（细胞生物学专业论文）myosin+x调节细胞迁移的初步研究.pdf

摘要 细胞迁移在生物体的发生发展过程中扮演十分重要的角色。肌球蛋白和肌动蛋白是 细胞骨架结构的基本组成单位，在细胞迁移过程中起重要作用。m y o s i l lx 是肌球蛋白 家族的成员，在脊椎动物中广泛存在。在小鼠脑的发育和创伤愈合过程中具有明显的含 量变化，表明m y o s i nx 在神经系统发育和再生过程中扮演重要角色。 m v o s i l lx 主要分布于细胞的边缘，并且与一些调节细胞运动相关因子具有相互作 用，我们检测了m y o s i nx 在迁移度不同的肿瘤细胞中的表达，对乳腺癌细胞不同亚系 的分析发现，在a c 血表达一致的情况下，在低侵袭性的m c f 7 细胞和高侵袭性的 m d a m b 2 3l 细胞中，m y o s i l lx 在蛋白水平上表达量随肿瘤侵袭程度的增加而提高， 这一结果表明在乳腺癌中m y o s i nx 的含量与肿瘤细胞的迁移度具有相关性。我们利用 r e a l t h ep c r 进一步在r n a 水平上检测了m y o s i nx 的表达，并未发现m y o s i i lx 表达 差异现象，提示m y o s i nx 的表达调控可能发生在转录后水平。值得注意的是，选用a c t i l l 为内参其与m y o s i nx 的密切关系可能影响目前的结果，我们还将进一步选用其它内参 进一步验证。 此外，神经系统也是研究细胞迁移的很好的模型。为了阐明m y o s i i lx 在细胞迁移 中的作用，我们建立了鸡胚神经管活体电转体系，使用的表达载体包括 p c a g g s 一u ! s - e g f p ，p c a g g s 一i 正s e g f p - m y o s i i lx 8 6 和s i r n am y o s i nx ( c m c k e n ) 。 在转染了s i i 矾am y o s i nx ( c k c k e n ) 之后，神经元的轴突不能按照原定路线投射。在转 染了p c a g g s 玎迎s e g f p m y o s i nx8 6 后，联合神经元轴突不能投射到对侧形成正常 的神经交叉，这一现象提示我们m y o s i i lx 在神经元迁移和轴突投射中起作用，但其具 体作用机制还需进一步研究。同时这一模型为研究鸡胚神经管发育奠定了技术基础。 关键词：m y o s i l lx ；细胞迁移；鸡胚活体电转 a b s t r a c t c e l lr n j 盯a t i o ni s 孤e s s e n t i a lc h a r a c t e r i s t i co fc r e m 玳d “e l o p m e n t m y o s i na l l da c t i na r e b a s i cu j l j t so fc y t o s k e l e t o nw 1 1 i c hp l a yak e yr o l ei 1 1c e l lm i 粤a t i o n m y o s i nxi sam e m b e ro f m y o s i nf 锄i l y i te x i s t si 1 1m o s to fm ev e r t e b r a t e 肌i m a l s d i f r e r e n te x p r e s s i o no fm y o s i nx 蛳n g r a tb r a i nd e v e l o p m e n ta n dn e l m m sr e g e n e m t i o ns u g g e s t st h a ti tp r o b d b l yp a r t i c i p a t ei i l t h ed e v e l o p m e n t 锄dr e g e n e r a t i o no fn e r v o u ss y s t e m m y o s i nx i se x i s t e di nt h ee d g eo fc u l t u r e dc e l l s t h ei n t e r a c t i o no fm a t r 泌w i t hc e n s u r ew i l li n n u e n c et l l ec e l li n i 伊a t i o ns p e e d nw a sp r e d i c t e dt h a tm y o s i nxm a yb e 证v o l v e di nc e um i g r a t i o n s o ，t h em y o s i nx e x p r e s s i o nw a sc h e c k e di nd i f r e r e n tt 啪o rc e u “n e s t h er e s u l t s 矗o mt h e 俩os t 缸i l so fb r e a s tn l j n i n a r yc a n c e rc e l l ss u g g e s t e dt h a tu n d e r t h ec o n d i t i o no fs a m ea c t i i ll e v e l l er 町r o s i nx w 硒e x p r e s s e dd i 仃e r e n t l ya c c o r d m gt 0t 1 1 ec e l l i 1 1 v 嬲i o na b i l i 够弛em c f 7c e l l i se s 缸d g e nr e c 印t o rp o s i t i v e 锄dl o w - i 1 1 v a s i v ec e l l ss h o w i n g l o w e rm y o s i i lx e x p r e s s i o nw m l e 廿l em d a - m b 2 31c e ui se s 仃o g e nr e c e p t o rn e g a t i v ea n d l l i 曲- i i a u s i v ec e l l ss h o w i i 培m 曲e rm y o s i i lxe x p r e s s i o n t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dm a tt h e c o m e n to fm y o s 协xi nt 咖r sw 嬲r e l a t i 融t 0t h ec e l lm i 铲a t i o ns p e e d t h e n ，廿l em r n a e x p r c s s i o no fm y o s i nx w 嬲a l s od e t e c t e di nt h ea b o v et v mc e l ll i i l e sw i t hr e a l - t i r i l ep c r h o w e v e r t 1 1 e r ew 邪n os 砌1 a rt e n dw m c hs u g g e s t e dm y o s i l lx e x p r e s s i o nw 嬲r e g u l a t e da t p o s t - 仃趾s c r i p t i o n1 e v e l i tw i l lb ea 伍肋e di nv i v o 删1 e r b e s i d e s ，n e r v o u ss y s t e mi sag o o dm o d e lf o rr e s e a r c l l i n go nc e l lm i g r a t i o n t bd e t e c tm e r 0 1 em y o s mxi 1 1n e u r o nm i 伊a t i o n ，t h ec h i c k e ne n l b r y o se l e t r o p o r a t i o ni nv i v os y s t e mw a s s e t u p t h ep 1 邪1 1 l i do fp c a g g s 一汪s e g f p m y o s i nx8 6w a s o v e r e x p r e s s e dm c o r m l l i s s i l r 面n e u n si nc 1 1 i c k e i n _ b r y o i l i cn e u i 面m b eb yi 1 1 o v oe l e c 臼叩o r a t i o n t h e c o m i i l i s s u i a 1a ) 【o n so v e r - e x p r e s s i i 培m y o s i i lx8 6f a i l e dt 0r e a c ht l l ec o n t r a l a t e r a lv e n t r a l - h o m r e 百o no rt oc r o s st h em i d l i r l e f m e m l o r e ，w h e nm y o s i i lxs i r n aw 舔饥叫；f e c t e di i l t ot l l e c l l i c ke n 出r y o l l i cn e u r a lt i l b e ，t l l en e u r o n s1 0 s ti t so r i 百r l a lo r i e n t a t i o n t h e s er e s u l t ss u g g e s t e d t h a tm y o s i i lx p l a yar 0 1 ei i lc e n 血g r a t i o n t h ec o n c r e t em e c h a i l i s mw i l lb ei i e s t i g a t e di n 矗】t l 】r e k e yw o r d ：m y o s 血x ；c e l l 血g o n ；e l e c 仃o p o m t i o n i i 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得 的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中作了 明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：高垡盛 日期： 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、 汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全文数据库( 中国科学技 术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：盔砬盏整 日期：丝星：墨：f o 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：鉴堑垫 日 期：旌亟二6 ：f j 电话：落趁：幺留现7 邮编：抛2 东北师范大学硕士学位论文 1 引言 1 1 细胞迁移的概念，存在的意义 细胞迁移是指细胞离开出生地并行走迁移到其它的特定部位，导致生物体内细胞位 置的重组。细胞迁移在生物体的发生过程中扮演十分重要的角色。目前把细胞迁移过程 机械的分成4 步：细胞前端伸出板状伪足；细胞前端伪足和胞外基质形成新的细 胞黏着；细胞体收缩；细胞尾端和周围基质黏着解离，细胞向前运动【l 捌。 细胞迁移是一种重要的生命活动。例如，淋巴细胞的定向迁移是其分化成熟和发挥 功能的关键，幼稚淋巴细胞在活化与分化的过程中，受趋化因子作用先从外周血定向迁 移至淋巴结，分化成熟为t 效应细胞后，再迁移到疾病或炎症灶发挥效应；神经细胞定 向迁移的缺陷，会导致脑结构和功能的异常；新生血管发生也需要血管内皮细胞向靶组 织的定向迁移。从另一方面看，细胞的异常迁移则与肿瘤的恶变，即侵润和转移有关。 细胞迁移参与组织形成、胚胎发育、炎症反应、伤口愈合、动脉粥样硬化等多种生理、 病理过程，且贯穿于肿瘤迁移的全过程。 1 2 细胞迁移的相关蛋白 细胞迁移的过程中，涉及细胞骨架蛋白的动态组装、细胞和细胞外基质之间黏着的 动态变化、周围基质的重组等，这些反应在迁移过程中的协调受复杂的信号调节。细胞 迁移板状伪足的形成需要形成伪足的元件进行组装，像a c t i l l 、m y o s i i l 、m e m 等与伪足形 成及伸长有关的蛋白1 3 j 。 伪足与胞外基质相互作用促使黏着斑的形成，在此过程中发挥作用的分子称细胞黏 附因子( c e l la d l l e s i o nm 0 1 e c u l e sc 伽s ) 。它们是介导细胞和细胞，细胞和胞外基质间 黏附和相互作用的转膜糖蛋白。它们不仅参与细胞黏附，还介导信号传导、细胞生长、 分化、特定部位的基因表达、异形性的产生、细胞运动、抑制炎症反应1 4 j 。目前根据 c a m s 的化学结构及其功能特征将其分为六大类，分别为钙依赖黏附家族、整合素家族、 选择素族、免疫球蛋白超家族、透明质酸受体类等，如：上皮钙依赖黏附素( e c a d h e 血 e c d ) 、整合素( 缸e 增叵n ) 、细胞间黏着分子i ( n e r c e l l u l a rc e l la d l l e r i o nm o l e c u l e i ) 、 c d 4 4 【5 1 。 黏着斑是整合素和e c m 中相应配体结合后引发其它整合素受体在细胞局部集簇并 招募磷酸化一系列细胞内蛋白后，在细胞膜局部形成的一致密结构。由整联蛋白参与的 黏着斑的装配介导细胞骨架重组的信号，这一信号传递通过两条途径实现：胞外配体与 整联蛋白结合通过末端确定的途径导致r h o 蛋白激活r h o g d p 转换为i m o - g t p ； r h o g t p 活化两个不同的信号通路。激活磷脂酰肌醇5 一激酶( p i ( 5 ) k ) ，使( p i ( 4 ) p ) 1 东北师范大学硕士学位论文 磷酸化生成p i ( 4 ，5 ) p 2 ，p i ( 4 ，5 ) p 2 结合许多靶蛋白包括微丝结合蛋白g e l s o l i i l 和 p r o f i l i l l 【6 培】，从而引起这些微丝结合蛋白分别从它们与两种形式的a c t m 形成的复合物中 解离出来，肌动蛋白单体的释放导致它们聚合到新暴露的微丝末端。另一通路是i 强。 一g t p 与r h o 蛋白激酶结合活化该蛋白的激酶活性，进而使肌球蛋白轻链磷酸酶活化， 从而有利于肌动蛋白纤维的装配【9 | 。 1 3m v o s i nx 的表达特点 m v o s i nx 是最近发现的一种非传统肌球蛋白，它广泛存在于脊椎动物组织但含量 较少【1 0 1 。高量的m y o s i nxi i l 】附a 表达在脊椎动物组织肾，睾丸，卵巢，胰脏，垂体， 甲状腺，肺，胃小肠，结肠，胎盘和脑的大部分区域被检测到。中量的m y o s i i lxi i 州a 表达在前列腺，唾液腺，。肾上腺，乳腺，脾和气管中被检测到。m y o s i nxm r n a 在肌 肉组织像心脏，动脉，骨骼肌，膀胱，子宫中表达量较少。s o u s a 发现脑中m y o s i nx 具有调节脑发育的功能，脑中存在两种形式的m y o s i nx ，即向1 1 1 e n g t l l 和h e a d l e s s 其 中前者为2 4 0k d ，后者较前者短6 0 7 0k d 左右【1 1 】。在鼠的脑中，m y o s i nx 表现了其发 育调控作用，两种形式都显示在p 5 到p 1 5 期高峰表达，在成年期表达下降。在鼠大脑 中也观察到了m y o s i nx 不同类型的表达，在这里f h l l 1 e n 甜h 的表达量比h e a d l e s s 表达 量更大。另外，血1 1 1 e n 础的表达量在鼠的大脑发育中继续增加，在成年大脑中表达量 最高。最近有报道说m v o s i nx 是在外周神经飞速发育期表达量增加最多的2 0 个基因之 一。发育中的鼠背根神经节的n o r c h e mb l o t 表明9 k b 的向1 1 1 e n g m 和7 k b 的h e a d l e s s 的 转录在胚后3 天都表达，并且表达水平在成年会降低【1 2 1 。然而，当被创伤后7 天d r g 神经元快速再生时两者的转录水平会明显上调，这些数据表明m y o s i nx 在神经系统的 发育和再生过程中扮演重要的角色。此后，s o u s a 等又证实了m y o s i nx 处于丝足的末 端。丝足是细小的细胞延伸结构，包括一个a c t i n 微丝组成的核，细胞延伸过程中感知外界 环境的触觉和感觉器官的作用【l3 1 。 1 4m v o s i nx 与p 1 3 的关系 全长的m y o s i nx 重链2 4 0k d 可以被分为头、颈、尾三个部分【l5 1 。像其它的肌球蛋 白一样它的头部区域是动力区可以结合a c t i n 微丝，水解a t p 并产生动力【l6 。m y o s i nx 的头部区与m y o s i l l ( 另外一个有m y t h f e r m 的肌球蛋白) 相似。m y o s i l lx 的颈 部结构域包括三个i q 基序。每一个都会形成一个c a 2 + 或c a 2 + 样轻链结合区，m y o s i nx 尾部的起始部分预测将会形成一个c o i l e d c o i l ，所以m y o s i nx 可能在细胞中以二聚体 的形式存在。在c o i l e dc o i l 之后是三个富含脯氨酸，谷氨酸，苏氨酸的区域叫做p e s t 区，它常常是c a 2 + 依赖型蛋白酶c a l p a i n 的结合位点。对非洲爪蟾的m y o s i l lx 研究发现 其m y 0 t h 结合于微管上，这使得它可以作为a c t i l l 微丝和微管之间的连接桥梁。m y o s i n x 的c 端是f e l w 区。f e r m 与t a l i i l 有2 8 的蛋白完全相同。f e r m 结构域的作用 常常是将细胞骨架蛋白和膜整合蛋白联系起来【1 5 。17 】。 2 东北师范大学硕士学位论文 m y o s i nx 一个独特的特点就是在它的尾部有三个p l e c k s t r i n ( p h ) 结构域【1 8 】。p h 结构域是磷酸酯肌醇的结合位点。因为p 伽岫( 3 ，4 ，5 ) p 3 是p 1 3 激酶的产物。m y o s i n x 有可能在这个酶的下游发挥作用【1 9 ，2 们。p 1 3 激酶是肿瘤和细胞迁移中重要的信号分子， 单分子影像研究表明g f p 和m y o s i nx 的p h 区的重组体结合于质膜的平均时间是2 0 s ， 这表明p h 区足以招募m y o s i nx 到质膜【2 1 1 。d i 锄e 指出具有p h 区的m y o s i nx 在胞吞 过程中为p 1 3 k 和伪足延伸提供了分子连接【2 2 1 。p h 订i p p e 认为这一作用可能与肌动蛋白 微丝网络向伪足的前向运动一致。p 1 3 激酶是黏着斑介导的机械黏着和细胞生长信号传 递的组分之一。 1 5m v o s i nx 与丝足的关系 b e r g 于2 0 0 2 年报道：丝足是细小的细胞突起它在细胞迁移和神经生长锥导向中起 着非常重要的作用【2 3 1 。肌动蛋白微丝作为丝足的核心经历连续的面向细胞体的收缩运 动，表面受体可以与这种反向运动一致也可以向丝足的末端运动，尽管这种前向运动的 分子机制还不清楚。m y o s i i lx 定位于丝足的末端经历丝足内的前向和后向运动，并且 m y o s mx 的过表达会增加丝足的数量和长度【2 4 锄】。m y o s i nx 作为运载分子到丝足末端 的候选运动源引发了“丝足末端复合体”存在的可能性，这种复合体包括细胞粘联分子， 受体和信号通路组分，在丝足形成过程中被组织起来。同样围绕m y o s i i lx 与丝足的关 系，h i r o s l l i 等人于2 0 0 4 年发现m v o s i l lx 将m e n 扩淞s p 运输到丝足的末端，致使a c t i n 的延长进而推动丝足的延伸【27 1 。尽管现在已知肌球蛋白家族成员在细胞的囊泡运动中发 挥作用，但是我们仍然不知道是m y o s i l l ) 【厂a s p 还是m y o s i nx m e n a 复合体与囊泡运动 相关。z h a i l g 证实m y o s i i lx 通过它的f e r m 结构域与整合蛋白的细胞膜结构域结合， 这为a c t i l l 细胞骨架和整合蛋白提供了动力连接基础，他们设想在丝足形成过程中m y o s i n x 或许在运输整合蛋白或和稳定细胞粘联结构中起指导作用【2 s j 。 1 6 神经轴突导向因子与肿瘤 s l i t s ，s e m a p h o 血s 和n e t 血塔是在脊椎动物和无脊椎动物神经系统发育过程中能够 吸引和排斥生长的轴突和运动神经元的三个蛋白家族【2 9 1 。最近的研究表明它们在神经系 统以外也广泛表达并且可能在肿瘤中发挥作用。另外，这些家族的蛋白和它们的受体控 制着肿瘤的血管形成，在正常和肿瘤发生组织中轴突导向因子也调节着细胞迁移和凋 亡，n e t r i n 1 的受体d c c 和u n c 5 b 都能诱使细胞凋亡。z h u 等发现m y o s i i lx 具有调 节d c c 分布和轴突路径搜寻过程【3 0 1 ，n e t 血1 是神经导向因子，它与其受体的相互作 用直接影响神经元轴突的伸长和缩短。m y o s i i lx 与神经导向因子受体之间的关系暗示 着它可能在神经元迁移中发挥作用，因此我们推测m y o s i l lx 作为一种细胞骨架结构组 分可能参与细胞迁移，通过运载m e n 扩姒s p 到肌动蛋白的顶端，而后者与盖帽蛋白竞 争结合a c t i n ，影响肌动蛋白纤维的长度进一步影响细胞丝足的长度，调节细胞的伸展 东北师范大学硕士学位论文 和收缩。在肿瘤细胞中m y o s i nx 与p 1 3 k 结合是黏着斑的机械黏附和细胞生长信号传 导，最终表现出生理变化的重要步骤。另外，因为细胞迁移也是神经系统形成的重要步 骤，所以以上的推测在神经系统也可能具有同样的意义。 1 7 立题依据 m v o s i nx 是肌球蛋白家族新成员，在脊椎动物中的各组织中广泛分布。它与细胞 粘附和细胞移动的重要分子结合，包括整合素【2 8 1 、钙样蛋白【1 7 1 、p m 3 【2 2 1 、m e n a ，、，a s p 【2 7 】 和微管【3 l 】等。我们发现以上的这些与m v o s i nx 相互作用的因子都是细胞迁移过程中的 重要组分，推测m y o s i nx 可能参与细胞迁移过程。细胞迁移速度是受细胞内迁移相关 因子调控的，这种调控包括两个方面：蛋白含量的增加或减少，蛋白活化状态的改变。 本研究分析不同侵袭能力的肿瘤细胞中m y o s i nx 表达量的变化。另外，神经元的迁移 在神经系统发育过程中是非常关键的，神经管中联合神经元的轴突投射是形成神经交叉 的关键步骤。我们检测m y o s i nx 在肿瘤细胞中的表达，同时也建立鸡胚神经管活体电 转体系研究m y o s i i lx 在神经元迁移中的作用。 4 东北9 币范大学硕士学位论文 2 材料和方法 2 1动物材料和细胞株 本实验中所选用的乳腺癌细胞系m d a m b 2 3 l ，m c f 7 和肝癌细胞h 7 4 0 2 购于上海 生命科学学院细胞库，神经细胞系n l t 由本实验室储存。m d a m b 2 3 1 ，h 7 4 0 2 和n l t 细胞于含有l o 新生牛血清( 购于g i b c o ) 和1 青霉素链霉素的d m e m 高糖培养 基( 购于g i b c o ) 中培养，m c f 7 于含有1 0 新生牛血清和1 青霉素链霉素的i m d m ( 购于g i b c o ) 中培养。新鲜种蛋北方2 号购于长春市北方种鸡场。 2 2 表达载体 本实验中所用融合表达载体：p c a g g s 也s e g f p c l 为空载体用于对照，载体 p c a g g s - 也s - e g f p m y o s i nx8 6 插入片段是人m y o s i nx 编码区( 5 3 0 6 6 6 6 2 9 ) ， s i r n am y o s i nx ( c 1 1 i c k e n ) 的序列为：5 t g c t g a a a t a a g t t c c a c a g a g t c t g g t t t t g g c c a c t g a c t g a c ca g a c t c t g g a a c t t a t t t - 3 。 2 3 化学试剂 免疫荧光检测：0 0 1mp b s ( p h 7 2 ) 自行配制，配方：1 9i n mn a h 2 p 0 4 ，8 1i n m n a 2 h p 0 4 ，n a c l0 1 3 6m ；甲醇，甘油购于鼎国公司；9 0 的甘油用蒸馏水配制；无色指 甲油购于市场。 蛋白提取和免疫印迹：胰酶购于s i g n l a 公司；0 0 1mp b s ( p h7 2 ) 如上配制； t w e e n 2 0 购于鼎国公司；裂解液自行配制：5 0 i n i n o l l sq h8 o ) ，1 5 0 皿n o l l n a c l ， 0 2 班叠氮钠，1g l s d s ，1 0 0m 班a p r o t i n ，1 0 班n p _ 4 0 ，5 l 去氧胆酸钠，1 0 0m l 苯甲基磺酰氟( p m s f ) ；2 上样缓冲液：1 3 0r 1 1 m 啊s c 1 ，p h 8 o ，2 0 ( v v ) g l y c e r 0 1 ，4 6 ( ，v ) s d s ，0 0 2 溴酚兰，2 d t t ；1 0 x 电泳缓冲液：o 2 5m 碱sb a s e ，1 9 2mg l y c i i l e ， l s d s ；转膜缓冲液：甘氨酸2 9g ，t r i s5 8g ，s d so 3 7 9 ，甲醇2 0 0 血，加d d h 2 0 定容 至1 0 0 0 血；膜染色液：考马斯亮兰o 2g ，甲醇8 0r n l ，乙酸2 血，d d h 2 01 1 8 血；包被液 ( 5 脱脂奶粉，现配) ：脱脂奶粉1 og 溶于2 0r n l 的o o lmp b s 中；显色液：d a b6 o m g ，o 0 1m p b s1 0 o 血，硫酸镍胺o 1m l ，h 2 0 21 0 山；封闭缓冲液：用p b s 配制3 牛 血清白蛋白，之后加o 0 5 t w e e n 一2 0 ，4 保存避免污；s u p e r s i g n a l w e s tp i c o c h e r n j l u f n j n e s c e n ts u b s 缸a t e ( c a t n o 3 4 0 7 7 ) ，预染s d s p a g e 低分子量标准蛋白购于 p i e r c e 公司。 l a 提取和r e a l t 硫ep c r ：o 0 1mp b s ( p h7 2 ) 如上配制；d e p c 购于鼎国公司； 5 东北师范大学硕士学位论文 7 5 乙醇自行配制；t r i z o l 购于g i b c o 公司；1 0 m e n ( p h7 o ) ：2 0 0r n mm o p s ，5 01 1 1 l 醋酸钠，l on 小ie d l a ；i a 凝胶配制：无菌水3 4 4n d ，琼脂糖0 6g ，甲醛1 6r n l ， l o m e n41 1 1 l ；i a 上样缓冲液：甲醇7 5 斗1 ，甲醛2 6 2 5 “l ，1 0 m e n7 5 山，无菌水 3 9 7 5 “l ，e b1 5 “1 ：反转录试剂盒购于p r o m e g a 公司；s y b r 研e e nr e a l t i m ep c r m a s t e r 购于联星公司。 鸡胚神经管活体电转：所有的d n a 用q i n q 队d n ae x t r a c t i o n 飚t 提取并纯化；2 固绿：固绿2g 于1 0 0i i l l0 0 9 的n a c l 溶液中；4 多聚甲醛配制：多聚甲醛4g ，于 6 5 水浴中溶解1 0 0i n l 水中；3 0 蔗糖溶液：3 0g 蔗糖于1 0 0 血o 0 lmp b s 溶液中； 多聚赖氨酸( p o l y - l 一1 y s i n e ) 购于r h o c h e 公司，o c t 冰冻切片包埋剂s a k 认- 4 5 8 3 ； 2 的b s a ：b s a2g 于1 0 0n l lo 0 1mp b s 溶液中。 2 4 抗体 鼠源a u c t i n 抗体( c o t n o a 5 4 4 1 ) 购于s i 舯a 公司；兔源多克隆m y o s i nx 抗体是根 据m y o s i i lx 一0 6 2 3 4 5 ) ( d d d a f k d s p n p s e h g h s d q r t s ) 作为抗原制作的；f i t c 偶 联羊抗兔抗体( 4 8 8m ) 购于m o l e c u l a rp r o b e 公司；c y 3 偶联羊抗鼠抗体( 5 4 9 衄) ( c o t n o c 2 1 8 1 ) 购于s i 舯a 公司；h r p 偶联羊抗兔，h i 冲偶联羊抗鼠二抗购于北京中 山金桥；兔源g f p 抗体，c y 3 偶联兔抗羊抗体( 5 4 9n m ) ( c o t n o c 2 8 2 1 ) 购于s i g m a 公司。 2 5 仪器 免疫荧光检测：正置荧光显微镜( e c l i p st e 2 0 0 0 u ，n i k o n ) ；倒置荧光显微镜( 8 0 i ， n i k o n ) ；解剖镊；1 2 孔培养板；1 0 01 砌培养盘；3 7 细胞培养箱( s n 4 3 8 0 1 3 1 4 0 ， t h e 咖of o m a ) ；圆形盖玻片( 巾1 8 衄厚度1i 啪) ；血细胞细胞计数板；5 0 向离心 管：刻度吸管( 5m 1 ，l on 1 1 ) ；巴斯德吸管；微量移液器( 1 “，2 0 0 “l ，1 0 p 1 ) ；常温低速 离心机；免疫组化湿盒。 蛋白提取和免疫印迹：低温高速离心机；微量移液器( 11 1 1 l ，2 0 0 “1 ，1 0p 1 ) ；蛋白电 泳仪( b i o r a d ) ；蛋白转膜仪( b i o r a d ) ；x 光片( 天津) ；x 射线摄影暗盒( x i ) 。 r n a 提取和r e a l t i m ep c r ：低温高速离心机；p c r 仪；r e a l t i i n ep c r ( 7 0 0 0 s e q u e n c e d e t e c t i o ns y s t e m ) 。 鸡胚神经管活体电转：解剖镊，解剖剪；实体解剖镜( s f c 1 1 ，m o t i c ) ；微量移液 器( 1r n l ，2 0 0 “1 ，l o “1 ) ；电转仪e c m 8 3 0 ( b t x ) ；玻璃管o d i d1 o 0 7 5 ，9 0n l i i l ，t w l 0 0 - 4 ； 拉针仪p n 3 0 ；电极( h a a r da p p a r a t u s4 5 0 1 1 5 ) ；正置荧光显微镜( e c l i p st e 2 0 0 0 一u ， n i k o n ) ；倒置荧光显微镜( 8 0 i ，n i k o n ) ；冰冻切片机( l e i c ac m l8 5 0 ) 。 6 东北师范大学硕士学位论文 2 6 肿瘤细胞总蛋白的提取和免疫印迹 2 6 1 砒p a 缓冲液配制 在7 5i n l 双蒸水中加入7 9 0m gt r i s ，9 0 0m gn a c l ，用h c l 调p h 值到7 4 ，加入 1 0i n l1 0 n p - 4 0 ，2 5 砌1 0 脱氧胆酸钠，混匀，然后加入1i n l1 0 0n 蝴e d t a ，最 后蒸馏水补充体积达到1 0 0 硼，4 保存。使用前加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂： 1 0 0 “l ：亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂，抑酶肽( 均为1m g 1 1 1 1 ) ；5 0 0 “1 ：p m s f ，n a 3 v 0 4 ， n a f ( 均为2 0 0n l m ) 。 2 6 2 蛋白提取 总蛋白抽提程序： ( 1 ) 取生长旺盛的9 5 融合度的培养细胞，倒掉培养液，用吸水纸吸干培养液。 ( 2 ) 每瓶细胞加3l n l ，4 预冷的o 0 1mp b s ( p h 7 2 7 3 ) 。平放轻轻摇动1i n i i l 洗涤 细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次。将p b s 弃净后把培养瓶置于冰上。 ( 3 ) 按裂解液：p m s f ( 1 0 0i n 】) 1 ：1 0 0 加入p m s f ，摇匀置于冰上( p m s f 要摇匀至 无结晶时才可与裂解液混合) 。 ( 4 ) 每瓶细胞加4 0 0 山含p m s f 的裂解液，于冰上裂解3 01 1 1 i n ，不间断摇晃培养瓶。 ( 5 ) 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用移液枪将细胞碎片和裂 解液移至1 5 血离心管中( 整个操作尽量在冰上进行) 。 ( 6 ) 4 ，1 2 0 0 0 甲m 离心5n 血l ( 提前开离心机预冷) 。 ( 7 ) 将离心后的上清分装转移到o 5 血的离心管中，一2 0 保存。 2 6 3 蛋白质免疫印迹分析 ( 1 ) 清洗玻璃板，务必保证玻璃板的清洁。配制8 分离胶，4 的浓缩胶，按照每个 泳道的上样量为4 0 5 0 昭蛋白以5 s d s 上样缓冲液混合样品，沸水中煮5m i i l 使蛋白变性。电压为浓缩胶6 0 8 0v ，分离胶为8 0 一1 0 0v ，电泳时间一般4 5h 。 ( 2 ) 电转移蛋白质至硝酸纤维素膜，每隔1h 换一次冰袋，并搅动转移缓冲液。一般用 1 0 0v 转膜3h 或5 0v 过夜转移。 ( 3 ) 1 丽春红染液染色5 面n ( 于脱色摇床上摇) ，以检测蛋白转移效果。冲洗掉未结合 的染液就可看到膜上的蛋白。可以根据m 破e r 转移的程度来确定转膜效率。 ( 4 ) 将膜用p b s t 或t b s t 从下向上浸湿后，洗涤51 1 1 i n 。然后移至含有封闭液的平皿 中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 3h 。 ( 5 ) 将一抗用p b s t 或t b s t 稀释至适当浓度；加入一抗，室温孵育1 2h 或4 过夜。 ( 6 ) 去掉一抗，用p b s t 或t b s t 在室温下脱色摇床上洗3 次，每次1 0 而n 。 ( 7 ) 同上方法准备h i 冲标记的次级抗体工作液，室温下孵育1 2h 后。 ( 8 ) 用p b s t 或t b s t 在室温下脱色摇床上洗3 次，每次1 0 i i l i n 。 ( 9 ) 取p i e r c e 公司的s u p e r s i g 砌w e s tp i c oc h e i i l i l u i i 血e s c e n ts u b s t r a t e 试剂盒。将两 个底物成份按1 ：l 混和制成底物工作液。 ( 1 0 ) 将膜与底物工作液接触，室温下孵育5 皿n 。 7 东北师范大学硕士学位论文 ( 1 1 ) 去掉试剂，用保鲜膜包膜。 ( 1 2 ) 在暗室中取胶片盖于膜上，暴光5 3 01 1 1 i n 。 ( 1 3 ) 曝光后，取出胶片，在显影液显影2 3i 血，定影液中定影。 ( 1 4 ) 将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量。 2 7 细胞总i a 的提取和实时定量荧光p c r 2 7 1 细胞总i 州a 的提取 ( 1 ) 6 孔板细胞( c n e 2 ) 融合度为9 0 1 0 0 时，去其上清，用p b s 洗两次后，每孔加 t r i z o l 试剂( g i b c o 公司) 1i n l ，摇匀，无菌罩内消化3 51 1 1 i n ( 观察：液体变粘 稠，细胞脱壁) 。 ( 2 ) 将各孔内消化好的细胞裂解液吸到d e p c 处理过的1 5m 1 e p 管中，加新氯仿o 2r n l ， 轻摇1 5s e c 。 ( 3 ) 室温静置2 3 血n 后，1 2 0 0 0 甲m ，1 5m i n ，4 ，离心。然后将上清转移到新e p 管 ( d e p c 处理过) ，加0 5 皿新的异丙醇，室温下静置l oi 血。 ( 4 ) 1 2 0 0 0 印m ，1 01 1 1 i n ，4 ，离心。观察总i a 在管底的白色沉淀，弃去上清，7 5 乙醇1 o1 1 1 l 洗涤( 用d e p c 水新配制) 后，7 5 0 0 平m ，5 血n ，4 离心。 ( 5 ) 去上清，用小t i p 吸干液体。空气风干沉淀5 1 0m i n ，加入d e p c 处理水2 0 3 0p l ， 用移液枪混匀，5 5 6 0 水浴1 0 血n 溶解总r n a ，测o d 值。 ( 6 ) 电泳观察所提i a 的质量 2 7 2c d n a 合成 ( 1 ) 取1 鹇的总r n a 加入到d e p c 处理过的p c r 小管，置于7 0 的水浴中孵育1 01 1 1 i n ， 短暂离心后置于冰上。 ( 2 ) 按顺序加入以下试剂制备2 0p l 的反应体系 2 5m m m g c l 2 1 0 反转录缓冲液 d n t p 混合物，1 0m m 核苷酸酶抑制剂 a m v 反转录酶 0 l i g o d t r n a p 1 “1 山 “l 1 5u 0 5 嵋 1 嵋 无核酸酶的水到终体积2 0 山 ( 3 ) 4 2 孵育1 51 1 1 i n 。9 5 孵育5 幽，4 5 血n 。反转录的c d n a 可以直接用于p c r 或于2 0 保存。 2 7 3r e a l t i m ep c r ( 1 ) 将所制的c d n a 用无菌水稀释5 倍。 ( 2 ) 反应液配制 东北师范大学硕士学位论文 蒸馏水 9 1 s y b rg r e e nr e a l t i m ep c rm a s t e r 1 2 5 肛l 引物1 0 5 斗l 引物2 0 5 山 样品溶液 2 5 山 ( 3 ) 反应条件9 5 6 0s e c _ 9 5 1 5s e c 一6 0 6 0s e c 】4 0 个循环。 2 8 培养细胞的免疫荧光染色 2 8 1 载玻片处理 先对盖玻片( 1 8i i u l l 厚度1n 1 1 1 1 ) 进行处理，用1 ：1 混合的冰醋酸和乙醇溶液 浸泡玻片1h ，蒸馏水洗约5m i n ，7 5 的乙醇灭菌1h ，然后在超净台中取出盖玻片， 无菌风吹干后，用镊子取出放入到1 2 孔培养板中。 2 8 2 细胞免疫组化 ( 1 ) 8 5 9 5 融合度的细胞用3 0m l 的培养基稀释后滴加1 2 滴于c o l l e g e n 包被过的盖 玻片上培养3h 。 ( 2 ) 取出培养板吸去剩余的培养基后，用0 0 1mp b s ( p h7 2 ) 冲洗三遍。 ( 3 ) 细胞固定：将1 2 孔细胞培养板放置于冰上，每孔中加入1m l ，一2 0 冰冷的甲醇， 一2 0 下固定2 0m i n 。甲醇既作为细胞固定剂又可以作为细胞膜穿孔剂。 ( 4 ) 去除甲醇，用0 0 1mp b s 洗5m i n 。 ( 5 ) 用解剖镊将盖玻片从1 2 孔培养板中取出，细胞面朝上放于湿盒中，剩余的玻片可 在4 中保存一周。 ( 6 ) 细胞封闭：配制封闭液2 b s a ，取2 0 0 “l 封闭液滴加到盖玻片上，室温下封闭3 0 m i n 。 ( 7 ) 去除封闭液，加一抗：兔源m y o s i nx 抗体，用封闭液稀释配制一抗工作液为1 ：2 0 0 0 稀释m y o s i nx 抗体。取1 0 0 “l 一抗工作液滴加到盖玻片上，4 过夜。 ( 8 ) 去除一抗工作液。o 0 1mp b s 洗三遍，每次1 5m i i l 。 ( 9 ) 二抗反应：用封闭液稀释配制二抗工作液：1 ：5 0 0 稀释f i t c 偶联羊抗兔抗体，取 1 0 0 l 二抗工作液滴加到盖玻片上，室温下反应1 2h 。 ( 1 0 ) 去除二抗工作液，0 0 lmp b s 洗三遍，每次1 5m 证。 ( 1 1 ) 用无菌水洗两次，每次5m i n 。 ( 1