基因工程genetic engineering.doc

1. 基因工程genetic engineering：在分子水平上，提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA（基因）在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并能稳定地传给下代。2. Northern blotting：指的是将电泳凝胶中的RNA转移到叠氮化的或其他化学修饰的化学滤膜上，通过工价交联作用而使它们永久结合在一起的方法。3. 载体Vehicle：携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。4. T-DNA：农杆菌Ti或Ri质粒中的一段DNA序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中,已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体5. 定点诱变：特异性地改变一段克隆DNA序列中的任何碱基，叫定点诱变。6. 限制性核酸内切酶：酶因能阻止外源DNA的入侵，能切割降解噬菌体DNA而限制外源DNA。7. Westernblotting：使蛋白质的电泳条带从聚丙烯酰胺凝胶中转移到硝酸纤维素膜或是尼龙膜上，然后紧密结合的方法8. DNA连接酶：用限制性内切核酸酶切割不同来源的DNA分子，再重组则需要用另一种酶来完成这些杂合分子的链接和封合。9. 盒式诱变：用人工合成的具有多种突变的双链寡核苷酸片段替换靶DNA的对应片段。10. cDNA文库cDNA library:将生物某一组织细胞中的总mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA，然后接到合适的载体上，转入到宿主细胞后形成的所有克隆叫cDNA文库。11. 发育可塑性：通过将组织外植体、愈伤组织、细胞悬浮液或原生质体置于适当的培养基上使完整的可育植株再生12. 结合Conjugation指两个细菌之间的杂交，部分染色体从一个细胞转入另一个细胞13. 回文序列：顺看反看都一样的序列。14. 粘性末端cohesive ends：当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切断DNA时，就可在切口处留下几个未配对的核苷酸15. 平末端Bluntends ：当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。16. 同裂酶isoschizomers：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列。17. 同尾酶Isocaudiners：一类识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能酶切产生相同黏性末端的限制性内切酶。18. 柯斯质粒cosmid：是另外一种以入(叫landa)噬菌体为基础专门为克隆大片段而设计并和质粒共同构建的杂合载体。19. YAC（酵母人工染色体）：能在酵母菌中繁殖、可携带长达1Mb的外源DNA的克隆载体。20. BAC（细菌人工染色体）：由大肠杆菌单拷贝F质粒衍生而成的，可用于克隆基因组大片段DNA及构建基因组文库的克隆载体。1、cDNA文库有什么特点。如何利用噬菌体构建cDNA文库? （15分） (1) 总RNA的提取 (2) mRNA的分离 (3) mRNA的纯化(4) cDNA第一条链的合成随机引物法；oligo-dT(12-18)引物法;(5) cDNA第二条链的合成(6) cDNA的甲基化和接头的加入(7) cDNA同载体的连接 (8) 噬菌体蛋白的体外包装(9) 噬菌斑原位杂交分离基因2、用叶盘法将克隆好的抗除草剂的双载体体系转化植株，获得抗除草剂的植物。请设计实验步骤。If you have cloned the herbicide resisting gene and only have binary vectors in your lab, please design an experimental procedure to produce a plant bearing herbicide resisting ability using the leaf-disc transformation method. （15分）1通过电穿孔或“大肠杆菌与根瘤农杆菌接合，使除草剂抗性基因中间表达载体转化根瘤农杆菌。并经卡那霉素筛选和PCR鉴定阳性菌株。2 在叶片上打孔得到小叶盘（直径几毫米），并将其表面消毒3小叶盘与携带重组T-DNA的根瘤农杆菌液体共培养过夜 。4小叶盘干燥后，转移到固体培养基培养2天。Or in English 3、PCR技术的原理及技术特点？（15分）原理：首先是双链DNA分子临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子，（2分）然后DNA聚合酶（1分）以单链DNA为模板（1分）并利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）（1分）合成新生的DNA互补链。此外，DNA聚合酶同样需要有一小段双链DNA来启动“引导”新链的合成。因此，新合成的DNA链的起点，事实上是由加入的反应混合物中的一对寡核苷酸引物（1分）在模板DNA链两端的退火位点决定的。（或者利用PCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、（1分）引物（1分）和4种脱氧核糖核苷酸（1分）存在的条件下利用DNA聚合酶（1分）的酶促反应，是通过3个温度依赖性步骤（2分）完成的反复循环。）特点：(各1分)1、特异性强 2、敏感性高 3、快速：整个PCR操作过程需3-4小时即可完成。4、简便：扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆，摆脱了繁琐的基因分析方法。5、可扩增RNA或cDNA 6、对起始材料质量要求低 7、具有一定程度单核苷酸错误掺入 4、植物/动物转基因有哪些方法？各有什么特点？ 动物转基因有： l 磷酸钙转染法DNA磷酸钙共沉淀l 脂质体介导法l 葡聚糖化学法l 电穿孔法l 显微注射法l 基因枪法l 逆转录病毒法l 胚胎干细胞法l 体细胞核移植法l 病毒颗粒转导法l 聚阳离子转染法1、显微注射法：用显微注射法如何获取转基因小鼠？l 准备DNA：纯度高，不带有载体序列l 准备小鼠l 分离受精卵l 显微注射l 移植受精卵l 鉴定转基因小鼠l 建立转基因小鼠品系2、逆转录病毒法：3、胚胎干细胞法：4、体细胞核移植法： 植物转基因有：1 植物转基因有：1.1 直接转移法：1.2 原生质体转化法多聚物介导法化学刺激法1.3 电穿孔法1.4 基因枪法微粒轰炸法1.5 花粉管通道法1.6 超声波介导转化法1.7 脂质体介导法1.8 激光微束穿孔转化微激光束法1.9 显微注射法2 农杆菌介导的质粒载体转化法2.1 叶盘法转化植物细胞2.2 整体植株接种转化法2.3 原生质体共培养转化法2.4 悬浮细胞共培养转化法3 植物病毒介导感染法1、原生质体转化法；2、基因枪法；3、农杆菌介导法；4、电穿孔法；5、花粉管通道法；6、超声波法；7、植物病毒介导感染。简答题目举例说明基因工程的技术路线。答：分，切，接，转，筛，表。1）分离目的基因和载体；2）切割目的基因和载体；3）将目的基因和载体连接；4）将重组体转入宿主细胞；5）筛选重组克隆；6）表达外源蛋白。1、理想的质粒载体应具备哪些条件？答：1）相对分子质量小；2）可以在宿主细胞中产生便于选择的表型特征；3)多种限制性内切酶有单一位点，位点最好位于易测表型基因上。2、举例说明限制性内切酶的命名原则答：人们根据限制性内切核酸酶来源的菌株进行命名。有的编码限制性内切核酸酶基因位于质粒上，则可用质粒名来代替。如果在这种菌株首先发现一种限制性内切核酸酶，则在名字的后面加罗马数字I。如果多于一种，则分别加上II或III。3、说明Sanger DNA测序法的原理答：是利用DNA聚合酶合成DNA，在DNA聚合过程中在特异性的核苷酸位置终止反应而进行测序。反应的终止依赖于特殊的反应底物2，3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），它们与DNA聚合反应所需的底物2-脱氧核苷三磷酸（dNTP）的结构相同，只有在3位是氢离子而不是羧基。但在DNA聚合酶作用下它们都能通过其5三磷酸集团掺入到正在增长的DNA的链中，形成磷酸二脂键，由于ddNTP缺乏3羟基而不能同后续的dNTP或ddNTP形成磷酸二酯键，因此一旦ddNTP掺入DNA的新生链中，聚合反应就会立即终止，也即在本来应是某个2-脱氧核苷三磷酸（dNTTP）掺入的位置上，便发生了特异性的链终止效应。4、基因工程建立的理论基础和技术基础是什么？答：基因工程建立的理论基础： 1DNA双螺旋的发现 2遗传密码子 3中心法则 。技术基础 ： 1DNA连接酶的发现 2DNA限制性内 3切酶的发现 载体的发现基因工程是在分子生物学等学科基础上发展起来的，基因工程的发展和这些学科的发展相联系的，反过来它也渗透到生命科学的各个领域，促进着生命科学各学科的研究与应用。基因工程技术在农业，林业，医药，食品，环保等行业和领域的研究和应用都取得了很大的进展，既为工农业生产和医药卫生等开拓了新途径，又给高等生物的细胞分化，生长发育，肿瘤发生等基础研究提供了有效地实验手段。5、简述Southern 印迹杂交的步骤。答：1 待测核酸样品的制备 制备待测DNA DNA限制酶消化2琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品3电泳凝胶预处理通常是将电泳凝胶浸泡在0.25mol/L 的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理之后，移至于碱性溶液中浸泡，使DNA变形并断裂形成较短的单链DNA片段，再用中性PH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。这样，DNA片段经过碱变性作用，亦会使之保持单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。4转膜即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等5探针标记6预杂交将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。这就是预杂交的目的。预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，7、Southern杂交将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交8、洗膜 9、放射性自显影检测6、限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响？答：1）温度；2）盐离子浓度；3)缓冲体系；4）反应体积和甘油浓度；5）限制性内切核酸酶反应的时间；6）DNA的纯度和结构7、简述宿主细胞必须具备哪些性能？8、YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性?9、简述基因组文库与cDNA文库的区别答：基因组文库是从供体生物制备基因组DNA，并用限制性内切核酸酶切产生出适于克隆的DNA片段，然后再体外将这些DNA片段同适当的载体连接成重组体分子，并接入到大肠杆菌的受体细胞中去。高质量的基因组DNA的分离是成功构建其基因文库的基础。cDNA文库的分子两端加上带合适的限制性内切核酸酶位点的人工街头，然后再将其与载体DNA连接，转化大肠杆菌，即得到cDNA文库。构建cDNA文库的第一个步骤是分离细胞总RNA。或者cDNA文库 以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组。DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去