（微生物学专业论文）液体发酵生产桦褐孔菌菌丝体及活性成分的研究.pdf

摘要 摘要 桦褐孔菌 i n o n o t u so b t i q u u s 是珍稀的大型药用真菌 在俄罗斯已有一百多年的应 用历史 能治疗多种疾病 具有抗肿瘤 降血糖 抗病毒 增强免疫和抗氧化 诱导肿 瘤细胞凋亡等作用 为得到大量桦褐孔菌菌体及活性成分 本论文首先从实验室保存的 两株菌株中确定了一株出发菌株 研究了高产胞内 外多糖的液体培养条件 并对胞内 多糖和三萜化合物提取工艺进行了研究 最后对多糖的性质进行初步的鉴定 结果如下 1 通过对桦褐孔菌w 和d 菌株的筛选 发现d 菌株生长快 菌丝致密 多糖产量 高 同时对其菌落形态和菌丝形态进行了比较 确定菌株d 为出发菌株 并且通过正交 试验得到桦褐孔菌d 菌株的液体发酵最佳培养基组成为 葡萄糖2 5 麸皮o 7 玉 米粉0 8 黄豆粉1 酵母粉o 4 磷酸二氢钾0 1 硫酸镁0 0 5 培养基的起 始p h 6 0 最佳液体摇瓶培养条件为 培养温度2 8 c 装液量1 0 0m l 2 5 0m l 接种量 1 0 v n 转速为1 6 0r m i n 最佳培养时间1 0 天 在此培养条件下桦褐孔菌菌体为蓬 松 绒毛状的菌球 并且有利于菌体生长和多糖代谢 其最大菌体干重 胞外多糖 胞 内多糖分别为4 1 1 2g l 5 9 5g l 2 9 3g l 2 正交试验优化得到了胞内多糖最佳的提取条件为 水料比4 0 1 提取温度8 0 提取时间2h 提取次数2 次 3 倍体积的7 5 乙醇沉淀 醇沉温度4 c 时 此时胞内多 糖提取率为5 9 5m g g 另外通过单因素试验确定了桦褐孔菌三萜化合物的最佳提取工艺参数为 提取溶剂 采用异丙醇 溶剂用量为8 0m l g 提取时间为2h 提取温度为8 0 c 桦褐孔菌三萜最 高提取率达到8 8 5 3 对桦褐孔菌胞内 外多糖的性质进行了初步鉴定 其中胞内总糖含量为5 9 9 5 肽含量为2 3 8 1 单糖含量0 2 6 胞外总糖含量为6 2 8 6 肽含量2 4 5 1 单糖含 量0 3 1 经h p g f c 检测到桦褐孔茵胞内 外多糖的有效成分峰的分子量分别为7 6 2 8 0 1 k d a 和9 5 3 0 0 5k d a 归一化含量分别为7 8 5 6 和6 2 2 3 桦褐孔菌胞外多糖和胞内 多糖中都含有1 7 种氨基酸 其中必需氨基酸含量分别占氨基酸总量的1 9 2 3 和1 6 6 0 在这1 7 种氨基酸中 含量均以谷氨酸最高 天冬氨酸次之 在1 9 0 4 0 0n m 区间进行紫 外扫描 胞内 胞外多糖均出现蛋白结合多糖的特征 通过红外光谱分析 均具有a 和d 类型的糖苷键 关键词 桦褐孔菌 液体培养 胞外多糖 胞内多糖 三萜化合物 a b s t r a c t i n o n o t u so b l i q u u s f r p i l a th a sb e e nk n o w nf o ro v e ro n eh u n d r e dy e a r sa sam e d i c i n a l f u n g ii nr u s s i a nf e d e r a t i o n i tc a nt r e a tm a n yd i f f i c u l td i s e a s e s s u c ha sa n t i t u m o r a n t i i n f l a m m a t o r y a n t i o x i d a n t h y p o 酉y c e m i c h y p o c h o l e s t e r o l e m i c i m m u n o s t i m u l a t i n g a c t i v i t i e sa n ds 0o n i n o n o t u so b l i q 姗dw a ss c r e e n e di nt h i sp a p e r a n d 也eo p t i m u m f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fi n o n o t u so b l i q u u sdf o rh i g hy i e l do fi n t r a c e l l u l a ra n de x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r o p e p t i d e t h e e x t r a c t i v e t e c h n i q u e o fi n t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d ea n d t r i t e r p e n o i d sf r o mi n o n o t u so b l i q u u sw e r ea l s os t u d i e d 1 1 1 ec h a r a c t e r i z a t i o no fi n t r a c e l l u l a r a n de x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r o p e p t i d ew a sp r i m a r i l yi d e n t i f i e d t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s l n o n o t u so b l i q u u dw i t hh i g hg r o ws p e e d d e n s eh y p h a ea n dh i g hy i e l do f p o l y s a c c h a r i d ew a ss c r e e n e d s u b m e r g e df e r m e n t a t i o no fi n o n o t u so b l i q u u sd w a ss t u d i e d t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nm e d i u mw e r ea sf o l l o w s g l u c o s e2 5 y e a s te x t r a c to 4 c o m m e a lo 8 s o y b e a nf l o u r1 0 w h e a tb r a n0 7 k 2 h p 0 40 1 a n dm g s 0 40 0 5 p h 6 0 t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw e r ea sf o l l o w s i n o c u l a t i o na m o u n t10 v n m e d i u ml o a da m o u n t10 0m l 2 5 0m l s h a k i n gf l a s k t e m p e r a t u r e2 8 c c u l t u r et i m e10d a y s r o t a r ys p e e d so fs h a k i n gf l a s ki s 16 0r m i n u n d e rt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nm e d i u ma n d c o n d i t i o n s l n o n o t u so b l i q u u sdh o l d e dr o u g hp e l l e t s a n dt h ey i e l do fm y c e l i u md r yw e i g h t t h ey i e l do fe x t r a c e l l u l a ra n di n t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d eo f l n o n o t u so b l i q u u sa r er e p e c t i v e l y w e r e4 1 1 2g l 5 9 5e g l 2 9 3g l e x t r a c t i o nc o n d i t i o n so fp o l y s a c c h a r o p e p t i d ew e r eo b t a i n e d w h i c hw e r ea sf o l l o w s e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e8 0 c t h er a t i o no fm a t e r i a lt ow a t e r1 4 0 e x t r a c t i o nt i m e2h o u r s e x t r a c t2t i m e s t h ev o l u m i n a lr a t i oo fe t h a n o lt os u p e m a t e3 1a n dd e p o s i t i o nt e m p e r a t u r e 4 c u n d e rt h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n s t h ee x t r a c t i o nr a t eo fp o l y s a c c h a r o p e p t i d ew a s 5 9 5m e g g 1 1 1 ee x t r a c t i v et e c h n i q u eo f t r i t e r p e n o i d sf r o ml n o n o t u so b l i q u l i sw a sa l s os t u d i e d n l eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o no ft r i t e r p e n o i dw e r e 8 0 m l gi s o p r o p a n o la n dt h e e x t r a c t i o nt i m e2h 晰t l l8 0 c u n d e rt h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n s t h ee x t r a c t i o nr a t eo f t r i t e r p e n o i d sw a s 8 8 5 t h ec h a r a c t e r i z a t i o no fi n t r a c e l l u l a ra n de x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r o p e p t i d e w e r e p r i m a r i l yi d e n t i f i e d n l er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x t r a c e l l u l a rt o t a ls u g a rc o n t e n tw a s5 9 9 5 p e p t i d ec o n t e n tw a s2 3 81 r e d u c i n gs u g a rc o n t e n tw a s0 2 6 t h ei n t r a c e l l u l a rt o t a ls u g a r c o n t e n tw a s6 2 8 6 p e p t i d ec o n t e n tw a s2 4 51 r e d u c i n gs u g a rc o n t e n tw a s0 31 t h e m o l e c u l a rw e i g h to fv a l i dp e a kt h ei n t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r o p e p t i d ei s7 6 2 8 0 1k d aa n di t s c o n t e n ti s7 8 5 6 i nt o t a l t h ee x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r o p e p t i d ei s9 5 3 0 0 5k d aa n di t s c o n t e n ti s6 2 2 3 t h e r ew e r es e v e n t e e nk i n d so fa m i n oa c i d si ni n t r a c e l l u l a ra n de x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r o p e p t i d e a n de s s e n t i a la m i n oa c i da c c o u n t e df o r19 2 3 a n d16 6 0 o ft h et o t a l a m i n oa c i d s r e s p e c t i v e l y i ni n t r a c e l l u l a ra n de x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r o p e p t i d e g l u t a m i c a c i da c c o u n t e dl a r g e s t a n da s p t i ca c i da c c o u n t e ds e c o n dl a r g e s tt h e p o l y s a c c h a r o p e p t i d ew a s s c a n n e db yu vf r o m19 0n n lt o4 0 0n n l a n dt h ef i g u r es h o w e dt h ec h a r a c t e r i s t i co f p r o t e g l y c a n t h e ya l s os h o w e dc h a r a c t e r i s t i co fa l i n k a g e sa n dl b l i n k a g e sb ya n a l y s i s 忻t 1 1i r i i i a b s t r a c t k e y w o r d s i n o n o t u so b l i q u u s s u b m e r g e dc u l t u r e e x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e i n t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e t r i t e r p e n o i d s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本j d f 导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名 毖函 日 期 麴翌墨 堡 盟 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留 使用学位论文的规定 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允 许论文被查阅和借阅 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名 滥豳 导师签名 日 期 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 生物一般分为动物 植物和菌物三大类 人们通常把真菌 细菌 放线菌等总称为 菌物 真菌是菌物中种类最多 形态差异最大的一类 全世界己知真菌大约有2 0 多万 种 我国至少有1 0 万余种 已报道8 0 0 0 种左右 许多真菌与我们的日常生活关系密切 而药用真菌是指能治疗疾病 具有药用价值的一类真菌 即对人体有保健作用 对疾病 有预防 抑制或治疗作用的真菌 其中有些种类不仅具有医疗保健作用 而且还可以食 用 被称为药食兼用真菌 广义都称为药用真菌 目前已知我国传统的药用真菌达5 l 科3 8 7 种 主要分属于担子菌和子囊菌两大类 其中担子菌4 4 科3 4 5 种 子囊菌类药 用真菌7 科2 8 种 常见的药食用真菌有灵芝 g a n o d e r m al u c i d u m 香菇 l e n t i n u l a e d o d e s 木耳0 u r i s c a l p i u ma u r i c u l a 猴头菌 h e r i e i u mc a p t m e d u s a ej 获荃 p a c h y m a c o c o s 竹黄 s h i r a i ab a m b u s i c o l a 冬虫夏草 c o r d y c e p ss i n e n i s 等 1 2 药 食 用真菌的生物学特性 药用真菌在分类上多属于担子菌亚门和子囊菌亚门 其种类繁多 大小不同 形态 各异 但不论大小 形态如何差异 一般都是由营养器官 简称菌丝体 和繁殖器官 简称 子实体 两大部分组成 菌丝体是药用真菌的营养器官 由许多菌丝集合而成 多呈丝 状或须状 广泛存在于土壤 树木等各种基质中 相当于高等植物的根 茎 叶 菌丝 具有不断向外生长和扩展的能力 其主要作用是分解基质 吸收营养 输送和贮存营养 并进行无性繁殖 当菌丝生长到一定时期 能相互纠结形成菌索 菌核和子座等各种营 养体的变态 子实体是药用真菌的繁殖器官 相当于高等植物的花 果 是药用真菌产 生孢子的机构 它和营养菌丝相比 功能发生了特异化 以伞菌为例 菌丝进一步形成 菌丝束 菌丝束相互扭结 逐步发育成盘状 颗粒状 被称为形成子实体的原基 原基 进一步分化出菌盖 茵褶 菌柄 菌环 菌托等 由于子实体的形态各异 为药用真菌 的分类提供了重要的依据 真菌的生殖方式可分为有性生殖和无性生殖两大类 药用真菌的有性生殖一般表现 为两个可亲和的有性孢子萌发生成的两种形态无差别 但性别不同的初生菌丝之间的结 合 其整个过程可分为质配 核配和减数分裂三个阶段 无性生殖也有多种方式 有无 性抱子的产生 菌丝体断裂 以及芽殖等 在药用真菌的栽培中 菌索 菌核 子实体 的组织分离 菌种转管 均是利用无性生殖繁殖后代的重要形式 1 3 药用真菌的培养研究 自从列文虎克利用显微镜观察茵体的形态使人们对微生物的研究成为可能后 科赫 k o c h 于1 8 8 1 年发表了第一篇介绍固体培养基及混合培养物进行纯培养技术论文1 1 j 所 谓纯培养技术就是除了可以对研究对象进行形态观察外 还可对其生长所需的营养要 求 环境条件和生长特性进行深入研究的方法t 2 1 9 0 2 年b m 达格尔发明了双孢蘑菇 江南大学硕士学位论文 纯菌种制作技术 由此开创了纯菌种人工接种栽培食 药 用真菌新阶段 人们根据微生 物自然多样的特点 又研究出多种培养方式 3 l 但纯培养技术在实验室里被频繁和常规 的用于分离 纯化 活细胞计数和培养微生物 现在已有数千种细菌 病毒和约1 0 万 种真菌在实验室中得到了纯培养 4 食 药 用真菌是异养型的微生物 在生长过程中所需要的营养物质碳源 氮源 微 量元素及维生素等主要靠腐生和共生方式获得 他们是食 药 用真菌维持生命活动的物 质基础 营养物质及环境条件的好坏决定菌丝体的生长速度和干重的积累 因此药用真 菌的纯培养条件的研究为药用真菌培养基和培养料的科学制备提供了科学依据 液体深层发酵技术属于现代生物技术 这一概念是2 0 世纪4 0 年代由当时的美国弗 吉尼亚大学生物工程专家g a d e n 提出 5 食用菌深层发酵可在短期内得到大量的食用菌 菌丝体及其代谢产物 生产效率是农业栽培无法比拟的 影响深层培养菌丝体生长的因 素主要有培养基的成分 浓度 温度 p h 值 通气量等 这些成分的存在形式 浓度 及配比都会影响菌丝体的生长 1 4 药 食 用真菌多糖 近年来有关真菌多糖的分离纯化 生物活性和化学组成及结构修饰等方面的研究已 有了较大的进展 6 2 0 世纪6 0 年代 人们逐渐发现真菌多糖具有多方面的生物活性 如香菇多糖 银耳多糖 灵芝多糖 茯苓多糖及蜜环菌多糖等都具有增强免疫功能和抗 癌等作用 真菌多糖存在于真菌菌丝 子实体及其发酵液中 是由1 0 个以上的单糖以 糖苷键连接而成的多糖或蛋白结合多糖体 且大多数真菌的抗肿瘤活性物质均具有特定 结构 目前 真菌多糖己被广泛应用于免疫缺陷性疾病 自身免疫性疾病及肿瘤等的临 床治疗中 被称为重要的生物效应调节剂 近年来药用真菌多糖及其复合物的研究已成 为分子生物学 医药及食品科学等领域的研究热点 1 4 1 真菌多糖的代谢调控 以往的真菌多糖多由子实体萃取得到 来源十分有限 现已知约有5 0 的食药用真 菌于液态培养条件下可以产生胞外多糖 所以通过发酵作用来进行多糖提取 成为大批 量生产多糖的有效途径 在液态培养时 各种理化因素都会影响食药用真菌的生长速度 生物量的多少及代谢特征等 因此 可以通过培养基碳 氮源的筛选来选择多糖产生的 适宜条件 多糖的产生除受营养物质的影响外 也受到其他因素的影响 例如氧对多糖 的合成有较显著的促进作用 1 4 2 真菌多糖的结构 1 4 2 1 真菌多糖的结构层次 按照多糖的结构分类方法 真菌多糖的结构可分为一级 二级 三级和四级结构 一级结构是指真菌多糖中单糖残基的组成 排列顺序 连接方式 异头物构型以及糖链 有无分支 分支的位置与长短等 二级结构指真菌多糖骨架链间以氢键结合所形成的各 种聚合体 只关系到多糖分子中主链的构象 不涉及侧链的空间排布 三级结构指多糖 2 第 章绪论 残基中的羟基 羧基 氨基以及其他官能团之间通过非共价作用而导致的有序 规则而 粗大的空间构象 四级结构指多糖的多聚链间以非共价作用力而结合形成的聚集体 刀 1 4 2 2 真菌多糖的结构分析 真菌多糖的结构分析包括对其一级结构和高级结构的分析 真菌多糖的一级结构分 析包括对单糖组分 糖基连接方式 糖苷键的构型及不同糖苷键组成比例等的分析 在 单糖组分的分析中 一般先对多糖进行完全水解 再用纸层析 薄层层析 气相层析等 方法进行鉴定 在糖基连接方式的分析中 通常采用甲基化分析法 高碘酸氧化法 s m i t h 降解法 核磁共振等方法 在糖苷键构型的分析中 可采用糖苷酶水解 核磁共振 质 谱等方法 对不同糖苷键比例的分析可通过测红外光谱相对面积来完成 对一级结构的 分析 除以上各种方法外 目前还有毛细管电泳 同位素 免疫化学法等方法 目前 对真菌多糖高级结构的分析还没有深入 测定方法还未达到像核酸和蛋白质结构测定那 样自动化 微量化和标准化 现在主要是应用物理方法进行分析 如x 射线 纤维衍射 核磁共振 电子衍射等 1 4 3 真菌多糖的活性与构效关系 真菌多糖的生物活性与其化学结构有着密切的关系 一直是人们关注的焦点 由于 真菌多糖结构的复杂性 现在的结构研究大多还局限于一级结构上 对一级结构而言 影响其生物活性的因素包括三个 第一 单糖的组成 有抗肿瘤作用的真菌多糖大多是 由葡聚糖组成的 如香菇多糖 裂褶多糖 灵芝多糖等 第二 糖苷键的类型 大多活 性多糖的主链上都具有p 1 3 糖苷键 l e u n g 等从金针菇细胞壁中提取出一种碱溶性多 糖 它由b 1 3 d 葡聚糖组成 经试验证明该多糖有抑瘤活性 8 第三 连接在p d 葡聚糖骨架上的一些基团如聚羟基 聚醛基 羧甲基 乙酰基 硫酸基等对真菌多糖的 生物活性发挥起重要作用 例如从茯苓多糖菌核中得到的茯苓多糖 基本没有抗肿瘤活 性 但制成羧甲基多糖后 水溶性增大 并具有强烈的抗肿瘤活性 真菌多糖所具有的 缔合 胶束结构 憎水键以及多糖分子的挠曲度等高级结构都对其活性产生影响 具有 b 3 股螺旋结构的葡聚糖大多都具有免疫活性 另外 真菌多糖的分子量 溶解度 粘 度 给药剂量和给药途径等都影响其功能活性 最近多糖受体的发现认为 当多糖与受体作用时 只有分子中几个寡糖片段与受体 结合 在多糖分子中存在一个或几个寡糖片段的 活性中心 如香菇多糖分子量为5 0 万 其分子中的七糖重复单元是它的中心1 9 1 5 桦褐孔茵的研究 1 5 1 桦褐孔茵简介 一桦褐孔菌 1 n o n o t u so b l i q u u s f r p i l a t 是珍稀的大型药用真菌 又名 白桦茸 桦 褐孔菌 斜生纤孔菌 英文名为 c h a g a b l a c kb i r c ht u c h w o o d c l i n k e rp o l y p o r e k a b a n o a n a t a k e 等 该菌属担子菌亚门 层菌纲 非褐菌目 无褶菌目或多孑l 菌目 多孔 菌科 褐卧孔菌属 纤孔菌属 主要寄生在白桦 银桦 榆树 赤杨等的树皮下或活力 3 江南大学硕士学位论文 木的树皮下或砍伐后树木的枯干上 该菌很少形成子实体 其不育性子实体呈现瘤状 外表坚硬 黄褐色至黑色 有明显凹凸不平开裂的小块 初生于树皮下 脱皮后露出 平铺扩展 大小不一 初为白色 逐渐变黄色 淡褐色至褐色 担孢子无色至淡褐色 菌肉组织由褐色刚毛状菌丝和淡黄色生殖菌丝组成 刚毛体暗褐色 生物学研究表明 桦褐孔菌在野生状态下生长极为缓慢 野生品种只有在活的桦树上生长1 0 1 5 年才具有 很高的药用价值 并且 每两万棵桦树上大约只有一棵着生桦褐孔菌 因此 野生的桦 褐孔菌价格十分昂贵 所以提高发酵菌丝体的质量及从中提取大量的活性物质还有待进 一步研究 1 5 2 桦褐孔茵的研究现状及应用前景 桦褐孔菌因人 r 黝l l 化栽培尚未实现 更加珍贵的是野生的品种只有在活的桦树上生 长1 0 1 5 年才具有很好的药用价值 并且 每两万棵桦树上大约只有一棵生长着桦褐孑l 菌 因此野生的桦褐孔菌价格十分昂贵 大约为桑黄价格的7 8 倍 因桦褐孔菌十分珍贵 美国 日本 韩国已加大了对桦褐孔菌的研究力度 日本已在世界各国提出了专利申请 保护 美国也把它列为 特殊天然物 作为宇宙人的未来饮品 韩国正在进液体培养和 菌丝体培养研究 桦褐孔菌是饮料 调味品 饼干及面包类 香肠等加工类肉品 中药 材的辅助品 是颜色深的食用色素原料 由于桦褐孔菌对预防s a r s 病毒有作用 桦褐 孔菌的研究及其产品的开发具有十分广阔的应用前景 1 5 3 桦褐孔茵的药用价值及化学成分 据目前的研究报道 桦褐孔菌的化学成分有桦褐孔菌烈1 0 桦褐孔茵醇 多种氧化三 萜类化合物 1 1 1 栓菌酸 多种羊毛甾醇型三萜类化合物 叶酸衍生物 芳香族的香草酸 丁香酸及丫羟基苯甲酸 还有报道称己分离出单宁化合物 类固醇 生物碱类化合物 黑色素类 1 2 1 低分子多酚类及木质素类化合物 1 3 1 4 近来国外学者又分离出了几种新的 三萜类化合物 1 5 也们 1 5 3 1 抗肿瘤作用 桦褐孔菌含有白桦脂酸 1 9 9 9 年韩国学者发现这种物质能抑制2 9 3 型癌细胞达 7 0 具有很强的抗肿瘤性 2 1 1 且无毒副作用 主要通过抑制蛋白质的生物合成和抗有 丝分裂来影响肿瘤细胞的分裂生长1 2 2 2 4 1 还通过d 葡聚糖去激活免疫系统 1 3 2 3 1 另外通 过诱导肿瘤细胞凋亡 2 5 2 6 而起到抗肿瘤作用 1 5 3 2 降血糖作用 在桦褐孔菌菌核中含有1 种糖蛋白和1 种水溶性多糖 均有明显的降血糖作用 尤 其是桦褐孔菌多糖提取液 其降血糖作用时间可持续4 8h 此外还发现栓菌酸对非胰岛 素依赖型糖尿病有效 1 5 3 3 对心血管系统的作用 据报道 三萜类化合物和类固醇有改善血液循环 调整血压 降低血胆固醇的作用 2 3 1 临床研究认为桦褐孔菌对预防与治疗高血压有一定的作用 1 5 3 4 抗病毒作用 4 第一章绪论 日本学者研究发现 桦褐孔菌水提取物可抑制人类免疫缺陷病毒 1 蛋白酶 已确定 的活性成分是一种水溶性的高分子量木质素衍生物1 1 4 加拿大和芬兰等国用桦褐孔菌醇 复合物提取的高性能标准提取物来治疗流行性感冒a b 另外日本学者报道 桦褐孔 菌对0 1 5 7 大肠杆菌中毒有很好的治疗作用 1 5 3 5 增强免疫和抗氧化作用 桦褐孔菌含有免疫增强物 27 j p o l y s a c c 撕d e s 多糖类 和抗氧化剂s o d 等多种物质 2 引 可增强免疫相关淋巴细胞的活性和免疫功能 并具有清除体内自由基和抗氧化的作 用 可延长传代细胞的分裂时间 延长细胞寿命1 2 州 1 5 3 6 诱导肿瘤细胞凋亡的作用 以往认为抗肿瘤药物是通过损伤d n a 或抗代谢的毒性作用引起肿瘤细胞的坏死 但随着对细胞凋亡机制的深入研究 发现大多数抗肿瘤药物具有诱导肿瘤细胞凋亡的作 用 诱导凋亡是其抗肿瘤的主要机制之一 一些研究通过显微镜观察m t t 比色法 倒 置显微镜观察法 光学显镜观察法 t u n e l 法及免疫细胞化学法等实验技术 研究了 桦褐孔菌提取物对胃癌m g c 8 0 3 细胞株的抗增殖 诱导凋亡的作用及对凋亡相关基因 蛋白在细胞凋亡前后表达的影响 一些研究结果表明 桦褐孔菌对胃癌m g c 8 0 3 细胞 株有抗增殖作用和诱导凋亡作用 而凋亡的分子生物学机制可能与下调凋亡抑制基因 b c l 2 蛋白的表达有一定的关系 6 而且依据抗癌药物能够诱导肿瘤细胞凋亡的理论 进 一步证明了桦褐孑l 菌的抗癌作用 为临床应用提供了新的实验依据 桦褐孔菌的进一步 研究应是全面系统的研究 多学科综合性研究及开发应用性研究 不仅要研究其抗癌作 用 而且还要从降血糖 抗动脉粥样硬化 抗病毒及抗组织纤维化等多方面进行研究 不仅要在病理学领域研究 而且还要在生物化学 药理学 免疫学及临床医学等多领域 进行综合性研究 不仅要在基础理论领域研究 而且还要在临床应用及开发产品等不同 领域进行研究 1 5 4 桦褐孔茵多糖的分离提取 传统的桦褐孔菌多糖的提取方法是水提醇沉 即原料在9 0 9 5 的水浴条件下溶解 桦褐多糖等水溶性成分 过滤 滤液浓缩至一定体积后 利用多糖溶于水而不溶于醇的 特点 将糖肽沉淀出来 对于桦褐孔菌多糖 酸提取可将多糖含量提高 但经过比较 用酸提取方法得到的多糖含量在4 5 5 0 得率在1 0 左右 这与水提醇沉方法无明显 差别 且操作繁琐 因此 目前一般采用水提醇沉提取桦褐孔菌多糖 沉淀所获的桦褐 孔菌糖肽常含有较多的游离蛋白及植物色素 为了使桦褐孔菌糖肽精品中具有较好的色 泽和较高的给药安全性 应经过脱色和去蛋白的步骤对桦褐孔菌糖肽进行精制 目前 桦褐孔菌多糖除蛋白多采用s e v e g e 法 通常以正丁醇一氯仿1 4 作为萃取液 加入到样 品水溶液中振摇 桦褐孔菌多糖的传统精制方法是使用凝胶色谱和离子交换色谱 利用分子筛效应 但此方法对于工业化的大量粗品的精制则不太适用 有报道采用超滤膜技术可以使云芝 糖肽含量提高 并达到8 0 以上 膜分离操作属于速率控制传质过程 具有设备简单 无相变 处理效率高 节能等优点 适用于工业化生产 5 江南大学硕士学位论文 桦褐孔菌多糖的纯化和分子量测定常用方法有超离心法 高压电泳法 渗透压法 粘度法和光散射法等 这些方法比较麻烦 误差也较大 目前常用的方法是高效凝胶渗 透色谱法 h p g f c 该方法具有快速 高分辨和重现性好的优 点 3 0 3 1 1 1 5 5 结构分析 桦褐孔菌多糖的结构分析主要包括以下几个方面 1 桦褐孔菌糖肽的单糖组成 2 桦褐孔菌糖肽中单糖和糖苷键的连接类型 3 桦褐孔菌糖肽中的结合蛋白的种类 和含量 4 桦褐孔菌糖肽中单糖与氨基酸的连接方式 目前应用于桦褐孔菌糖肽的单糖组成的方法主要有薄层色谱法 高效液相色谱法及 衍生化气相色谱法等 其中衍生化气相色谱法是在多糖分析中最常用的手段 目前常用的糖苷键分析方法主要有高碘酸氧化 s m i t h 降解 红外光谱法和核磁共 振光谱等 通过高碘酸氧化和s m i t h 降解产物 可以了解桦褐孔菌糖肽中的糖苷键的连 接方式 通过红外光谱图 核磁共振可以了解糖苷键的构型 0 型或1 3 型 还可以通过 酶解 以特定酶与桦褐孔菌多糖反应 确定糖苷键的连接 常用的测定蛋白质的方法有l o w r y 法 紫外吸收法 a 2 8 0 a 2 0 5 和考马斯亮蓝法等 通常糖肽中蛋白质与糖基之间只有n 和o 两种连接方式 主要通过天冬酰胺的侧 链酰胺与糖形成n 糖苷键 丝氨酸 苏氨酸和羟赖氨酸的侧链羟基与糖形成o 糖苷键 有a 和d 两种类型 糖肽中的n 或o 糖苷键相当于缩醛结构 因此具有缩醛的化学敏 感性 遇到酸会被切断或端基异构化 o 糖苷键对碱也敏感 中等强度的碱就可以通过 糖的p 消除反应而使糖肽分解 d 消除反应能测定o 糖苷键 1 6 本课题研究的意义 长期以来 恶性肿瘤一直是危害人类生命和健康的严重疾病之一 特别是近年来由 于环境污染 人们生活节奏加快 精神紧张与外界诱因的增加 世界各地的癌症发病率 急剧上升 我国也不例外地出现了明显上升的态势 现在我国癌症患者1 0 0 0 万名 每 年新增癌症患者1 6 0 万名 肝炎病人l 亿多 癌症严重威胁着人类的健康和生命 危害 着经济建设和社会建设 虽然多年来人们一直在杀灭癌细胞 增强人体免疫力等种种途 径中寻找战胜癌症的方法和药物 取得了一些进展 但在杀灭癌细胞的同时 也杀伤了 正常的细胞 如西医常用的手术及放疗 化疗等 桦褐孔菌糖肽作为一种抗肿瘤 提高机体免疫功能的多糖类物质 是一种极有前途 的抗肿瘤药物 传统的桦褐孔菌生产大多数采用固体发酵培养收集菌丝体多糖 这种方 法成本高 周期长 效率低下 产量低 而且最近我国药品监督管理局要求由固体培养 变更为液体培养桦褐孔菌菌丝体提取胞内糖肽 所以为了克服这些不足 适应大规模集 约化生产 本文采用液体发酵法培养桦褐孔菌菌丝体提取桦褐孔菌糖肽 虽然也有一些 文献报道 3 2 3 4 桦褐孔菌液体发酵生产桦褐孔茵糖肽 但由于桦褐孔菌是一个多组分复杂 体系 多糖的理化性质 生理活性与分子量有很大关系 3 5 j 故如何通过液体发酵获得大 量桦褐孔菌菌丝体 提取得到含有较高有效成分的产品 从而进行工业化生产 这无疑 是一个十分重要而关键的研究内容 目前也未见有关这方面的比较系统的文献报道 6 第一章绪论 1 7 本课题研究的主要内容 1 从实验室保藏的两株桦褐孔菌筛选出生长快 菌丝致密 高产多糖的出发菌株 2 不同营养条件和非营养条件对桦褐孔菌菌丝形态和多糖代谢进行初步研究 3 对桦褐孔菌胞内多糖及三萜化合物的提取条件工艺进行优化 4 对桦褐孔菌胞内 外多糖的结构和性质进行初步鉴定 7 第二章桦褐孔菌的菌体形态与多糖代谢产量关系的研究 第二章桦褐孔菌的菌体形态与多糖代谢产量关系的研究 2 1 引言 微生物的生长和代谢产物的积累既受到菌种本身的影响 也受到营养和环境条件的 影响 其生物合成途径 产物种类及其性质 产量与碳源 氮源 无机盐 p h 值 温 度 接种量和通气状况等多种因素有密切关系 如何快速地找出主要因素并进行优化并 非易事 有关桦褐孔菌液态发酵有一些文献报道 但如何发酵得到大量桦褐孔菌菌丝体 提 取获得有效成分含量较高的桦褐孔菌多糖产品具有重要的意义 而且国内外尚未见有报 道 本章从2 株桦褐孔菌菌株中筛选出生长快 菌丝致密 生物量和胞内 外多糖产量 较高的优良桦褐孔菌菌株 对其进行摇瓶培养实验 研究了其发酵生产菌丝体及胞内 外多糖的适宜培养基和培养条件 2 2 实验材料 2 2 1 菌种 桦褐孔菌 砌d 胛d 觚o b l i q u u s f r p i l a t 两株 w 菌株 d 菌株 为本实验室保藏 2 2 2 试剂 葡萄糖 分析纯 蔗糖分析纯 可溶性淀粉分析纯 甘油 分析纯 乳糖分析纯 浓硫酸 9 8 0 分析纯 木糖分析纯 麦芽糖生化试剂 硫酸镁 生化试剂 酵母粉 生化试剂 蛋白胨 生化试剂 d n s 试剂 3 苯酚自己配制 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 英国o x o i d 公司 国药集团化学试剂有限公司 豆饼粉 玉米粉 黄豆粉 玉米浆粉均为市售 2 2 3 实验仪器 数显六联电动升降搅拌器 苏州威尔实验用品有限公司 电热恒温培养箱 上海跃进医疗器材厂 u v 2 1 0 0 分光光度计 美国尤尼科公司 真空泵 巩义市英峪予华仪器厂 9 江南大学硕士学位论文 台式恒温摇床 电热恒温培养箱 电热式压力蒸汽消毒器 超净工作台 p h 计 t g l 1 6 c 台式离心机 2 2 4 培养基 江苏太仓市实验设备厂 上海跃进医疗器材厂 无锡第二医疗器械厂 苏州空气净化设备厂 北京h a n n a 公司 上海安亭科学仪器厂 固体培养基p d a g l 马铃薯2 0 0 0 葡萄糖2 5 0 蛋白胨5 0 酵母粉3 0 磷酸 二氢钾1 0 琼脂2 5 0 1 2 1 灭菌2 5r a i n 冷却 接种 一级种子培养基 g l 葡萄糖3 0 0 蛋白胨5 0 酵母粉3 0 磷酸二氢钾2 0 硫 酸镁o 5 1 2 1 灭菌2 5m i n 冷却 接种 2 5 c 1 0 0m l 2 5 0m l 1 5 0r m i n 培养7 1 0 天 二级种子培养基 g l 葡萄糖3 0 0 蛋白胨5 0 酵母粉3 0 磷酸二氢钾2 0 硫 酸镁o 5 1 2 1 灭菌2 5m i n 冷却 接种 2 54 c 1 0 0m l 2 5 0m l 1 5 0r r a i n 培养5 7 天 发酵培养基 g l 葡萄糖2 0 0 磷酸二氢钾5 o 麸皮7 o 玉米粉1 0 o 酵母粉 2 5 1 2 1 灭菌2 5m i n 冷却 接种 2 5 c 1 0 0m l 2 5 0m l 1 5 0r m i n 培养8 1 0 天 2 3 实验方法 2 3 1 桦褐孔茵菌种的复壮 将实验室保藏的两株桦褐孔菌用p d a 培养基转接两次 每次2 7 c 培养8 1 0 天 2 3 2 桦褐孔茵的培养特性 2 3 2 1 平板培养 将新培养的斜面母种转接到平板上 3 0 c 培养8 1 0 天 观察其菌落形态 对w 和d 菌株作比较 并通过拮抗试验对两株的亲缘关系进行鉴定 2 3 2 2 摇瓶培养 将新培养的斜面母种转入一级种子培养基 2 8 c 摇瓶培养8 1 0 天 再转入二级种子 培养基培养5 7 天 摇床转速1 8 0r r a i n 镜检无杂菌后 按1 0 接种量转入发酵培养基 摇瓶培养1 0 天 过滤 测定胞内 外多糖的含量 2 3 3 茵丝体形态观察 选择生长良好菌株w 和d 的平板培养菌丝体 在电镜下观察并扫描拍照f 3 6 1 2 3 4 茵球直径的确定 在培养皿中随机取2 0 个菌球排成一行测量总长度 精确n o 1c m 菌球以球形或拟 球形 直径 o 5c m 肉眼可辨 以菌球平均直径判断茵球的大小 平均直径 c m 菌球总长度 c m 菌球个数 个 1 n 第二章桦褐孔菌的菌体形态与多糖代谢产量关系的研究 2 3 5 茵丝体干重的测定 取发酵液1 0 0m l 离心 收集沉淀 用去离子水水洗 再离心 这样重复操作几次 收集沉淀 在1 0 5 2 烘干称重 2 3 6 还原糖的测定方法 采用d n s 法唧 d n s 试剂与还原耱发生氧化还原反应生成棕红色的氨基化合物 在 一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系 2 3 7 总糖的测定方法 苯酚硫酸法 2 3 8 多糖含量的计算 多糖含量 总糖含量还原糖古量 2 39 胞内多糖的提取 菌株经液体培养的发酵液先过滤 所得的湿茁丝体洗涤 过滤 烘干 接着把得到 的菌体破醉 破碎厉在热水中浸提2h 抽完后过滤 并把滤渣再热水浸提lh 再次过 滤 然后合并这两次滤液 减压浓缩至原体积的1 4 l i l 3 倍体积酗j 9 5 i 业酒精沉淀 静置数小时后过滤 沉淀物烘干得到结合蛋白多糖即胞内多糖 2 4 结果与讨论 2 4 i 出发菌株的筛选 2 4 1 1 菌落形态与菌丝形态的观察 通过对本实验交保存的两株桦褐孔菌w t l d 菌株进行平板培养 并对两菌株的菌落 形态及两者之问的亲缘关系做拮抗试验 结果如图2 1 蕊 平扳正面j i 片平扳背面照片 图2 1 甲板培养桦褐孔菌的茁落形态 f i g2 一it h ec o l o n y m o r p h o l o g y o f l n o n o t 驸 b 日 l n i ns o l i d m e d i u m 江南大学硕士学位论文 d 苗株凿 r n 镜照片 w 菌株苗丝电镜照片 图2 2 电镜观察桦褐孔菌菌地形忐的图片 f i g2 2t h eh y p h a e m o r p h o l o g y o f i n o n o t 班 b i3 q n m 碲s c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e 甲板培养观察到 w 和d 菌株的苗落均成丘状 菌落反面黑褐色 苗丝体白色并向 四周呈辐射状 当葡丝体生长到一定阶段时 在培养基上形成子实体原基 初级苗丝初 始纤细透明 次级茼丝 呈绒毛状 紧贴基质 气生菌丝稍后渐变为白色粗壮的 苗丝 i 端较齐短 当菌丝老化时 会产生色素 在苗丝上产生褐色的斑点 并且发现w 和d 苗株之间没有形成明显的拮抗线 说明亲缘关系较近 但是d 菌林较w 牛长速度快 且 苗丝体致密而厚重 w 菌株菌丝体薄而稀疏 电子显微镜观察w 和d 的菌丝形态如图2 2 发现w 和d 菌丝均无锁状联含 f h d 菌 株菌丝较粗 内部充实 肯横隔 w 菌株菌丝较细 苗丝透明无色 2 4 1 2 液体培养的比较 通过对w 和d 两株菌株摇瓶发酵培养比较 结果如表2 1 表2 1不同桦褐孔菌苗株的液体培养结果比较 t a b2 1c o m p a r i s o no f l i q u i dc u l t u r e f r o md i f f e r e n t i n o n o t 琳o b l