（发酵工程专业论文）纳他霉素发酵工艺的研究.pdf

天律科技大学硕士学位论文 摘要 本论文首先确定了纳他霉素的检测方法一h p l c 法；然后对纳他霉素 产生菌发酵性能做了初步研究。对其发酵工艺进行了优化，并根据其合 成机制，对其代谢调控进行了初步研究。最后在5 l 自动罐上研究了纳他 霉素的间歇补料分批发酵。 确定了h p l c 法检测发酵液中纳他霉素的各项参数：在p h e n o m e n e x p r o d i g y5uo d s 31 0 0 a ( 2 5 0 m m 4 6 0 m mi d ，5um ) 色谱柱上，以甲 醇水磷酸( 体积比8 5 ：15 ：01 5 ) 为流动相，流速为l m l r a i n ，紫外 检测波长为3 0 3 n m 。 在研究菌株发酵性能的基础上，优化了发酵培养基配方：葡萄糖 3 6 9 l ，大豆蛋白胨2 0 9 l ，酵母粉4 5 9 l ，p h 7 9 。 根据纳他霉素的合成途径，研究了前体物及代谢调节物对发酵的影 响。结果表明，亚铁氰化钾和生物素都对纳他霉素的合成无促进作用； 在初始培养基中加入o 5 的磷酸镁并在快速生长末期加入0 1 的丙酸钠 能提高纳他霉素的产量，使之达到2 7 9 9 l 。 以模糊理 仑为基础，以生长生产耦合度定量表征了菌株生长和生产 的同步程度。发现在发酵过程中生长和生产不同步，耦合度仅为4 0 9 。 在5 l 机械搅拌发酵罐中进行了控制p h 间歇流加培养实验。确定的 i 艺参数为：p h 控制为4 5 h 前保持65 ，4 5 h 后保持55 ；从第4 5 h 开始 流加5 0 葡萄糖，以发酵液中葡萄糖水平为控制指标，维持葡萄糖浓度 2 0 9 l ；培养时间为9 3 h 。最终纳他霉素产量达到2 9 7 9 l 。 关键词：纳他霉素，褐黄孢链霉菌，菌种选育，发酵条件，检澳0 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o d so fn a t a m y c i n h p l cw a ss t u d i e db a s e do n t h es t u d yo fs t r a i n sf e r m e n t a t i o na b i l i t y ，t h em e d i u mw a so p t i m i z e da n d t h em e t a b o l i cc o n t r o lo fn 0 5w a ss t u d i e d f i n a l l y ，f e d b a t c hf e r m e n t a t i o n w a ss t u d i e dt oi m p r o v et h ey i e l do fn a t a m y c i ni n5 la u t o f e r m e n t o r t h ep a r a m e t e r so fh p l cw e r ed e t e r m i n e dt h eo p e r a t i n gc o n d i t i o n s w e r ep h e n o m e n e xp r o d i g y5uo d s 31 0 0 a ( 2 5 0 m m x 4 6 0 m mi d ，5um ) ， a tr o o mt e m p e r a t u r e ，m e t h a i m | - w a t e r p h o s p h o r i ca c i d ( 8 5 ：1 5 ：0l5 ，v v ) a s m o b i l ep h a s ew i t haf l o wr a t eo f1 0 m l m i na n du vd e t e c t i o na t3 0 3 n m b a s e do nt h es t u d yo fi t sf e r m e n t a t i o na b i l i t y ，t h eo p t i m u mm e d i u m f o r n a t a m y c i np r o d u c t i o n w a sd e m o n s t r a t e d ( g l ) g l u c o s e36 ，s o y b e a n p e p t o n e2 0 y e a s te x t r a c tp o w d e r 45a n dp h79 b a s e do nn a t a m y c i n ss y n t h e s i sw a y ，t h ei n f l u e n c eo fp r e c u r s o ra n d r e g u l a t o r o n n a t a m y c i np r o d u c t i o n w a s e x p l o r e d t h er e s u l ts h o w e d ： k 4 f e ( c n ) 6 3 h 2 0 a n db i o t i nh a v e n o p o s i t i v e e f f e c to n n a t a m y c i n p r o d u c t i o na d d i n g05 m a g n e s i u mp h o s p h a t e a tt h eb e g i n n i n ga n d0 1 s o d i u m p r o p i o n a t eb e f o r et h ee n do fl o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s ec a ni m p r o v e n a t a m y c i np r o d u c t i o no f f l a s kt o2 7 9 9 l b a s e do nt h ef u z z yt h e o r y ，r a t i o no fc o u p l i n gg r o w t ha n de x p r e s s i o n w a si n t r o d u c e dt os h o wt h ee x t e n t o fb i o m a s s g r o w t h a n d n a t a m y c i n p r o d u c t i o ni n f e r m e n t a t i o n i tw a ss h o w nt h a tt h eg r o w t ha n dp r o d u c t i o n w e r en o ts y n c h r o n o u si nt h eo r i g i n a lp r o c e s sa n dt h er a t i o no fc o u p l i n g w a so n l y40 9 t h ef e d b a t c hf e r m e n t a t i o nw i t hp hc o n t r o lw a sd e t e r m i n e db a s e do n t h es t u d i e so fb a t c hf e r m e n t a t i o nr e s u l ti nf l a s kp hw a sc o n t r o l l e da t 6 5 b e f o r e4 5ha n d5 5a f t e rt h a t 5 0 g l u c o s eb e g a nt ob ea d d e db yp u l s e d f e e d i n ga t4 5 h ，a n dt h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nw a s m a i n t a i n e da b o u t2 0 9 l d u r i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s s t h ef e r m e n t a t i o nt i m ew a s9 3 h t h ey i e l do f n a t a m y c i nu n d e rt h e s ec o n d i t i o n sw a s2 9 7 9 l k e yw o r d s ：n a t a m y c i n ，s g i l v 0 3 p o r e u s ，m u t a t i o nb r e e d i n g ，f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n ，d e t e r m i n a t i o n n 天津科技太学硕士学位论文 1 前言 1 1 纳他霉素的发现 1 9 5 5 年，s t r u y k 等人从南非纳他州的土壤中分离到纳塔尔链霉菌 s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ，并从中分离出了一种新的抗真菌物质，称为p i m a r i d n ( 匹马菌素) 【l l ；1 9 5 9 年，b u r n s 等人在美国田纳西州的土壤中分离到了一株 焓塔努加链霉菌s t r e p t o m y c e sc 协a l t a n o o g e n s i s ，并从其培养物中分离到了 t e n n e c e 打n ( 田纳西菌素) 。此后的研究证明匹马菌素和田纳西菌素为同一物质， 并被世界卫生组织w h o 统一命名为n a t a m y c i n ( 纳他霉素) 1 2 1 。 1 2 纳他霉素的性质 i 2 ，i 理化性质 纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，是一种白色或乳白色， 几乎无臭无味的结晶粉末。分子式为c 。h 。n o 分子量为6 6 5 7 5 ，化学结构 如图1 一l 所示。 也m 图l l纳他霉素的分子结构 纳他霉素是一种四烯大环内酯，圆烯结构是全顺式，内酯环上c 。一c ，部 位是半缩醛结构，含有一个由糖苷键连接的碳水化合物基团，即氨基二脱氧甘 露糖( m y c o s a r n i n e ) 。纳他霉素是两性物质，分子中含有一个碱性基团和一个 酸性基团，其电离常数p k a 值分别为8 3 5 和4 6 ，等电点6 5 ，熔点2 8 0 。c 。 其结构上存在两种典型构型：烯醇式结构和酮式结构，这就决定了它在许多溶 剂中的低溶解性。纳他霉素在水中或低级醇中的溶解性是随着p h 的降低或升 高而增加的，在中性p h 下溶解度最低，而在p h 低于3 或高于9 时溶解度增 大。纳他霉素在各种典型溶剂中的溶解度如表l 一1 所示。 1 前言 表l 一1 纳他霉素的溶解度 溶剂溶解度 水 乙醇 乙醇8 0 + 水2 0 甲醇 丙二醇 甘油 二甲基亚砜 冰醋酸 o0 0 5 o0 1 o0 1 00 7 3 3 14 n 20 1 5 5o 1 85 纳他霉素的紫外光谱如图1 2 所显示，在2 9 0 、3 0 3 、3 1 8 r i m 处有尖锐的 最大吸收峰，在2 8 0 n m 处有肩，2 2 0 n m 处有宽峰。由于纳他霉素含有四烯环， 因此在2 8 0 - - 3 2 0 n m 之间出现吸收峰，而在2 2 0 n m 的最大吸收是由于纳他霉 素含有发色团。 图l 一2 纳他霉素的紫外光谱 纳他霉素的四烯发色团使其具有高不饱和特性，可与溴和含活性氧的化 合物如高锰酸钾、高硫酸盐及过氧化物相互作用：另一方面，它以环氧族的形 式保持弱氧化性，当纳他霉素在冰醋酸中用热的碘化物处理后会析出碘。纳他 霉素通过酸水解作用可以释放出海藻糖氨，内酯可以通过碱水解作用皂化1 1 , 2 1 。 天律科技大学硕士学位论文 1 2 2 活性和稳定性 纳他霉素干粉在避光避潮下是稳定的化合物，室温下保存几年只有很小 一部分失去活性。但其无水形态不稳定，在室温封闭的瓶子中保存4 8 小时失 去1 5 的活性。中性的纳他霉素水溶液几乎和干粉一样稳定。纳他霉素的稳 定性受p h 值、温度、光照、氧化剂和重金属等条件的影响而变化盼“。 1 p h 值：纳他霉素在p h 45 9 问非常稳定，在极端p h 值下迅速失活， 形成各种各样的分解产物。在低p h 值时其主要的裂解产物是海藻糖胺；在高 p h 值，如p h = 1 2 时，由于内酯皂化可形成纳他霉酸，用强碱处理导致进一步 的作用，产生一系列的后醛醇反应。p h 值对于纳他霉素的稳定性有一定的影 响，但对纳他霉素的抗真菌活性没有明显的影响。并且在大部分食品的p h 范 围内，纳他霉素十分稳定。 2 温度：温度对纳他霉素的活性几乎没有影响( 在中性水溶液中) 。纳他 霉素在室温条件下是稳定的，5 0 放置几天或1 0 0 短时处理，其活性几乎无 损失。1 2 06 c 条件下加热不超过1 h 仍能保持纳他霉素的部分活性。 3 光照：纳他霉素在紫外光下分解，失去四烯结构。v 辐射也能使纳他 霉素分解。 4 氧化剂：纳他霉素不宣与氧化剂如过氧化氢、漂白粉等接触，否则其 抑菌活性会明显下降。防止氧化的方法是使用抗氧化剂，如叶绿素、抗坏血酸、 丁基羟基茴香醚、丁基甲苯等。 5 重金属：一些金属离子可以促进纳他霉素的氧化失活，尤其是铁、镍、 铅、汞等重金属。因此，纳他霉素适宜存放在玻璃、塑料或不锈钢容器中，也 可以添加e d t a 或聚磷酸盐来防止失活。 6 鉴别用颜色反应：把纳他霉素晶体加入滴有一滴浓盐酸的点滴板上， 颜色马上变蓝；如果滴一滴浓磷酸，颜色马上变绿。几分钟后，都会变成浅红色。 1 2 3 抗微生物性质 纳他霉素是一种广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和某些藻类的多 烯大环内酯类抗生素，但是它没有抗细菌活性。这是由于真菌的细胞膜含有麦 角固醇，而细菌细胞膜中不含这种物质，多烯大环内酯类抗生素能有选择地和 固醇结合，结合的程度与膜的固醇含量成正比，结合后形成膜一多烯化合物， 引起细胞膜结构的改变，导致膜渗透性的改变，造成细胞内物质的泄漏【4 】。纳 他霉素对于抑制正在繁殖的活细胞效果很好，而抑制休眠细胞则需要较高的浓 度。纳他霉素对真菌孢子也有一定的抑制效果。1 9 5 6 年，t r e s n e r 曾测试过纳 他霉素对5 0 0 种霉菌的抗性，所有菌种都被0 0 0 1 一o 0 1 9 l 的纳他霉素抑制。 1 9 5 9 年，k l i s 比较了纳他霉素、山梨酸、放线菌酮、制霉菌素、龟裂霉素等 的抑菌效果，发现纳他霉素对1 6 种在肉汤和琼脂中培养的霉菌是最有效的抑 sr j 齐0 ，绝大多数霉菌在0 0 0 0 5 0 0 0 6 9 l 的纳他霉素浓度下被抑制，极个别 前言 的在0 ( ) 1 o 0 2 5 9 l 的纳他霉素浓度下被抑制，多数酵母在0 0 0 1 一o o o s g l 的纳他霉素浓度下被抑制口i 。 1 2 4 安全性及毒性 纳他霉素无毒，并且不致突变、不致癌、不致畸、不致敏。由于纳他霉 素难溶于水和油脂，大部分摄入的纳他霉索会随粪便排出，故很难被消化道 吸收。给奶牛喂饲高剂量的纳他霉素，结果表明，9 0 的纳他霉素及其分解 产物经粪便排出1 5 i 。1 9 6 6 年，l e v i n s k a s 等研究纳他霉素的急性毒性和慢性 毒性，证明纳他霉索对人体器官没有明显影响，也不产生伤害。1 9 7 3 年 h a m i l t o nm i l l e r 报导纳他霉素口服毒性最小，静脉注射毒性极大。1 9 7 7 年， d eb o e r 和s t o l kh o r s t h u i s 研究了真菌对纳他霉素形成抗性的可能性，他们 在连续几年使用纳他霉素的食品仓库中，没有发现真菌形成抗性的证据，使 用大于m i c ( 最低有效抑制浓度) 的纳他霉索量，人为诱导也没有发现真菌形 成抗性的证据。1 9 8 2 年，r a y 和b u l l e r m a n 报导纳他霉素能减少黄曲霉产生 的黄曲毒素、赭曲霉产生的赭曲毒素、圆弧青霉产生的青霉酸、展开青霉产 生的展开青霉素p l 。因此，纳他霉素能减少真菌毒素给人类造成的危害。 1 3 纳他霉素的应用 w h o 和f a o 规定消费者每天纳他霉素晟大摄入量( a d i ) 为0 3 m g k g 体重， 奶酪和香肠的一般消费者每天摄入量约为0 0 0 2 m g k g 体重i 。1 9 9 8 年g r a s 专 家组认定纳他霉素用于酸奶、奶油、千酪、酸性稀奶油和农家干酪非常安全。 目前，荷兰、比利时、法国、西班牙、意大利、瑞典等国家都允许纳他霉索用 于干酪和硬香肠的防腐，荷兰还批准纳他霉素用于苹果和梨的防腐。在中国， 纳他霉素被批准用于干酪、肉制品、月饼、糕点、果汁原浆以及易发霉食品加 工器皿的表面，一般采用2 0 0 - - 3 0 0 m g k g 悬浮液浸泡或喷洒，残留量不超过 l o m g k g 。纳他霉素也被批准直接添加到发酵酒、酸奶和色拉酱中，限量为 l o m k g ( 食品添加剂使用卫生标准：g b 2 7 6 0 - - 9 6 ，1 7 0 ，防腐剂) d i 。 1 3 1 纳他霉素在食品中的应用 t 9 8 2 年6 月，美国f d a 正式批准纳他霉素可用作食品防腐剂l “。1 9 9 6 年， 中国食品添加剂标准化技术委员会正式批准纳他霉素可作为食品防腐剂吲。纳 他霉素对酵母菌及霉菌等丝状真菌有极强的抑制或杀灭作用 6 j 。纳他霉素与乳 链球菌肽是目前国际上批准使用的仅有的两种生物食品防腐剂。 纳他霉索由于溶解度很低，被用作食品表面防腐剂以增加货架期，主要 在奶酪、肉制品、葡萄酒、茶饮料及果汁中添加，它不会干扰其它食品组分， 也不会带来异味。它在食品中的抗真菌作用是双效的：既可防止真菌引起的食 品腐败，减少经济损失；又可防止真菌毒素给人类造成的毒素型食物中毒。纳 他霉素在很低的浓度下仍具有活性。目前，全世界已有三十多个国家采用纳他 霉素作为食品防腐剂。 天律科技大学硕士学位论文 1 干酪、肉制品和焙烤食品 纳他霉素应用于奶酪生产的工艺己很成熟。纳他霉素用于干酪皮防止其 表面发霉，它不会渗透到干酪内部，仅仅停留在酪皮外层l m m 处，而这一部 分般不会被取食，干酪放置5 1 0 周后，纳他霉素基本消失，此时酪皮变硬 不易受到霉菌侵染，纳他霉素对细菌无效，因而不会影响干酪和干酪制品的熟 化。使用方法一般有浸泡、喷洒或乳剂覆膜，o 5 ( w l v ) 的纳他霉素用于奶 酪就可有效防止丝状真菌的污染b 】。 在肉制品中使用2 0 0 0 m g k g 的纳他霉索混悬液对其进行浸泡或喷洒，可 达到纳他霉素含量为8ug c m 2 安全而有效的防霉水平。对于香肠来说，纳他 霉素可在以下数个步骤中添加：发酵前；肠衣浸泡；己灌料香肠的浸泡；已灌 料香肠的表面喷洒| 5 i 。 纳他霉素在焙烤产品中也有一定的应用。黑面包和白面包表面洒有l o o 一 5 0 0 m g k g 的纳他霉素混悬液时的防霉效果不错。用纳他霉素对生面团进行表 面处理，也收到了理想效果。 2 果汁与茶饮料 纳他霉素在果汁中的应用也很广泛。对于葡萄汁，添加2 0 m g k g 纳他霉 素就能防止酵母发酵；对于2 5 4 下保存的橙汁，自然条件下保存一周就会 受到真菌的污染，而仅使用1 2 5 m k g 低剂量的纳他霉素就能使保质期延长到 8 周| 4 i 。1 9 9 9 年，c i r i g l i a n o m c 等人报导，纳他霉素用于茶饮料，可以有效防 止真菌腐败，并使其口感更好p l 。 3 水果 纳他霉素用于水果储存中，可有效防止真菌引起的有氧降解口j 。将整个苹 果浸泡在含有o s g l 纳他霉素的悬液中1 2 m i n 后，存放8 个月，苹果变质 数目比未处理的批次有效减少。另据报导，用卵磷脂一纳他霉素混合液浸洗苹 果可有效防止其出现霉腐斑点。 此外，纳他霉素用于卷心菜叶的防腐，以及在草、马铃薯种子和水仙花 球茎中的应用，都取得了满意的效果【8 j 。目前，纳他霉素在我国的应用也越来 越广泛。据报导，纳他霉素用于沙拉酱、人造奶油、果冻、酱菜和广式月饼， 防霉效果均很好 9 ”】。 1 3 2 纳他霉素在医疗中的应用 纳他霉素除了用作食品防腐剂，还可药用。近几年，报导纳他霉素医疗 应用的文献越来越多，它的临床应用范围也越来越广泛，主要由于它具有以下 一些优良性质：( 1 ) 口服毒性非常低；( 2 ) 肠道无吸收；( 3 ) 无过敏反应；( 4 ) 无交叉抗性。纳他霉素以几种制剂形式( 悬浮剂、乳剂、软膏和鞘状药片等) 被用于抗皮肤和粘膜的真菌感染，既可以单独使用也可以与新霉素、氢化可的 松及其它类固醇类药品共同使用。纳他霉素还可用于阴道和肺部真菌感染的治 前言 疗时”】。 1 9 9 7 年9 月，k a l i u z h n a i al d ，m u r z i n ae a 报导，不同剂量的纳他霉素用 于治疗由真菌引起的儿童皮肤和粘液膜感染非常有效l 。最新的文献显示，纳 他霉素已成功的用于真菌性角膜炎的治疗中，临床应用方式为使用5 混悬液 滴眼13 , 1 4 。 目前，纳他霉素已被广泛用于食品、医疗、饲料、粮储等领域中，特别是 在食品原料保鲜、成品防腐方面的应用显示了良好的前景。 1 4 纳他霉素的生产概况 1 4 1 纳他霉素产生菌 目前报导的纳他霉素产生菌有三种： 1 ) 恰塔努加链霉菌s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o v g e n s i s ，a t c c1 3 3 5 8 孢子丝圈至螺旋形，有时柔睦，孢子呈球形或椭圆形，表面带细刺。 2 ) 纳塔尔链霉菌s t r e p t o m y c e s n a t a l e n s i s ，i s p5 3 5 7 孢子丝2 5 圈松敞螺旋形，孢子呈球形或卵圆形，表面带小刺。 3 ) 褐黄孢链霉菌s t r e p l o m y c e s g i l v o s p o r e u s ，a t c c1 3 3 2 6 孢子丝螺旋形，孢子呈球形或卵圆形，孢子表面带刺。 1 4 2 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径可以分解为活化前体的生成( 乙酰辅 酶a 和丙二酰辅酶a ) 、内酯大环的生物合成( 多聚乙酰途径) 和氨基糖的形 成。如图1 3 所示。 1 4 3 抗生素生产的代谢调控及前体物质在抗生素合成中的作用 次级代谢产物在微生物生命活动中有一定的生理功能，所以必然处于微生 物的总体调节控制之中。抗生素的合成调节机制，主要有诱导调节，反馈调节、 碳氮分解产物调节、磷酸盐调节等，其中反馈调节中的自身反馈抑制和阻遏起 着重要的调节作用。研究认为，抑制抗生素自身合成所需要的抗生素浓度与产 生菌的生产能力呈正相关性【1 5 i 。 前体物质( p r e c u r s o r ) 在抗生素合成中起着重要的作用。次级代谢物的生物 合成过程除了在前体的形成和聚合这两部分外，遵循一般的生物合成规律。次 级代谢途径同初级代谢的分解代谢、无定向代谢和组成代谢紧密相关。其前体 通常是正常的或经修饰的初级代谢的中间体。前体是在细胞内生成的或由培养 基提供的能被代谢形成某种终产物的物质，能被微生物结合到产物分子中去， 进一步代谢，并最终获得该途径的终产物，且具有促进产物合成的作用。 但是，外源前体在发酵液中的残留浓度过高，会使生产菌中毒，不利于抗 生素的合成。但前体不足也不行。因此，研究适当的前体添加策略对有些抗生 素的高产稳产有重要意义。如青霉素g 的生产需要加入苯乙酸或苯乙胺。其 发酵培养基中常用玉米浆的原因之一就是这种原料含有苯乙胺。苯乙酸还具有 天津科技大学硕士学位论文 促进青霉素生物合成的作用，可在基础料中和发酵过程中添加。高产菌株对前 体的利用率往往比低产菌株高许多。添加前体时宜少量多次或流加，控制发酵 液中前体的残留浓度在适当范围6 】。目前对于前体物对抗生素生产作用的研究 除上述的青霉素g 外，还有柱晶白霉素、螺旋霉素、利福霉素和红霉素等 i l - 9 ，2 0 】。 刁；仅前体物影响抗生素的生物合成，铵离子对抗生素生产也有影响。发酵 培养基中铵离子浓度过高会抑制多种大环内脂类抗生素，如柱晶白霉素、螺旋 霉素、泰洛星的合成。向培养基中加入铵离子捕捉剂磷酸镁、沸石等，可使抗 生素产量大幅度提高。有报导认为，这是由于磷酸镁与铵离子形成溶解度很小 的复盐，解除了铵离子对抗生索合成的抑制作用i l “。 目前还没有关于纳他霉素生产的代谢调控及前体物质等在纳他霉素合成中 作用的报导。本论文对其做了初步的研究。 蕾翻囊 1 l 一一一一。一， i ，6 c 啸量- - 1 l 盛艘珥霹式再曩辟 f i a o p h h o ， * * # f # m 学t 垅j 一獬 * * * 一 、 注：一一代表能量代谢 代表应阻断的代谢途径 图l 一3多烯大环内酯抗生素的生物合成途径 1 4 4 国内外发酵法生产纳他霉素的概况 早在1 9 6 0 年，c y a n a m i d 就报导了发酵生产纳他霉索的方法。但接下来的 相关报导比较少，直到九十年代，有关纳他霉索的生产研究才重新受到关注。 蔓 礴删0 盯 绷一 唧伊0卜屯一 、l 一 - m 荤童卜， 一脒一 1 前言 1 9 9 3 年，m a 艾森申克的专利c n1 0 7 1 4 6 0 a 报导了发酵法生产纳他霉素 的菌种培养和繁殖方法。要求用一种适宜的生孢予琼脂培养基，种菌繁殖所用 的孢子悬浮液应包含的孢予浓度约为1 0 5 一l o ”c f u m l 。适宜的种菌细胞密度 含有约l 一5 9 l 的干细胞重，并且是纳他霉素生产培养基体积的0 1 一 1 0 ”1 。 专利c n1 0 7 2 9 5 9 a 中报导，通过控制发酵培养基的p h 值可以提高纳他 霉素的生产速率：在纳他霉素发酵主阶段即抗生素生产阶段，向发酵液中加入 适宜的p h 控制剂( 如n a o h 、k o h 、c a ( 0 h ) ：等) 以控制发酵液p h 值，使 其维持在59 6l ，可提高纳他霉素生产速率和产率，一般生产时间可减少2 0 一6 0 ，产量可达5 9 l t 2 ”。 同年，r t 奥尔森的专利c n1 0 7 0 6 8 8 a 报导了连续发酵生产纳他霉素的工 艺。第一阶段，进行有效的菌体繁殖，伴随部分纳他霉素的产生。在发酵的第 二阶段进行连续生产，维持发酵液的体积基本不变，使加入培养基的速度和取 出发酵液的速度基本一致，这样最终产量可达6 1 2 窟几1 。 1 9 9 4 年，e i s e n s c h i n k ，m i c h a e la l l e n 等人的专利报导了流加碳、氮源进 行纳他霉素发酵的方法。指出发酵培养基中至少应有1 5 9 c 的蛋白类氮源和8 0 一2 5 0 9 l 的碳源，其中碳源要不断流加，使其浓度保持在5 3 0 虮。，纳他霉 素产量可以达到5 9 l l l 2 。 2 0 0 0 年，e n s h a s y h a ，f a r i dm a 等人报导了接种物类型和培养条件对纳 塔尔链霉菌产生纳他霉素发酵的影响。指出用孢子悬液而不用营养细胞按种， 且孢子悬液浓度应为1 0 8 个m l 。培养条件主要研究了溶氧水平对发酵的影响， 并指出向培养基中添加水溶性生物聚合物如褐藻酸钠可以降低溶解氧，使纳他 霉素的产量下降1 。同年，他们报导了通过最佳碳、氮源的选择及其比例的优 化。但其发酵水平较低，仅为1 5 9 l 1 2 6 l 。 1 4 5 纳他霉素基因工程研究进展 目前，世界上对纳他霉素产生菌基因工程方面的研究刚刚起步，相关报 导较少。 1 9 9 9 年，a p a r i c i oj f , c o l i n aa j 等人研究了纳他霉索产生菌纳塔尔链霉菌 的生物合成基因簇，发现其染色体组包含1 1 0 k b 碱基对。他们还报导了由功 能基因分隔的两个亚簇编码的聚酮合酶基因组，包含两个主要的基因p i m s 0 和p i m s l ，p i m s 0 编码一个相对较小( 约1 9 3 k d a ) 的乙酸激活聚酮合酶( p k s ) 基因，p i m s l 编码一个大约7 1 0 k d a 的多酶基因口7 1 。 2 0 0 0 年，a p a r i c i oj f , f o u c e sr 等人报导了纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌 的一个含1 6 个开放读码框( 见表1 2 ) ，8 49 8 5 b p 基因簇的序列，这是继制霉 菌素后报导的第二个多烯大环生物合成基因簇，它编码聚酮合酶( p k s ) 的1 3 个同源酶基因，p k s 被分配在五个巨大的多酶系统中( p i m s 0 一p i m s 4 ) 2 8 1 。 天律科技大学硕士学位论文 同年，m a r t avm e n d e s ，j e s u sea p a r i c i o 等人又研究报导了纳塔尔链霉菌中的 一个隐蔽质粒p s n a l 的基因图谱和全部核苷酸序列，d n a 分子大小为 9 3 6 7 b p ，g + c 的含量占7 1 3 ，拷贝数3 0 。p s n a i 包含七个开放阅读框，分 别编码不同的蛋白质【2 9 1 。 2 0 0 1 年，m a r t avm e n d e s ，e l i s e or e c i o 等人报导了从纳他霉素产生菌纳 塔尔链霉菌中获得的目的基因片段p i m d ，它编码细胞色素p 4 5 0 环氧酶，负 责将4 ，5 一去环氧匹马霉素( 4 ，5 - - d e - - e p o x y p i m a r i c i n ) 转变成匹马霉索。4 ， 5 一去环氧匹马霉素是一种生物活性物质，是从纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌 的一个重组突变体中分离得到的p o i 。 目前，基因工程在抗生素生产中的应用还是初步的，关键问题是对抗生素 生物合成途径和代谢调节机理的认识非常有限，但随着人们对抗生索合成基因 研究的不断深入，基因工程在提高抗生索产量方面是大有可为的，它是目前生 物技术研究中最接近产业化的领域之一。 表l 2 纳他霉素生物合成基因簇0 r f s 及结构域 9 一 i 前言 1 5 纳他霉素的分离提取 纳他霉素的分离提取方法有很多。英国专利g b 8 4 6 9 3 3 、美国专利 n o 3 3 7 8 4 4 1 、专利g b 2 1 0 6 4 9 8 、世界专利w o9 2 1 1 0 5 8 0 都报导了相关的提取 方法。但这些提取过程一股要求多级纯化，操作费用比较昂贵，且纳他霉素提 取量较低。 1 9 9 9 年8 月，美国专利5 9 4 2 6 1 1 报导了一种有效的提取高质量纳他霉素 的方法，通过这种方法，干燥产品纯度可达9 4 9 9 ( 无结晶水计算) ，纳他 霉索回收率可达4 0 一7 0 。该方法的提取过程主要包括四步l ： ( 1 ) 用错流过滤发酵液，浓缩至发酵液浓度达到l o 一5 0 ( 、v ) ，浓 缩过程中，可以在5 0 7 0 条件下加热发酵液以提高蒸发量和过滤速率。 ( 2 ) 调节发酵液的p h 在1 0 一1 1 ，添加足够量的水溶性有机溶剂如乙醇、 丙醇、异丙醇、丙酮、四氢映喃等溶解发酵液中的纳他霉素。可通过加抗氧化 剂如抗坏血酸、b h a 、b h t 等来进一步提高纳他霉素的稳定性。 ( 3 ) 通过错流过滤除去没有活性的发酵不溶物。 ( 4 ) 调节过滤液的p h 在5 5 75 范围内，使纳他霉素沉淀。过滤得到 析出的晶体，可用于进一步纯化，干燥。 1 6 纳他霉素的检钡4 纳他霉素的检测目前主要有三种：生物检测方法、l i p l c 法和紫外分光光 度法。 纳他霉素效价的生物检测法主要采用管碟法。管碟法利用抗生素在琼脂 培养基中的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液和未知浓度的样品在含有敏 感性实验菌韵琼脂表面进行扩散渗透，对被试菌产生热制作用而形成抑菌圈。 因为抑菌圈的大小和抗生素的浓度之间有一定的对应关系，所以通过测定抑菌 圈大小就可以确定抗生素效价。该方法符合临床使用的实际情况，灵敏度较高， 不需要特殊设备，且反映了所测抗生索的实际杀菌效果。因此被国际公认，我 国也以之作为药品成品的标准检测方法之一。但该方法操作繁琐，对实验条件 及操作水平要求较高，测定周期较长，对于工业生产而言，不够快捷方便口2 蚓。 高效液相色谱( h p l c ) 法由于其操作简便、精密度高，因此广泛地用于 检测食品中残留纳他霉素的含量。高效液相色谱( h p l c ) 法检测纳他霉素广 天津科技大学硕士学位论文 泛采用c 。反相柱，纳他霉素在3 0 3 n m 处有最大吸收峰，所以检测器采用u v 检测器，常见流动相如表1 3 所示。 表1 3h p l c 法检测纳他霉素常用流动相 f r e d e 利用，l c 鉴定乳酪浸出物中的纳他霉素，取得了较好的结果m i 。 r o e z 在1 9 9 7 年报导，可以用h p l c 法检测成熟乳酪中纳他霉素残量。1 9 9 8 年，r y b i n s k a - - k 也对食品中残留纳他霉素的检测进行了研究口i 。 1 9 9 8 年，王克利等人利用冰乙酸：水( 5 ：4 0 ) 直接提取沙拉酱中的纳他霉 素，离心分离后，在高效液相色谱仪上于波长3 0 5 n m 处测定其含量。方法操 作简易，精密度c v = 24 ；线性范围o 1 0 1 1 g m l t ”】。电有在以乙酸铵和氯 化铵的水浴液、四氢呋喃和乙腈为流动相，用硅化十八烷( o d s ) 反相色谱进 行纳他霉索检测的报导f 5 】 h p l c 法在工业生产中也有相关应用，但作为企业秘密，并不具体描述于 文献之中l l 2 】。本文通过试验，确定了褐黄孢链霉菌s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s 发酵生产纳他霉素的 ，l c 检测方法。 用紫外分光光度计测定纳他霉素也有相关报导。h a r r yb r i k 研究了在含有 0 1 醋酸的甲醇中纳他霉素的紫外光谱，乙酸作为波长稳定剂。纳他霉素的 紫外光谱显示，在a = 2 9 0 、3 0 3 、3 1 8 n m 处有尖锐的最大吸收峰，因此紫外分 光光度法可检测纳他霉素。在2 2 0 n m 处有宽峰，可以把它同制霉菌素与两性 霉索区分开。2 8 0 - - - 3 2 0 n m 之间出现的吸收峰是由于其具有四烯环的性质。 f l e t o u r i s - - - d j 等人研究了紫外分光光度法分析奶酪和奶酪皮中的纳他霉 素的方法。检测样品与酸性水合乙氰混匀，过滤，滤液在3 2 26 n m 下直接测 定，测定范围0 5 - - 2 0 m g k g ，可得到较好的线性关系( r = o 9 9 8 8 ) i ”j 。 1 7 菌体生长生产耦合度研究 在微生物发酵过程中，细胞的作用相当于一个个微型反应器，通过其代谢 活动来合成我们所需的产品，因此细胞的密度和单位细胞的生产能力是最终决 定发酵水平的两个重要因素。但对于不同的发酵过程，细胞生长和产物合成的 关系并不相同。大多数研究者采用耦合和非耦合来定性描述它们的关系。但耦 1 前言 合和非耦合是细胞生长和产物合成关系的两种理想，而实际发酵过程生长生产 关系大都介于它们之间，属于半耦合型。上述耦合、非耦合的定性划分不能将 实际发酵过程在生长生产关系上的差别体现出来【5 2 l 。 判断菌体生长和产物合成是否耦合的依据是菌体的高速生长期和产物的高 速合成期是相互重合还是分离。所以可以通过发酵动力学分析，从发酵过程中 分出高速生长期和产物的高速合成期两个阶段，利用这两个阶段的重叠情况来 表征生产生长的耦合度。 张磊借用模糊理论中的隶属度函数概念，对上述两个阶段进行了量化，并 研究了富硒酵母发酵、基因工程假单孢杆菌发酵和红豆杉植物细胞培养的耦合 度，分别为8 3 ，4 5 ，3 0 。并对假单孢杆菌发酵进行了两段发酵研究，取 得了较好的结果l 5 “。 1 8 本论文的立项背景及内容 世界上每年有2 0 以上的粮食及食品因腐败变质而造成巨大的浪费和经济 损失。每年我国粮食霉变损失约占全国总产量的7 1 2 。1 9 9 6 年行业内部数 据统计，因霉腐而造成的经济损失达5 6 亿元，为同期火灾损失的2 3 倍。变 质食品还会危及人们的身体健康。因食品变质导致食物中毒的事件时有发生， 所以，食品的防腐、保鲜、是食品加工、流通、贮存过程中的重要措施之一。 在这种严峻形势下，防腐剂工业开始蓬勃发展起来。我国食品防腐剂1 9 9 7 年的总产量就己达2 万多吨，成为食品工业的一个重要产业部门。目前世界各 国允许使用的食品防腐剂品种己超过5 0 种，年总消耗量达8 万吨以上。我国 允许使用的品种有2 6 种，其中大多为化学合成防腐剂。经过对一些纯化学防 腐剂的研究，人们发现其有致癌或潜在致癌的可能性。如：亚硝酸盐可与肉中 的胺作用，生成亚硝酸胺类物质，这是一种强致癌剂。另外，由于在防腐剂的 应用历史中，不断发现某些防腐剂对人体的危害作用而被禁用，包括硼砂、甲 醛、水杨酸等。目前在我国仍在使用的苯甲酸( 钠) ，在限量范围内安全的，但 仍然有一定的毒性，且有叠加中毒的报导，导致在使用上的争议，致使原来产 量很大的日本，已停止生产，欧共体己禁止其用于儿童食品。因此客观上要求 有更安全有效的天然防腐剂来取代合成防腐剂，目前，国际上仅规定在a a 级 的绿色食品中，必须使用天然防腐剂，而随着社会的发展，人们的生活水平的 提高，天然生物防腐剂的应用范围将越来越广，需求量将成倍增长。从前景来 说，这种取代是必然的。 随着人们对化学合成食品防腐剂安全性认识的提高，低毒、高效、广谱及 经济实用的生物食品防腐剂的研究和开发，将愈来愈受到人们的关注。纳他霉 素是一种广谱高效的天然生物防腐剂，己广泛地应用于食品、医疗等领域。美 国及荷兰已有几个公司生产销售纳他霉素，纳他霉素在我国的生产尚在起步阶 段，本课题作为天津市自然科学基金资助项目( 项目编号：0 1 3 6 0 9 5 1 1 ) ，旨在 1 2 天津利技大学硕士学位论文 填补这一空白。 本论文的主要研究内容 一 一 2 材料与方法 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 菌种 出发菌株：褐黄孢链霉菌sg i l v o s p o r e u s , a t c c l 3 3 2 6 。 2 1 2 主要药品 无水葡萄糖 麦芽浸粉 琼脂粉 豆油 菜籽油 牛肉膏 硬脂酸 果糖 玉米浆 乳糖 木糖 甘油 葡聚糖 胰蛋白胨 酪蛋白水解物 尿素 硫酸铵 普通蛋白胨 大豆蛋白胨 酵母粉 糊精 可溶性淀粉 麦芽糖 蔗糖 生物素 乙酸钠 丙酸钠 丙二酸钠 磷酸镁 霉克 分析纯天津市化学试剂一厂 r t上海生工生物工程有限公司 生化试剂北京化学试剂公司 市售 市售 生化试剂天津市珠江卫生材料厂 生化试剂西安化学试剂厂 生化试剂北京化工厂 分析纯华北制药厂 分析纯上海试剂二厂 生化试剂北京化工厂 分析纯天津市化学试剂批发公司 生化试剂上海化学试剂厂 生化试剂英国o x o i d 公司 生化试剂北京双旋微生物培养基制品厂 化学纯天津化学试剂二厂 分析纯天津石英钟厂霸州市化工厂 微生物培养基用大五化学株式会社 生化试剂北京海淀区微生物培养基制品厂 生化试剂北京海淀区微生物培养基制品厂 分析纯成都市彭县丽春化学厂 分析纯天津市化学试剂批发部 生化试剂天津化学试剂批发部 分析纯天津市化学试剂一厂 分析纯美国s i g m a 公司 分析纯南开化工厂 分析纯天津市化学试剂三厂 分析纯天津市化学试剂三厂 分析纯美国s i g m a 公司 广州科特尔有限公司 天津科技大学硕士学位论文 n a c l 分析纯 l i c j n a o h 分析纯 f e s o 。分析纯 k 2 c r 2 0 7分析纯 c u s o 。5 h 2 0 分析纯 甲醇分析纯 结晶紫生物染色素 k h ：p o 。分析纯 m g s o 。分祈纯 亚铁氰化钾分析纯 h c l分析纯 磷酸分析纯 硫代硫酸钠分析纯 硫酸二乙酯( d e s l 硫酸链霉素分析纯 2 。1 3 主要仪器 5 l 自动发酵罐 超净工作台 回转式恒温调速摇瓶柜 l d 5 1 0 型离心机 t g 卜1 6 b 高速台式离心机 电热恒温培养箱 d f g 8 0 1 型电热鼓风机 h k c b 一3 型恒控磁力搅拌器 c h b 型普通光学显微镜 电子分析天平 抗生素效价测量仪 p h 计 g l 2 0 a 型高速冷冻离心机 y x q g 0 2 型电热式蒸汽消毒器 银州牌立式压力蒸汽消毒器 高效液相色谱分析仪 s b a 生物传感分析仪 微量进样器 超纯水器 天津市塘沽化学试剂厂 em e r c k d a r m s t a d t 天津市河北红星化工包装厂 西安化学试剂厂 天津市化学试剂厂 天津信达有色金属公司 天津市天大化工实验厂 上海试剂三厂 天津市化学试剂六厂 天津市化学试剂一厂 天津市公私合营化学试剂第二厂 天津化学试剂三厂 天津化学试剂部 天津市化学试剂公司 天津市化学试剂六厂 上海生工 德国b b r a u n 苏州净化设备厂 上海新星自动化控制设备成套厂 北京医用离心机厂 上海安亭科学仪器厂 天津市实验仪器厂 湖北省黄石市医疗器械厂 温州市医疗电器厂 日本o l y m ! p u s 日本a n d 北京湘声生物工程公司 梅特勒一托利多仪器( 上海) 公司 湖南湘仪 山东新华医疗器械厂 铁岭市医疗器械总厂 德国b i o t r o n i k 山东省科学院生物研究所 北京青云航空仪表有限公司 北京普析通用仪