Rough fractionation） 当蛋白质混合物的提取液获得后，选用一套适当分离纯化方法，使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开。 （3）细分级（Fine fractionation） 是将样品进一步提纯的过程。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白已经大部分被除去。（4）结晶（Crystal）由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。 蛋白质分离纯化的一般方法（1）根据蛋白质分子大小不同的分离方法a. 透析和超滤 透析和超滤b. 密度梯度（区带）离心 c. 凝胶过滤（2）根据蛋白质溶解度的差异进行分离的方法 a. 等电点沉淀蛋白质的盐溶和盐析 b. 有机溶剂分级分离 （3）根据蛋白质电荷不同的分离方法 a. 电泳-在电场中，带电颗粒向着与其带相反电荷的电极移动，这种现象称电泳。b. 离子交换层析 抽提：一般用缓冲液保持pH。可溶蛋白常用稀盐提取，如0.1Mol/L NaCl。脂蛋白可用稀SDS或有机溶剂抽提，不溶蛋白用稀碱处理。抽提的原则是少量多次。要注意防止植物细胞液泡中的代谢物改变pH，可加入碱中和；为防止酚类氧化可加5mMol/L维生素C。加DFP或碘乙酸可抑制蛋白酶活力，防止蛋白被水解。2、蛋白质的分离与纯化的主要方法（1）电泳：蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷，因此在电场中可以移动。电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小。电泳：带电质点在电场中向电荷相反的电极泳动的现象。电泳方法是实验室、生产、临床诊断等常用来分离蛋白质和鉴定蛋白质纯度的手段。 （2）层析：利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离。主要有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等，其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量。 （3）离心：利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。 3、蛋白质的定量方法（1）根据化学组成测定最低分子量利用化学分析，定量测定蛋白质中某一特殊元素的含量，并假定蛋白质中，只含有一个这种元素的原子，即可算出蛋白质的最低分子量。化学方法测得的最低分子量只有和别的方法配合使用时，才能给出真实的分子量；但根据此法得到的真实分子量是十分精确的；（2）用物理化学方法测定蛋白质的分子量沉降速度法：将蛋白质溶液放在超速离心机的离心管中进行超速离心。由于超过重力几十万倍的离心力的作用，而使蛋白质分子沉降下来。大小和形状都相同的蛋白质分子下沉速度相同，在离心管中产生一个明显的界面，利用光学系统可以观察到此界面的移动，从而测得蛋白的沉降速度。一种颗粒在单位离心力场中沉降速率为恒定值，称沉降系数，用s表示。 凝胶过滤法：在层析柱中装入葡聚糖凝胶颗粒。这种凝胶颗粒具有多孔的网状结构。这些网孔只允许较小的分子进入颗粒内，而大于网孔的分子则被排阻。当用洗脱液洗脱时，被排阻的相对分子质量大的分子先被洗脱下来，相对分子质量小的分子后下来。将3种以上相对分子质量有较大的差异的标准蛋白质制成混合溶液，经上柱和洗脱，根据洗脱峰的位置，量出各种蛋白质的洗脱体积。以相对分子质量的对数(lg Mr)和洗脱体积作标准曲线。根据待测蛋白质在相同条件下的洗脱体积，在标准曲线查出其相对分子质量。此法仅适用于球状分子的相对分子质量测定。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度，决定于蛋白分子的大小、形状和电荷数量；而在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度，则决定于蛋白质分子的大小。 SDS(十二烷基硫酸钠)是一种去垢剂，可与蛋白质结合，使其变性并带上大量的负电荷，解离成亚基，同时变成棒状，从而掩盖了蛋白质原有电荷和形状的差异。这样，蛋白质的电泳速度只决定于蛋白质相对分子质量的大小。SDS-凝胶电泳：蛋白质分子的相对迁移率与蛋白质相对分子质量的对数成直线关系。用几种标准蛋白质相对分子质量的对数，对相应的相对迁移率作图，得到标准曲线。根据测得的样品的相对迁移率，从标准曲线上可以查出样品的相对分子质量。酶一、酶的基本概念和作用特点1、酶的概念：酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的高分子生物催化剂。2、作用特点：酶是生物体新陈代谢必不可少的催化物质，没有酶就没有生命活动。（1）催化效率高：酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍，并且至少高出非酶催化反应速度几个数量级。（2）专一性高：酶对反应的底物和产物都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。（3）反应条件温和：酶通常是在接近生物体温和接近中性的环境下催化反应。酶的这一特点可以使一些产品的生产免去高温高压耐腐蚀设备，从而降低成本。（4）活性可调节：酶活力受多种因素的调节和控制。根据生物体的需要，许多酶的活性可受多种调节机制的灵活调节，包括：酶的生物合成的诱导和阻遏，抑制剂调控、共价修饰调控、反馈调控、酶原激活及激素调控等。这些调控保证酶在体内新陈代谢中发挥其适当的催化作用，使生命活动中的种种化学反应都能够有条不紊、协调一致地进行。（5）酶的催化活性离不开辅酶、辅基、金属离子 有些酶是复合蛋白，由酶蛋白和非蛋白小分子物质辅助因子组成，只有二者结合酶才有活性。辅酶o ：非共价结合，能透析去； 辅基：共价结合、金属离子3、酶与非生物催化剂相比的几点共性：催化效率高，用量少（细胞中含量低）。不改变化学反应平衡点。降低反应活化能。反应前后自身结构不变。催化剂改变了化学反应的途径，使反应通过一条活化能比原途径低的途径进行，催化剂的效应只反映在动力学上（反应速度），不影响反应的热力学（化学平衡）。高度专一性：而无机催化剂对作用物没有严格的选择性酶促反应条件温和 ( 酶易失活 )：而无机催化剂往往需要高温、高压、强酸强碱下催化反应（在此条件下，酶反而因失活丧失催化能力）二、酶的国际分类和命名1. 酶的命名（1）习惯命名法： 根据酶作用的底物命名： 淀粉酶（水解淀粉）；蛋白酶（水解蛋白）；根据酶催化的反应命名： 脱氢酶：催化底物脱氢；转移酶：催化基因在底物间转移；丙酮酸脱羧酶：丙酮酸脱CO2根据S与反应命名：谷丙转氨酶；谷-NH +丙酮酸 -酮戊二酸 + 丙-NH 根据来源及特点：胃蛋白酶；胰蛋白酶（2）普通命名法（习惯命名法）根据酶催化的底物来命名：底物+酶如蔗糖酶，蛋白酶，淀粉酶、脂酶、核酸酶等根据酶作用的底物及反应的性质命名：底物+反应类型+酶如琥珀酸脱氢酶，氨基酸氧化酶，异柠檬酸裂解酶等。有时注明酶的来源及特性：如木瓜蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，胃蛋白酶，酸性磷酸酯酶。催化反应的性质：如水解酶、异构酶、裂解酶等。 习惯命名法简单，应用历史长，但缺乏系统性，有时出现一酶数名或一名数酶的现象。（3）国际系统命名法：习惯名（推荐名）：使用方便的酶名； 系统名：标明底物及催化反应、性质习惯名 系统名谷丙转氨酶 丙NH：-酮戊二酸氨基转移酶 （ 反应：丙NH2+-酮 谷 + 丙酮酸）己糖激酶 ATP：己糖磷酸基转移酶 （反应： ATP+G 6-Pi-G + ADP） 2. 酶的分类（1）国际酶学委员会(I.E.C)规定，将所有的酶按催化反应的性质分为6大类，分别用1、2、3、4、5、6编号表示。再根据底物中被作用的基团或键的特点将每一大类分为若干亚类，并按顺序编成1、2、3等数字；每一亚类再分成若干亚亚类，仍用1、2、3编号，这样每一个酶的分类号由四个数字组成，数字间用“.”分开。如：乙醇脱氢酶， 编号为：EC.1.1.1.1； 乳酸脱氢酶， 编号为：EC.1.1.1.27； 柠檬酸裂合酶， 编号为：EC.4.1.1.1E.C: 代表按国际酶学委员会规定的命名; 第1个数字: 代表酶的分类名称催化反应的性质; 第2个数字: 代表亚类底物中被作用的基团或键; 第3个数字: 代表亚亚类; 第4个数字: 代表该酶在亚亚类中的排号;（2）国际系统分类及编号1椐酶催化的反应类型：分六类氧化还原酶类: A-2H + B A+B-2H转移酶类: A-X + B A +B-X水解酶类: A-B + H2O A-H + B-OH裂合酶类: A-B A + B 异构酶类: A B合成酶类: A+ B+ ATP A-B + ADP+ Pi 2酶系统编号EC： 1 酶（大类）：酶催化的反应类型 2（亚类）：反应中S被用基团或键； 3（亚亚类）：S 性质、反应键； 4（酶序号）：（国酶委会） 三、酶的作用机制（一）酶的活性中心酶分子上具有一定空间构象的部位，该部位化学基团集中，直接参与将底物转变为产物的反应过程，这一部位就称为酶的活性中心。 参与构成酶的活性中心的化学基团，有些是与底物相结合的，称为结合基团，有些是催化底物反应转变成产物的，称为催化基团，这两类基团统称为活性中心内必需基团。在酶的活性中心以外，也存在一些化学基团，主要与维系酶的空间构象有关，称为酶活性中心外必需基团。酶的活性中心由酶作用的必需基团组成，这些必需基团在空间位置上接近组成特定的空间结构，能与底物特异地结合并将底物转化为产物。对结合酶来说，辅助因子参与酶活性中心的组成。但有一些必需基团并不参加活性中心的组成。（二）酶的专一性和高效性机制I、酶的专一性机制1、酶专一性类型酶促反应的专一性：分为结构（反应）专一性和立体异构专一性。结构专一性：根据酶对底物结构的要求不同，分为相对专一性和绝对专一性。绝对专一性：这些酶对底物有非常严格的要求，只作用一种底物，而不作用其它任何物质。 相对专一性：酶对底物要求较低，作用的底物不只一种，对作用底物键的两端的要求程度不同又可分为基团专一性和键专一性。a、键专一性：酶对键的两端无严格要求，只要求一定的键。b、基团专一性：又称为族专一性，酶不但要求底物一定的化学键，而且对键一端的基团也有严格要求。立体异构专一性：几乎所有的酶对于立体异构体都具有高度的专一性。酶对底物的立体构型的特异要求。可分为：a、旋光异构（光学）专一性：当底物有旋光异构体时，酶只作用其中的一种。b、几何异构专一性 2、酶作用专一性的机制（1）锁钥学说：因特定的酶与底物在表面结构的特定部位其形状是互补的，一定的酶只能与一定的底物结合，就象一把钥匙对一把锁一样；Emil Fischer提出的锁钥结合学说解释酶的高度专一性，但它不能解释可逆反应中酶既适应与底物又适应与产物。（2）诱导契合学说酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。 D.E.Koshland 提出了诱导契合学说，认为：酶活性部位的构象是柔韧可变的。酶同底物结合时，酶活性部位因受底物的诱导，会改变其构象使适合与底物契合而结合成中间络合物，进行反应。当酶从ES复合物分离出来后，即恢复其原有构象。（3）结构性质互补假说： S 与 E 构象互补；性质互补（-、+）；极性互补；（4）“三点附着”假说：底物分子与酶活性中心的基团必须三点都互补匹配，酶才作用于这个底物。II、酶作用高效率的机制1、临近效应和定向效应 酶可使其底物结合在它的活性部位。底物分子在酶活性中心区域的有效浓度大大增高，从而加速反应。 酶与底物特异性结合后，酶的构象发生变化，使其催化位点基团和结合位点基团正确地排列并定位，使参加反应的几种底物基团定向于酶的催化部位。底物分子和酶活性中心上的一个催化团在相互作用时的趋近效应两种效应对反应速度的影响：使底物浓度在活性中心附近很高酶对底物分子的电子轨道具有导向作用酶使分子间反应转变成分子内反应临近效应和定向效应对底物起固定作用2、张力作用：酶与底物结合时，酶的构象会发生变化，酶分子构象变化可对底物产生张力，使底物分子中的敏感键产生张力或变形，使敏感键更易于破裂。 酶从低活性形式转变为高活性形式底物扭曲、变形底物构象变化，变得更像过度态结构，大大降低活化能。3、共价催化：又称共价中间产物学说。酶和底物（因亲核、电效应）以共价键形成一个不稳定的共价中间复合物，这些复合物比无酶存在时更容易进行化学反应，使反应加快。亲核共价催化亲电共价催化4、酸碱催化 指广义的酸碱催化，即质子供体和质子受体对酶促反应的催化作用，催化了细胞内的许多种类的有机反应。参与酸碱催化的基团：氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基。影响酸碱催化反应速度的两个因素酸碱强度，咪唑基在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。给出质子或结合质子的速度，咪唑基最快酸催化酯、酰胺和肽的水解碱催化酯、酰胺水解5、微环境效应(酶活性中心的低介电区效应) 一般酶的活性中心穴内是一个相对的非极性区，因此酶的催化基团被低介电环境包围，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力，加速酶反应。 疏水环境酶活性中心附近往往是疏水的，介电常数低，可加强极性基团间的反应。电荷环境在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子，增加酶促反应速度。酶催化反应的高效性，可能是由于以上五种因素中的几种因素协同作用的结果，而非酶催化反应往往只有一种催化机制。四、影响酶促反应速度的主要因素酶促反应的速度取决于底物浓度、酶浓度、pH、温度、激动剂和抑制剂等。、底物浓度）在底物浓度较低时，反应速度随底物浓度的增加而上升，加大底物浓度，反应速度趋缓，底物浓度进一步增高，反应速度不再随底物浓度增大而加快，达最大反应速度，此时酶的活性中心被底物饱合。）米氏方程式VVmaxSKmSa.米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。b.Km值愈小，酶与底物的亲和力愈大。c.Km值是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、酶所催化的底物和反应环境如温度、PH、离子强度有关，与酶的浓度无关。d.Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比。、酶浓度在酶促反应系统中，当底物浓度大大超过酶浓度，使酶被底物饱和时，反应速度与酶的浓度成正比关系。、温度温度对酶促反应速度具有双重影响。升高温度一方面可加快酶促反应速度，同时也增加酶的变性。酶促反应最快时的环境温度称为酶促反应的最适温度。酶的活性虽然随温度的下降而降低，但低温一般不使酶破坏。酶的最适温度不是酶的特征性常数，它与反应进行的时间有关。、pH酶活性受其反应环境的pH影响，且不同的酶对pH有不同要求，酶活性最大的某一pH值为酶的最适pH值，如胃蛋白酶的最适pH约为1.8，肝精氨酸酶最适pH为9.8，但多数酶的最适pH接近中性。最适pH不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液的种类与浓度、以及酶的纯度等因素影响。、激活剂使酶由无活性或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂，大多为金属离子，也有许多有机化合物激活剂。分为必需激活剂和非必需激活剂。、抑制剂凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂。大多与酶的活性中心内、外必需基团相结合，从而抑制酶的催化活性。可分为：）不可逆性抑制剂：以共价键与酶活性中心上的必需基团相结合，使酶失活。此种抑制剂不能用透析、超滤等方法去除。又可分为：a.专一性抑制剂：如农药敌百虫、敌敌畏等有机磷化合物能特民地与胆碱酯酶活性中心丝氨酸残基的羟基结合，使酶失活，解磷定可解除有机磷化合物对羟基酶的抑制作用。b.非专一性抑制剂：如低浓度的重金属离子如汞离子、银离子可与酶分子的巯基结合，使酶失活，二巯基丙醇可解毒。化学毒气路易士气是一种含砷的化合物，能抑制体内的巯基酶而使人畜中毒。）可逆性抑制剂：通常以非共价键与酶和（或）酶底物复合物可逆性结合，使酶活性降低或消失。采用透析或超滤的方法可将抑制剂除去，使酶恢复活性。可分为：a.竞争性抑制剂：与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶与底物结合形成中间产物。如丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用；磺胺类药物由于化学结构与对氨基苯甲酸相似，是二氢叶酸合成酶的竞争抑制剂，抑制二氢叶酸的合成；许多抗代谢的抗癌药物，如氨甲蝶呤（MTX）、5-氟尿嘧啶（-FU ）、6-巯基嘌呤（6-MP)等，几乎都是酶的竞争性抑制剂，分别抑制四氢叶酸、脱氧胸苷酸及嘌呤核苷酸的合成。 Vmax不变，Km值增大b.非竞争性抑制剂：与酶活性中心外的必需基团结合，不影响酶与底物的结合，酶和底物的结合也不影响与抑制剂的结合。 Vmax降低，Km值不变c.反竞争性抑制剂：仅与酶和底物形成的中间产物结合，使中间产物的量下降。 Vmax、 Km均降低五、别构酶和共价修饰酶1、别构酶 别构酶又称变构酶，别构酶除了活性中心外，还有1个或几个部位可与特异性分子非共价地结合而改变酶的构象，导致活性的改变，具有这种变构调节作用的酶称变构酶。与酶结合的特异性分子称为效应剂或调节物。（1）别构酶的特点 已知的别构酶都是寡聚酶，含有两个或两个以上亚基具有活性中心和别构中心（调节中心），活性中心负责底物结合和催化，别构中心负责调节酶反应速度。活性中心和别构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上。多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同种效应，底物就是调节物：有的别构酶不止一个别构中心，可以接受不同的代谢物的调节。别构酶由于同位效应和别构效应，不遵循米式方程，动力学曲线也不是典型的双曲线型，而是S型（同位效应为正协同效应）和压低的近双曲线（同位效应为负协同效应）。（2）别构酶的别构效应 调节物与酶的别构中心结合后，诱导出或稳定了酶的某种构象，影响酶对底物的结合与催化作用，从而调节酶的反应速度及代谢过程。别构效应与酶的四级结构相关。根据别构效应对反应速度的调节可分为正协同效应和负协同效应。a、正协同效应：可增加反应速度的作用。具有这种效应的物质为正调节物（变构激活剂）。多为别构酶的底物。b、负协同效应：降低反应速度。具有这种效应的物质为负调节物（变构抑制剂）。常为代谢反应序列的终产物。根据调节物是底物与否分为同促效应和异促效应。a、同促效应：调节物分子是底物，酶分子上有两个以上底物结合中心，其调节作用取决于调节中心是否被底物（调节物）结合。b、异促效应：调节物是非底物分子。很多变构酶既有同促效应，又有异促效应。（3）变构酶作用的动力学 变构酶动力学不符合米氏酶的动力学，底物浓度曲线呈S形，所以当反应速度达到最大速度一半时的底物的浓度，不能用Km表示，而以S0.5或者K0.5表示。正调节物与酶结合后，酶构象的变化有利于底物分子与酶结合，使酶促反应速度依赖于底物浓度的变化更为敏感。正调节物使S型曲线左移，饱和量的正调节物可将S形曲线转变为双曲线。 负调节物与变构酶结合后，不利于随后的酶与底物的结合，使酶促反应速度依赖于底物浓度不敏感，而且很难达到最大反应速度。负调节物使S形曲线右移。 如ATP是磷酸果糖激酶的变构抑制剂；ADP、AMP为其变构激活剂。生理意义 在变构酶的S形曲线中,底物浓度稍有升高，则酶活性迅速上升，使得酶对底物浓度变化非常敏感，因此可以快速调节细胞内底物浓度和代谢速度。 负调节物常是代谢途径的终产物，变构酶常处于代谢通路的开端，通过反馈抑制，可以及早地调节整个代谢通路，减少不必要的底物消耗。研究较多的是人和动物的乳酸脱氢酶(LDH)，它有5种同工酶：两种亚基以不同比例组成五种四聚体即为一组LDH同工酶LDH1(H4)、LDH2(H3M)、LDH3(H2M2)、LDH4(HM3)和LDH5(M4)。电泳可将它们分开。 在临床检验方面，通过观测病人血清中LDH同工酶的电泳图谱，辅助诊断哪些器官组织发生病变，这远较单纯测定血清LDH总活性的方法敏感。例如，心肌受损病人血清LDH1含量上升，肝细胞受损者血清LDH5含量增高。2、共价修饰酶某些酶分子上的基团可以在另一种酶催化下发生共价修饰作用（例如磷酸化或去磷酸化作用），从而引起酶活性的激活或抑制。这种作用称为共从修饰作用，这类酶则称为共价调节酶。 共价修饰调控有如下两个特点： （1）被修饰的酶可以有两种互变形式，即一种为活性形式（肯有催化活性），另一种为非活性形式（无催化活性）。正反两个方向的一变均发生共价修饰反应，并且都将引起酶活性的变化。 例如，肌肉中存在一种能催化糖原的合成和分解的酶，即磷酸化酶b。该酶本身无活性，当磷酸化酶b活性中心的丝氨酸残基被磷酸化后，即形成高活性磷酸化酶a。 由磷酸化酶b转化为活性式a的反应，被磷到化酶激酶所催化，而磷酸化酶a去活化（去磷酸化）则由另一种磷酸酶所催化。 除了磷酸化以外，还可以有其它的共价修饰形式。 （2）共价修饰调节作用可产生酶的连续激活现象，所以具有信号放大效应。例如肾上腺素引起糖原分解过程中的一系列磷酸化激活步骤，共结果将激素的信号被逐级放大了约300万倍。六、同工酶（1）概念：同工酶是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。同工酶是由不同基因或等位基因编码的多肽链，或由同一基因转录生成的不同mRNA翻译的不同多肽链组成的蛋白质。翻译后经修饰生成的多分子形式不在同工酶之列。同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中。（2）同工酶的研究具广泛的意义和应用：研究基因突变，是生物遗传学上的重要信号。从同工酶的变化上可反映出在发育过程中基因表达顺序。在代谢过程中起重要的调节控制作用。同工酶分析法在植物育种上用于优势杂交组合的预测。病理学、防疫学研究。生物进化、生物地理分布、群体遗传的研究工具。七、维生素和辅酶单纯酶：仅由氨基酸残基构成的酶。结合酶：酶蛋白：决定反应的特异性；辅助因子：决定反应的种类与性质；可以为金属离子或小分子有机化合物。可分为辅酶：与酶蛋白结合疏松，可以用透析或超滤方法除去。辅基：与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤方法除去。酶蛋白与辅助因子结合形成的复合物称为全酶，只有全酶才有催化作用。参与组成辅酶的维生素转移的基团辅酶或辅基所含维生素氢原子NAD+NADP+尼克酰胺（维生素PP）FMNFAD维生素B2醛基TPP维生素B1酰基辅酶A硫辛酸泛酸、硫辛酸烷基钴胺类辅酶类维生素B12二氧化碳生物素生物素氨基磷酸吡哆醛吡哆醛（维生素B6）甲基、等一碳单位四氢叶酸叶酸1、辅酶与辅基的生理功用主要是： 运载氢原子或电子，参与氧化还原反应。 运载反应基团，如酰基、氨基、烷基、羧基及一碳单位等，参与基团转移。大部分的辅酶与辅基衍生于维生素。 2、 维生素：是指一类维持细胞正常功能所必需的，但在许多生物体内不能自身合成而必须由食物供给的小分子有机化合物。 维生素可按其溶解性的不同分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类。脂溶性维生素有VitA、VitD、VitE和VitK四种；水溶性维生素有VitB1，VitB2，VitPP，VitB6，VitB12，VitC，泛酸，生物素，叶酸等。 （1）TPP：即焦磷酸硫胺素，由硫胺素（Vit B1）焦磷酸化而生成，是脱羧酶的辅酶，在体内参与糖代谢过程中-酮酸的氧化脱羧反应。 （2）FMN和FAD：即黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），是核黄素（VitB2）的衍生物。FMN或FAD通常作为脱氢酶的辅基，在酶促反应中作为递氢体（双递氢体）。 （3）NAD+和NADP+：即尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+，辅酶）和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+，辅酶），是Vit PP的衍生物。NAD+和NADP+主要作为脱氢酶的辅酶，在酶促反应中起递氢体的作用，为单递氢体。 （4）磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺：是Vit B6的衍生物。磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺可作为氨基转移酶，氨基酸脱羧酶，半胱氨酸脱硫酶等的辅酶。 （5）CoA：泛酸（遍多酸）在体内参与构成辅酶A（CoA）。CoA中的巯基可与羧基以高能硫酯键结合，在糖、脂、蛋白质代谢中起传递酰基的作用，是酰化酶的辅酶。 （6）生物素：是羧化酶的辅基，在体内参与CO2的固定和羧化反应。 （7）FH4：由叶酸衍生而来。四氢叶酸是体内一碳单位基团转移酶系统中的辅酶。 （8）Vit B12衍生物：Vit B12分子中含金属元素钴，故又称为钴胺素。Vit B12在体内有多种活性形式，如5-脱氧腺苷钴胺素、甲基钴胺素等。其中，5-脱氧腺苷钴胺素参与构成变位酶的辅酶，甲基钴胺素则是甲基转移酶的辅酶。 八、酶的分离与纯化酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍：一、预处理及固液分离技术1.细胞破碎（cell disruption）高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质