（无机化学专业论文）氢化酶模型化合物的合成与表征.pdf

摘要 摘要 本论文主要包含有两个方面的内容 我们设计与合成了一系列的含吡啶及硫配位原子的多齿配体 研究了这些 配体与硫酸亚铁的反应 合成了不含铁硫立方烷氢化酶辅酶的模型化合物 f e c 豇 c o 2 呐 h 2 l 3 2 n 二 2 巯基乙基 胺甲基 吡啶 用核磁共振谱 傅 立叶交换红外光谱 紫外 可见光谱 电化学和x 射线单晶衍射等技术对有关 化合物进行了全面的表征 研究结果表明 不含铁硫立方烷的氢化酶辅酶中的 铁很可能是低自旋零价铁 另外我们还研究了全铁氢化酶二核铁活性中心的模型化合物与一氧化碳的 取代及质子化反应 并探讨了其质子化反应机理 关键词 不含铁硫立方烷的氢化酶 h i n d 全铁氢化酶 模型化合物 羰 基化合物 桥联氢化物 a b s t r a c t a b s t r a c t t h i sd i s s e r t a t i o nc o m p r i s e sm a i n l yt w o a s p e c t s w ed e s i g na n ds y n t h e s i s eas e r i e so fm u l t i d e n t a t el i g a n d sc o n t a i n i n gp y r i d i n y l g r o u pa n ds u l p h u ra t o m s t h er e a c t i o n so ft h e s el i g a n d sw i t hf e r r o u ss u l p h a t ea r e p e r f o r m e d i na n a p p r o p r i a t eo r g a n i cs o l v e n tt os y n t h e s i s em o d e lc o m p l e x f e c i s c o m h 2 l 3 2 n b i s 2 e t h y l t h i 0 1 a m i n o m e t h y l p y r i a i n e f o rt h e c o f a c t o ro fi r o n s u l f u r c l u s t e r f t e eh y d r o g e n a s e t h a t i s h 2 f o r m i n gm e t h y l e n e t e t r a h y d r o m e t h a n o p t e r i nd e h y d r o g e n a s e 1 i m a n m r f f i r a n du v v i s s p e c t r o s p i c x r a yc r y s t a l l o g r a p h i ca n de l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u e sa r ee m p l o y e d w h e na p p r o p r i a t et oc h a r a c t e r i s et h ec o m p o u n d si n v o l v e di nt h i sr e s e a r c h o u r r e s u l t ss u g g e s tt h a tt h ei r o nc e n t r ei nt h ec o f a c t o ro ft h ei r o n s u l f u r c l u s t e r f r e e h y d r o g e n a s eb ev e r yl i k e l ya l o w s p i nf et 0 s e c o n d l y w ea l s oi n v e s t i g a t ec os u b s t i t u t i o na n dp r o t o n a t i o nr e a c t i o n so f m o d e lc o m p l e x e so ft h ed i i r o ns u b u n i to fi r o n o n l yh y d r o g e n a s e p o s s i b l e m e c h a n i s m sf o rb o t ht h ec os u b s t i t u t i o na n dp r o t o n a f i o nn 翔c l i o 璐a r ed i s c u s s e d k e yw o r d s h m d i r o n o n l yh y d r o g e n a s e s m o d e lc o m p l e x e s c a r b o n y lc o m p l e x e s b r i d g i n gh y d r i d ec o m p l e x e s m 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地 方外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含 为获得窟昌态堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料 与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌太堂有关保留 使用学位论文 的规定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘 允许论文被查阅和借阅 本人授权直昌太堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描 等复制手段保存 汇编本学位论文 同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到 中国学位论文全文数据库 并通过网络向 社会公众提供信息服务 保密的学位论皮在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 j 豸芬导师签名 勿1 1 p a 签字日期 协缈户 瑚形日签字日期 力1 年p 月叫日 1 一 第1 章前言 i i 铁的金属有机化合物 第1 章前言 铁被认为是宇宙中含量最多的十种元素之一 在地壳中铁是含量仅次于铝 的金属元素 居元素分布第四位 1 1 它在地球构造的各个层次中的含量从内到外 呈现递减的趋势 从地核的8 0 可能是一个熔融的铁地核 到地壳的5 1 铁也是地球中重量最大的元素 地球至少有3 5 的重量来源于铁 1 9 5 1 年 d u q u e s n e 大学的t j k e a l y 和elp a u s o n 报道了在溴化环戊二烯 镁和氯化铁反应时得到了一种非常稳定的浅橙色固体 2 并由j d d u n i t z le o r g c l 和丸r i c h 在1 9 5 6 年的到了它的晶体结构 3 这种浅橙色的固体就是二茂 铁 第一个金属茂合物 每个带负电的的环戊二烯给f e 2 提供6 个p 电子 形成 一个稳定的1 8 电子结构 因此二茂铁非常稳定 且具有芳香性 它可以发生磺 化 烷基化 酰基化等亲电取代反应 4 因此有大量与之相关的研究1 5 7 1 9 8 4 年p k 6 p f m a i e r 等人首次报道了二茂铁苦昧酸盐及二茂铁三氯乙酸盐 的抗癌作用嘲 在铁的金属有机化合物的应用方面开创了一片新的领域 此后 也有其它金属有机化合物的抗癌作用的报道 9 tt o 1 2 一氧化碳 一氧化碳为无色 无臭 无刺激性的气体 凡含碳的物质燃烧不完全时 都可能产生c o 气体 随空气进入人体的一氧化碳 在经肺泡进入血液循环后 能与血液中的血红蛋白 h b 等结合 一氧化碳与血红蛋白的亲和力比氧与血红蛋 白的亲和力大2 0 0 3 0 0 倍 因此 当一氧化碳侵入机体后 便会很快与血红蛋 白合成羰基血红蛋t k c o m 阻碍氧与血红蛋白结合成氧合血红蛋t j 0 1 b 0 2 造成缺氧形成一氧化碳中掣1 1 j 由于血红蛋白0 1 b 是许多生物体的输氧蛋白 当 吸入浓度为0 5 的一氧化碳2 0 3 0 分钟后 中毒者就因缺氧而会出现脉弱 呼吸变慢 最后衰竭致死 这是急性一氧化碳中毒 工业生产和家庭取暖中的 中毒事故就属这种情况 急性一氧化碳中毒是我国发病和死亡人数最多的急性 第1 章前言 职业中毒 也是世界上许多国家引起意外生活性中毒致死人数最多的一种中毒 事件 1 2 1 这与一氧化碳是无色 无臭 无刺激性的气体因而不易被人们及时觉 察有关 长时间接触低浓度的一氧化碳对人体心血管系统 神经系统乃至对后 代均有一定影响t 虽然一氧化碳是剧毒的无色 无臭 无刺激性的气体 但是它像是一把双 刃剑 一氧化碳也有它有益的一面 在人体中血色素分解可以产生c o 而它在 人的生理活动中可能起着重要作用 例如作为神经传递素 也有着舒张血管的 作用 1 4 1 在美国 一氧化碳在气调包装 m o d i f i e da t m o s p h e r ep a c k a g i n gs y s t e m s 中得 到使用 主要针对的是猪肉 牛肉等鲜肉产品 c o 与肌红蛋白 m y o g l o b i n 结合 形成一种鲜红色的色素 羰基肌红蛋 刍 c a r b o x y m y o g l o b i n 它比能继续被氧 化成褐色的肌红蛋白的氧化状态 o x y m y o g l o b i n 要稳定 这种红色的持续时间 长 可以延长肉类的货架寿命 一般c o 的使用量为0 4 到0 5 1 5 这项技术 与2 0 0 2 年被美国食品药物管理局 给与一般安全认证 可以应用于二级包 装 2 0 0 4 年 f d a 认可c o 为主要包装手段 声明c o 并不会掩盖食物变质的 气味 埘 尽管如此 c o 的应用还是由于其改变颜色和可能掩盖变质而受到质疑 在中国也规定在生食金枪鱼中不得使用c 0 1 7 1 1 2 1 一氧化碳的配位化学 墨1 观 一氧化碳可以作为一个中性配体与金属发生配位形成配合物 此时c o 被称 为羰基配体 c a r b o n y ll i g a n d c o 的分裂能 o 非常高 在光谱化学序列中它 甚至仅仅排在c n 2 后 在金属羰基化合物中 c 0 中的孤对电子与金属中的d 轨道形成s 配位键的同时 金属原子的d 轨道上的电荷能转移到c o 的p 反键 轨道形成反馈p 键 因此 c o 能够与低氧化态的金属离子配位 也能与金属原 子配位 甚至有负价金属离子的配合物 如在 卸f c c 0 啕 中 铁是负二价 在 这些配合物中c o 的这种与金属离子形成很强的反馈p 键的能力起到了稳定低氧 化态的金属离子的作用 c o 的分子轨道能级图如图1 1 a 所示 c o 的最高占据轨道 h o m o 图 1 1 b 上有一对具有s 对称性的孤对电子 根据分子轨道理论 这个轨道有一定 的反键性质 因此 c o 与金属离 原 予形成s 配位键后 c o 的键级反而升高 第1 章前言 其相应的红外振动频率升高 另一方面 c o 的l u m o 图1 1 c 轨道p 轨道具有 p 对称性 在与中心离子配位的时候 该p 轨道作为一个p 受体可以和金属上 的d 轨道重叠形成反馈p 键 结果是碳氧键的键级降低 相应的红外振动频率 降低 s 键与反馈p 键共同的作用结果使得电荷从金属向c o 分子转移 羰基配 体的红外光谱的吸收峰的波数要比自由的一氧化碳低 t u o n d 图l 1a 一氧化碳的分子轨道 1 s l b h o m o 轨道 岛l u m o 轨道 m o 一 囝p m 回囤 c 三0 一m c 兰 争g 一8 三 8 图1 2 金属羰基化合物中的s 和p 键 1 9 1 第1 章前言 1 3 酶 1 3 1 生物催化剂 目前人们发现三类生物催化剂 普通酶 e n z y m e 生物体产生的具有催化能力的蛋白质 这种催化能力称为 酶的活性 捌 核酶 r i b o z y m c 得名于r i b o n u c l e i ca c i de n z y m e 也称之为r n a 酶或催化 r n a 是具有高效 特异催化作用的核酸 是近年来发现的一类新的生物催化 剂 2 1 1 自然界中的核酶可以催化它们自身的分裂以及其他r n a 的分裂 也有的 可以催化核糖体的转氨酶活性 1 9 9 4 年 b r e a k e r 等首先发现单链d n a 分子同样具有酶活性 这些具有 催化功能的d n a 分子称为脱氧核酶 d c o x y r i b o z y m e d g z 又称酶性d n a d n a e n z y m e d n a z y m c 2 2 1 按照酶催化反应的性质 1 9 6 1 年国际酶学委员会 e n z y m ec o m m i s s i o n 提 出酶可分为六大判2 3 1 e c l 氧化还原酶 催化底物进行氧化还原反应的酶类 例如 乳酸脱氢酶 琥珀酸脱氢酶 细胞色素氧化酶 过氧化氢酶 过氧化物酶等 e c 2 转移酶 催化底物之间进行某些基团的转移或交换的酶类 例如 甲 基转移酶 氨基转移酶 己糖激酶 磷酸化酶等 e c 3 水解酶 催化底物发生水解反应的酶类 例如 淀粉酶 蛋白酶 脂 肪酶 磷酸酶等 e c 4 裂舍酶 催化从底物中移去一个基团并留下双键的反应或其逆反应的 酶类 例如 碳酸酐酶 醛缩酶 柠檬酸合酶等 e c 5 异构酶 催化各种同分异构体之间的相互转化的酶类 例如 磷酸丙 糖异构酶 消旋酶等 e o s 连接酶 催化两分子底物合成为一分子化合物 同时偶联有a t p 的 磷酸键断裂释放能量的酶类 例如 谷氨酰胺合成酶 氨基酸 t r n a 连接酶等 生命体的活动所需要的反应离不开酶的参与 很多重要的生物体内的反应 都是基于金属的 例如光合作用及呼吸作用这两个基本的生命过程 据估计 至少有三分之一的酶中有含有金属的辅酶或者需要金属来完成生理过程 这些 第1 章前言 必要金属包括 镁 钙 第一过渡周期元素 钪 钛 铬除外 铝 钨 镉和 汞 一般是利用氨基酸或其支链上提供的配位原子使金属与多肽间形成配位键 而结合刚 1 3 2 辅酶 一些酶不需要额外的组分 蛋白质本身就可以表现出酶的活性 另外一些 酶则需要结合非蛋白质分子后才会有活性 这种非蛋白质分子叫做辅酶 c o f a c t o r 它可以是无机物 如金属及铁 硫簇合物 也可以是有机物 如四羟 酮醇 没有辅酶的蛋白质部分叫主酶 a p o e n z y m e 主酶和辅酶结合在一起叫做 全酶 h o l o e n z y m e t 2 5 1 1 4 氢化酶 氢化酶是可以可逆催化氢气的氧化与质子的还原的金属酶 氢化酶在厌氧 性新陈代谢中起着关键的作用 2 6 2 7 1 氢化酶可以分为三类 全铁氢化酶 i r e f e h y d r o g c n a s e 镍铁氢化酶 f e n i h y d r o g e n a s e 不含铁硫立方烷的氢化 酶 i r o n s u l f u r c l u s t e r f x e eh y d r o g e n a s e 1 2 7 2 s 1 4 1 全铁氢化酶 关于对全铁氢化酶的研究可以追溯到1 9 3 3 年 k e m p n e r 和k u b o w i t z 冽发现 酪酸梭状芽胞杆菌 c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m 在c o 中产生氢气的能力被抑制 而 在光照下其活性又得到恢复 全铁氢化酶存在于一些厌氧菌中 如 梭状芽胞杆菌 c l o s t r i d i a 嗜热菌 t h e r m o t o g a 和脱硫弧菌 d e 捌i f o v 玷r m 及在厌氧条件中存活的低级真菌 由于其厌氧性质 在有氧条件下这些细菌难以存活1 2 8 l 例如脱硫弧菌 l e s u l f o v i b r i ov u l g a n s 它在有h 2 及硫酸盐存在的无镍厌氧条件下生长 有 镍的条件下细菌主要产生镍铁氢化酶 3 0 i 全铁氢化酶催化氢气的氧化与质子 的还原 其对质子的还原催化要优于对氢气氧化的催化 研究发现 梭状芽胞杆菌 c l o s t r i d i a 中的氢化酶是由一个分子量约6 0 k d a 的多肽构成 其中约有由2 0 个铁原子 非血红素铁 及对酸不稳定的硫原子组 第1 章前言 成的酶的氢簇 h c l u s t e r 和三个 4 f e 4 s z y 个 2 f e 2 s 簇 晶体结构研究表明 h c l u s t e r 是由一个双核的 f e f e e p 心以及以半胱氨酸硫桥连的 4 f c 4 s 1 立方烷组 成 3 这两个铁原子周围的配体有一氧化碳 氰基和巯基负离子 3 2 图1 3 研究表明 与 4 f e 4 s 1 立方烷相连的二核铁中心的端基铁原予上有一个活性配位 点 这个配位点可以被外来的c o 占据而抑制酶的活性 氢化酶处于催化循环时 端基铁发生氧化还原 与 4 f c 4 s 立方烷相连的铁原予始终保持低自旋的二价 3 3 图1 3 全铁氢化酶的带状结构图和其h c l u s t e r 的晶体结p t 韧 1 4 2 镍铁氢化酶 1 9 8 0 年以前 人们都认为只有全铁氢化酶这一种氢化酶 但是 在1 9 8 1 年 发现在一种产甲烷菌 m e t h a n o g e n l ca r c h a e a 中所包含的氢化酶含有镍 3 4 1 并且 这个镍是催化活性原子瞄 晶体结构研究表明 这种含镍的氢化酶中有三个 4 f e 4 s 立方烷 一个由两个半胱氨酸硫原子相连的 n i f e 双原子中心m 删 铁原子上由一个c o 以及两个氰基配体 而镍原子上则有两个额外的半胱氨酸硫 原子 图1 4 红外光谱确定了c o 与氰基配体的存在网 实验证明 在镍原 子上发生氢气的氧化与质子的还原 同时一氧化碳对镍铁氢化酶的可逆抑制也 是因为c o 在这个位置与镍发生了配位闭 所以铁原子不是催化活性原子 就 像在全铁氢化酶中的与铁硫立方烷相连的铁原子一样 在催化循环中它保持着 低自旋的二价l 明 但可以想象 无论在哪种氢化酶中 这第二个铁原子并非是 第1 章前言 可有可无的 而是作为其催化活性中心的有机组成部分在催化过程中起作调节 催化活性原子上的电子云密度的作用 n i f e 双原子中心与最近的 4 f e 4 s 空方 烷之间的距离约为1 0 a 他们之间存在电子的传递p 日 图l i a 煨铁氢化酶的结构 b 被抑制了的活性中心 c 可能有活性的活性中心结构 啷 两种氢化酶可以可逆催化氢气的氧化与质子的还原 反应1 其反应机理 可以通过一个所谓的 乒乓 酶催化机理 p i n g p o n gm e c h a n i s mo f e n z y m ec a t a l y t i c r e a c t i o n 即一种多底物酶反应的催化机理来描述 底物和产物交替地与酶结合 或释放 一来一去如打乒乓一样故称乒乓机理 机理特征是酶在其原始形式和 改变后的形式之间来回变化 按照这一机理 在第一个底物 与酶 e 结合后 释放第一个产物 而酶则改变成一种新的形式 f 当第二个底物 再与改变了 的酶 结合则导致第二个产物 q 的释放 然后酶再生为其原始形式 催化氢 气与水中质子的交换反应 可以同时观察到单交换反应 反应2 与双交换反应 反应3 它们也 j 以催化逆氢 o t t o 和顺氢 p a r a 的相互转化 反应4 4 1 1 h 2 尊2 h 4 2 e 1 1 h 2 d h d h h 2 2 d d 2 2 h 1 2 1 3 p a r a i 1 2 o r t h o h 2 1 4 至少有一个 4 f c 4 s 立方烷在全铁氢化酶与镍铁氢化酶的催化循环中参与 了电子的传递 第1 章前言 表1 1 镍铁氢化酶与全氢化酶的催化对比叨 1 4 3 不舍铁硫立方烷的氢化酶 1 9 9 0 年 产烷古菌 r a e t h a n o g e n i ca r c h a e a 中发现了第三种氢化酶 4 2 1 它 的系统命名为h 2 f o r m i n gm e t h y l e n et e t r a h y d r o m e t h a n o p t e r i nd e h y d r o g e n a s e t i r e d 德国的t h a u l r 教授的研究小组在这一领域进行了系统的研究 在较早的研究中 他和他的同事们认为这种氢化酶中不含有金属 其中发 现的铁元素被认为是研究过程中带进的杂质 所以把它叫做不含金属的氢化酶 m e t a l f r e eh y d r o g e n a s e 1 4 3 然而在接下来的研究中表明 h m d 不但含有铁 元素 而且该铁原子是催化活性中心 但的确没有其它两类氢化酶所具有的铁硫 立方烷 于是就重新将其命名为不含铁硫立方烷的氢化酶 i r o n s u l f u r c l u s t e r f r e eh y d r o g e n a s e 1 4 4 1 h m d 是由两个相同的分子量约为3 8 k d a 的单元 组成一个分子量约为7 6 k d a 的二聚体 4 每个二聚体中有两个铁原予但是没有 对酸不稳定的硫原子 这说明酶中不含有铁硫立方烷 这个酶在以下几个催化 性质方面不同于另外两种氢化酶 1 它不能催化单电子或双电子的还原反应 式 1 1 2 它本质上不能对h 2 和d 以及h 2 和2 d 之间的交换反应 式1 2 1 3 起催化作用 3 它并不能从本质上催化逆氢和顺氢之间的转换 式1 4 4 它并不会被某些能够抑制全铁和 或 镍 铁氢化酶的其他物质 如 乙炔 n o n 0 2 等 所抑制 与全铁和镍 铁氢化酶相同 不含铁硫立方烷的氢化酶也不会 被叠氮化合物所抑制 4 1 1 不含铁硫立方烷的氢化酶能够催化一个特定底物 m e t h e n y l t e t r a h y d r o m e t h a n o p t e r i n m e t h e n y l h 4 m 阿1 与氢气的加成反应 图1 5 a 这是厌氧菌利用氢 第1 章前言 气将二氧化碳还原为甲烷的中间步骤嗍 一 r 弋一 n s n 1 0 m e t h e n y tt e t r a h y d r o m e t h a n o p t e d n i e1 5 a 不含铁硫立方烷的氢化酶所催化的反应c o m e t h e n y l h 4 m p t 的结构 蜘 不含铁硫立方烷的氢化酶的主酶部分的分辨率为1 7 5 a 的晶体结构如图1 6 所示 它的每个单体又是由三个部分组成 上下两个相同的单元是拥有n 端并 有着相同的类示于r o s s m a n n 卷曲的结构 蓝色与红色 而中间部分这是上下 两个单元的c 段的交织 以浅色表示 4 7 l 从mj a n n a s c h i i 中分离的氢化酶 陆d 中存在着一个1 3 a 的u 型电子云 它可能就是辅酶所处的位置 如图1 7 中绿色部分所示 a m j a n n a s c h i i 中的氢 化酶 h i n d 的u 型结构是一个闭合结构 b 膨k a n d l e r i 中的氢化酶 h i n d 的u 型结构是一个张开结构 4 7 第1 章前言 图1 6 不舍铁硫立方烷的氢化酶 配 4 n n 4 j i f f 中得到 主酶的二聚体的带状结构图吲 图1 7 h d 中辅酶所处的位置 绿色 a m j a n n a s c h i i 中的i i m d b m k a n d l c r l 中的i i m d 不含铁硫立方烷的氢化酶的辅酶对光极为敏感 在蓝色及近紫外光照射下 分解成吡啶酮衍生物 铁及两分子的c o 图1 8 a 虽然一氧化碳可以抑制酶 的活性 但是光照条件下 c o 的存在可以使失活的速率降低 船l 图1 8 b 第1 章前言 a a c t i v e b 勃 e 弓 釜 芑 f e4 2c 04 图1 8a 不含铁硫立方烷的活性中心在光照下分解 b c o 存在于否对活性中心在光照下分解酌影响删 通过对5 7 f e 标记的酶进行m 6 s s b a u c r 谱的研究 4 9 l 表明 在氢化酶中只有一 种铁元素存在 而且这个铁元素可能低自旋的零价铁或是低自旋的二价铁 通过化学分析可以得知 不含铁硫立方烷的氢化酶中1 分子的铁及2 4 0 2 的c o 2 0 1 1 c m 1 与1 9 4 4 c m 一1 两个几乎相等的吸收峰 图1 9 表明两个c o 是 以9 0 度的夹角与同一个铁原子配位 柚 第1 章前言 2 1 0 02 0 5 02 0 0 01 9 5 0 1 9 0 0 1 8 5 0 w a v e n u m b e r c r n 1 图1 9 h m d 的红外光谱 柚l 煳于线吸收光谱分析表明 在铁原子的成键范围内有两个c o 分子 一个硫 原子以及一个n o 原子 腻朋a 6 曙鲫括中 2 0 0 7 年8 月份在美国科罗拉多 召开的第八届世界氢化酶学术会议上t h a u e l 教授及其同事们报告了不含铁硫立 方烷的氢化酶的辅酶的晶体结构闻 如图1 1 0 所示 铁原予为六配位准八面体 型构型 轴向上有一个与鸟嘌呤核苷酸吡啶n 原子及一个水分子 另外四个配 体为两个邻位的c o 一个半胱氨酸硫原子和一个未知配体 f c h 2 0 的距离比 较长 旬 0 a 所以它们之间应该只有氢键的接触 这个位置很可能是其活性 点 h o l o 屹 图l i o 不含铁硫立方烷的氢化酶的辅酶结构示意图嗍 2 0 0 7 年8 月份在美国科罗拉多召开的第八届世界氢化酶学术会议上 加利 福尼亚大学的y i s o n gg u o 5 1 报道了他与t h a u e r 等人合作使用n u c l e a rr e s o n a n t s c a t t e r i n g n r s 的方法研究h m d 的验证了两个一氧化碳分子出于顺位的结构 第1 章前言 同时也观察到了f e s 伸缩振动以及可能的f e o h 2 的振动 华盛顿大学的d m h e i n c k e y 也在其会议摘要中提到了h m d 的单铁活性中心的模拟 5 2 1 但是没有进 一步的具体描述 辅酶对不含铁硫立方烷的氢化酶非常重要 没有辅酶 不含铁硫立方烷的 氢化酶的就没有活性 重新加入辅酶又能恢复其活性 5 3 虽然目前已经解析出 了主酶及辅酶的晶体结构 但就辅酶的结构而言 仍然还有需要生物和化学工 作者进一步回答的问题 如辅酶中铁的是低自旋的f e 田还是f e o 晶体结构 中的未知配体是什么 本论文的研究主要包括两方面的内容 设计并合成了一系列的含有吡啶环 的配体 并研究它们与铁及羰基的配位反应 用各种表征手段表征所合成的羰 基铁配合物 通过对模型化合物的研究来达到进一步认识不舍铁硫立方烷的氢 化酶的目的 如获取有用的结构信息以帮助确定辅酶中铁的氧化状态及推测铁 的配位环境 不含铁硫立方烷氢化酶所催化的是一个氢气的加成反应 这在有 机化学中是一类重要的反应 因此 对这个辅酶的生物无机化学模拟研究也为 寻找有效的氢分子活化催化剂提供了一种可能 在第四章也涉及了与全铁氢化 酶模型化合物有关的一些研究 第2 章一般实验操作 第二章一般实验操作 实验中涉及无水无氧的操作均采用标准的s c h l c a k 技术在氩气气氛下进行 2 1 溶剂的预处理 实验中所使用到的有机溶剂均预先进行处理 并保存在s c h l c a k 管中 甲醇 乙醇 先使用无水硫酸钠预干燥一夜 过滤 加入镁粉及少量碘 氩 气下回流两个小时 蒸馏即得 乙腈 先使用无水硫酸钠干燥一夜 过滤 加入粉末状氢化钙至没有气泡 冒出 最后在氩气下用氢化钙回流数小时 蒸馏即得 甲苯 首先使用无水硫酸钠干燥一夜 过滤 加入钠珠并放置数日 最后 在氨气气氛下用钠回流数小时 蒸馏即得 四氢呋喃 无水硫酸钠干燥一夜后过滤 加入钠珠放置至无气泡冒出 然 后在氩气气氛下用钠和二苯酮 w 研 1 2 回流至紫色 蒸馏即得 乙醚 无水硫酸镁干燥一夜后过滤 蒸馏两次以除去高沸点杂质 加入钠 珠 放置数日 无气泡冒出后在氩气下用1 2 的钠和二苯酮回流至蓝色 蒸馏即 得 二氯甲烷 首先用少量氢氧化钠静置一夜 而后加入硫酸镁静置一夜 过 滤 在氩气气氛下用五氧化二磷回流数小时 蒸馏即得 2 2 实验仪器 实验中所涉及的主要仪器 设备见表2 2 2 2 i 红外光谱 实验过程中为保证羰基化合物红外光谱的准确 监测反应的进行以及进行 半定量的检测 红外光谱一般采用溶液法 分辨率为l c m 一 溶液法所使用的是氟化钙窗片可调溶液池 液膜厚度为0 1 m m 得到的谱 第2 章一般实验操作 图分别与相应的处理过的干燥溶剂的红外进行手动差减得到最后的结果 袭2 2 主要检测仪器 仪器 型号 红外光谱 质谱 核磁共振 元素分析 紫外可见光谱 电化学工作站 m 6 s s b a u c r 谱 t h e r m os c i e n t i f i cn i c o l e t3 8 0 w a t e r sz q 如 删 b r u 圈既 a 蛾c ed r x4 0 0 5 0 0 h e r a e u sc h n o r a p i d a g i l e n t8 4 5 3 f r a 2 a a t r r o r a b 母p e i i i e s t e c h n o l o g ym s 1 0 5s p e c t r o m e t e r 2 2 2 电化学实验 电化学实验在一氧化碳气氛避光条件下进行 以圆盘玻碳电极 巾 1 r a m 作为工作电极 玻碳片状电极为对电极 银 氯化银电极 内参比二氯甲烷溶液 0 4 5 m n b 蝴 b f 4 4 0 0 5 m n b u 4 a 为参比电极a 所有电位为相对于二茂铁的半 波电位 使用的溶剂均为新鲜蒸馏过的溶剂 电解质溶液为0 1 m n b 叫 b f d 甲醇 o 与李志美老师共同完成 第3 章不舍铁琉立方烷的氢化酶辅酶的无机化学模拟 第3 章不含铁硫立方烷的氢化酶辅酶的无机化学模拟 不含铁硫立方烷的氢化酶是一种含单核铁的氢化酶 通过一特定的底物可 以可逆催化氢气的裂解与质子的还原反应m 其辅酶的晶体结构揭示了它的活 性中心含有一个单核的羰基铁 f c 和西 c o 2 围绕这个单核的羰基铁还有一个 吡啶酮衍生物 半胱氨酸及一个未知配体 基本上是一个五配位的立方锥几何 构型例 r h a u c f 及其同事最近的研究结果虽然揭示了该辅酶的主要结构特征 但关于辅酶中的铁的氧化价态问题 另一个配体的性质问题仍然有待解决 详 见第1 章 因此 开展对该辅酶的模拟研究将有助于更全面地认识辅酶中铁的 电子结构 其催化作用机理 也有助于探索新型的氢气分子活化催化剂的设计 与合成 在这一章中 主要内容将包含如下几个方面 一系列含有吡啶环及硫配位 原子的多齿配体的设计 合成及其表征 这些配体与硫酸亚铁 f e s o 7 i 1 2 0 在 c o 气氛中合成铁羰基化合物的研究 运用红外光谱 f i 讯 紫外光谱 i r v v i s 电化学及穆斯堡尔光谱 m s s s b a u e r 等技术表征所合成的不含铁硫立方烷的氢 化酶辅酶的模型化合物 希望我们的研究结果对确定辅酶中的铁的氧化价态能 提供有益的帮助 3 1 配体的合成 3 1 1 6 甲基 2 1 3 晤嗪 2 4 3 二酮 6 m e t h y l 2 h 1 3 o x a z i n e 2 4 3 h d i o n e 的合成嗍 氨基甲酸乙酯 2 2 6 9 2 5 4 姗0 1 乙酰乙酸z 属 6 5 m l 乙酸 1 5 m l 及乙酸 酐的 7 0 m l 的混合物加热回流6 d 时后 趁热将溶剂蒸干一半 冷却 析出固体 1 7 9 5 即6 甲基一2 h 1 3 嚯嗪 2 4 3 h 酮 化合物1 熔点 2 2 5 2 2 7 2 文 献报道值 2 3 1 2 3 2 c 元素分析 c s h s n 0 3 计算值 测定值 c 4 7 2 5 4 7 5 2 h 3 9 7 3 0 7 n 1 1 0 2 1 1 4 9 1 hn i v l r c d c l 3 2 1 3 1 s c a 3 5 8 5 6 第3 章不舍铁硫立方烷的氢化酶辅酶的无机化学模拟 s c u 1 1 7 0 6 s n 回 oo 入从 a c e t i ca d d a c e t i ca n h y d r i c l c 图3 16 甲基 2 h 1 3 嚼嗪 2 4 3 h m 的合成 3 1 22 6 甲氧基 2 吡啶 乙酸乙醋0 9 t h y l2 6 m e t h o x y p y r i d i n 幻d a c e t a t e 的合成 1 n b u l i 2 c o o c 2 屿 2 图3 2 列6 甲氧基 砒啶 乙酸乙酯的合成 在 7 8 并不断搅拌的条件下 向2 甲氧基 6 甲基吡啶 1 2 6 m l l o m m 0 1 的四氢呋喃 1 5 m l 溶液中滴加正丁基锂的正己烷溶液 1 6 m 6 2 5 m l 1 0 m m 0 1 滴加完毕后溶液里黄色 将反应温度升至室温继续搅拌1 小时使溶液变为红色 在快速搅拌下将红色溶液缓慢滴加到 7 8 c 的碳酸二乙酯 1 2 1 m l l o m m 0 1 四 氢呋哺 1 5 m l 溶液中 溶液缓慢升至室温搅拌半小时后得到黄色溶液 加入 水 3 0 m l 以停止反应 并用乙酸乙酯 3 0 m h 3 萃取反应物 将萃取液合并 用无水硫酸钠干燥 大部分溶剂经减压除去 残留物用柱色谱 洗脱剂 乙酸 乙酯 正己烷 1 1 分离提纯 分离得到三种物质 核磁鉴定结果如下 化舍物2 1 hn m r c d c b 2 7 1 k 1 2 5 6 t c 日3 3 7 0h z 3 7 1 8 s c 2 3 8 9 0 s 0 c 搿9 4 1 7 5 m o c h 2 7h z 6 6 0 8 d p y j 8 4u z 6 8 2 1 他p y j 第3 章不古铁硫立方烷的氢化酶辅酶的无机化学模拟 7 6 7 5 0 1 t p y 7 8h z 化合物3 1 hn m r c d c l 3 3 9 0 4 s 一o c h 3 3 9 3 8 d c h 2 i 2 4 6 6 1 8 d p y j 8 4 6 7 5 0 d p y j 7 2 7 5 0 1 t p y j 7 8 化合物4 1 hh m r c d c i d 3 0 5 5 s c h 2 3 9 9 6 s o c h 3 6 5 7 6 4 p y 8 4 6 8 3 4 d p y j 7 2 7 4 6 5 t p y 正1 7 8 3 1 32 6 1 事氧基 2 吡啶 乙酸 2 6 m e t h o x y p y r i d i n 2 y d a c e f i ca c i d 的 合成 众昔一 图3 3 纠6 甲氧墓 2 吡啶 乙酸的合成 在 7 8 并不断搅拌的条件下 向2 甲氧基 每甲基毗啶 1 9 m l1 5 1 4 r e t 0 0 1 的四氢呋喃 1 5 m l 溶液中缓慢滴加丁基锂的正已烷溶液 1 6 m 9 8 m l 1 5 6 8 m m 0 1 在室温下继续搅拌2 4 时后 将反应液转入一个装有干冰的s c h l e n k 管中 在不断的搅拌下 自然升至室温 然后加入水 2 0 m l 终止反应 并用 乙酸乙酯萃取 2 0 m l x 3 弃有机相 水相用盐酸调节p i f 6 再用乙酸乙酯萃取 合并有机相并用无水硫酸钠干燥 减压除去溶剂得一浅黄色粘稠液体 1 6 9 6 2 1 hn m r c d a 3 3 7 9 2 s c h 2 3 9 2 4 s o c h 3 6 6 9 3 弘职j s h z 6 8 1 6 h p y l 8 h z 7 5 9 1 t 4 h p y j 8 h z 9 0 2 6 s c 0 0 国 3 1 42 6 羟基 2 吡啶 乙酸 2 6 h y d r o x y p y r i d i n 2 y d a c e t i ca c i d 饵l 1 的合成嘲 o 众3 o 一舢 圈3 a2 镪基 2 吡啶 乙酸的合成 第3 章不含铁硫立方烷的氢化酶辅酶的无机化学模拟 将2 6 甲氧基 2 吡啶 乙酸 1 1 3 5 4 9 6 8 r e t 0 0 1 溶解于氢溴酸中 4 0 1 5 m l 加热回流4 小时 冷却后用碳酸氢钠调节至有大量白色固体出现 p 阿6 过滤并用水 5m 0 及乙酸乙酯 5m 1 洗涤固体 最后真空干燥 o 6 1 9 5 8 此固 体在1 8 9 0 c 时发生脱羧反应 脱羧产物的熔程为1 5 9 1 6 2 这与6 甲基 2 吡啶 酮的熔程 1 5 8 1 5 9 0 c 5 6 j 相吻合 1 hn m r d m s o 3 3 9 4 s p y o n 3 5 2 7 s e 2 6 1 0 0 d 3 h p y j t h z 6 2 2 9 似5 h p y j 9 h z 7 3 7 6 t 4 h p y s 8 m 1 2 1 1 5 s c o o 1 3 cn m r d m s o 3 8 4 1 1 0 6 1 7 1 1 8 0 3 1 4 1 3 3 1 4 3 2 4 1 6 3 4 4 1 7 0 9 1 m s s m 1 z 1 5 4 1 0 元素分析 c t h t n 0 3 计算值 测定 值 c 5 4 9 0 5 4 0 7 e4 6 1 4 9 7 n 9 1 5 9 4 2 3 1 52 2 吡啶 乙酸 2 p y r i d i n 一2 y l a c e t i ca c i d 印两的合成 1 n b u l a 2 0 0 i 廿 图3 52 也i 口比啶 乙酸的合成 o h 在 7 8 并不断搅拌的条件下 向甲基吡啶 1 m l 1 0 2 r e t 0 0 1 的四氢呋喃 1 0 m l 溶液中缓慢滴加丁基锂的正己烷溶液 2 5 m 4 2 m l 1 0 5 r e t 0 0 1 自 然升温至室温并搅拌2 小时后将红色的溶液转入一个装有干冰的s c m e n k 管中 在搅拌下自然升至室温 用乙酸乙酯 1 0 m l x 6 萃取除去杂质后 水相用浓盐 酸调节至p h 6 减压除去溶剂得浅黄色固体 将此固体溶于少量的乙醇 以乙 醇作淋洗剂用柱色谱快速分离 所收集的组分经减压除去溶剂后加入少量水 过滤 减压除去溶剂后得到一浅黄色粘稠液体 0 4 5 9 3 2 3 1 62 n n 一二 2 巯基乙基 胺甲基 吡啶 2 吖 n b i s 2 e t h y l t h i 0 1 a m i n o m e t h y d p y r i d i n e a 电l 3 的合成岱7 1 第3 章不含铁碱立方烷的氢化酶辅醇的无机化学模拟 日 i 一 h 2 l 3 图3 62 科 n 二 宽基乙基 胺甲基 毗啶的合成 将2 胺甲基吡啶 o 3 m l 3 r e t 0 0 1 硫杂环丙烷 0 5 m l 8 4 r e t 0 0 1 和甲苯 3 m 1 的混合物在氮气下密闭于s c h l e n k 管中在1 0 0 下搅拌反应4 0 小时 反应液趁热减压浓缩至约0 5 m l 用柱色谱 淋洗剂 乙酸乙酯 快速分离得到 一无色油状液体 o 6 2 9 9 0 i r 液膜 s 均 2 5 4 1 c m 一 m sa e s m 1 z 2 2 9 m c 2 h 4 s h 2 h z 1 6 9 m 2 c 2 凰s 国 3 明 z 1 0 9 1 hn m r c d c l 3 1 6 9 5 2 h s 2 s 两 2 6 7 5 4 h q 2 a s h j 1 0 6 2 h z 2 7 7 9 4 h t 2 n c h 2 j 6 s z i z 3 7 9 6 纽 s p y c h 2 7 1 8 3 1 h t p y j 6 1 3h z 7 5 3 0 1 h d j 7 7 5h z p y 7 6 8 5 x h t 扛7 6 p y 8 5 2 9 1 h d 3 4 5 5h z p y 1 n m r c d c l 3 2 3 1 2 2 5 7 6 观 6 0 5 3 0 1 2 2 6 1 1 1 2 3 5 5 1 1 3 6 9 4 6 1 4 9 4 2 8 1 5 9 5 8 1 3 2f e s 0 4 7 i 1 2 0 与 k 述配体的反应侈羽 3 2 12 氮基苯硫酚与2 6 羟基 2 吡啶 乙酸f h l b 在一氧化碳气氛中并不断搅拌的条件下 向硫酸亚铁0 e s 0 4 7 h 2 0 1 3 8 m g 0 5 m m o d 的甲醇 3 m l 悬浊液中滴加2 6 羟基 2 一吡啶 乙酸 7 6 8 r a g 0 5 m m 0 1 的 甲醇 2 m 1 溶液 随着三乙胺 7 啦l 0 5 m m 0 1 的加入 反应液变为绿色 再此溶 液中继续滴入2 氨基苯硫酚 6 3 r a g 0 5 m m o d 和三乙胺 7 叩l 0 5 r e t 0 0 1 的甲醇 1 m l 溶液 在持续的搅拌和鼓入c o 的条件下反应5 分钟 溶液逐渐变成红色 滤掉不溶物后 反应液保存于 2 0 的冰柜内 数日后 溶液中有红色晶体析出 滤去母液 用少量甲醇洗涤 瓜 甲醇溶液 2 0 3 1 6 1 9 7 7 0 c m 单晶x 射线 分析结果如图3 1 所示 此物质为 f e c s c o h 皿 2 h l 2 氨基苯硫酚 红外 光谱也与文献l 5 8 j 相同 3 2 2l 半胱氮酸乙酯盐酸盐与2 6 羟基 2 吡啶 乙酸f i l l l 第3 章不舍铁辘立方烷的氢化酶辅酶的无机化学模拟 在一氧化碳气氛中并不断搅拌的条件下 向硫酸亚铁 f e s 0 4 7 h 2 0 1 3 9 m g 0 5 r e t 0 0 1 的甲醇 3 m l 悬浊液依次滴加2 6 羟基 2 吡啶 乙酸 7 6 9 m g 0 5 m m 0 1 的甲醇 1 m 1 溶液 三乙胺 7 0 l 0 5 r e t 0 0 1 l 半胱氨