基因工程复习2011年14日.doc

1. 基因工程genetic engineering在分子水平上，提取（合成）不同生物的遗传物质，在体外切割，和一定的载体拼接重组，把重组DNA分子引入细胞和生物体内，使外源DNA在受体细胞中复制和表达，按需要繁殖扩增基因或生产不同产物或定向创造生物新性状，并稳定遗传给下代。2. Northern blotting将电泳凝胶中的RNA转移到叠氮化的或其他化学修饰的活性滤纸上，通过共价交联作用使它们结合，因其方法同Southern杂交十分相似，故称之为Northern杂交。 3. 载体Vehicle在基因工程中，镌带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。4. T-DNA即转移DNA，是农杆菌感染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA序列。5. 定点诱变是在体外特异性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术,包括盒式取代诱变、寡核苷酸引物诱变及PCR定点诱变等。6. 限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。7. Westernblotting用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将蛋白质从凝胶转移到一种固相支持物上，通过抗体与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异性反应进行检测。8DNA连接酶在DNA复制、修复和重组过程中发挥作用的催化磷酸二酯键合成的酶。 8. 盒式诱变是一种定点突变技术，将靶基因的一段DNA删掉，并用人工化学合成所具有的突变核苷酸的双链寡核苷酸片段取代。9. cDNA文库cDNA library将生物某一组织细胞中的总mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA,然后接到合适的载体上，转入到宿主细胞后形成的所有克隆就叫cDNA文库。10. 发育可塑性通过将组织外植体、愈伤组织、细胞悬浮液或原生质体置于适当的培养基上使完整的可育植株再生。11. 结合Conjugation两个细菌之间的杂交。部分染色体从一个细胞转入到另一个细胞，是细菌之间交换遗传物质的过程。12. 回文序列双链DNA中的一段反向重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。这段序列被称为回文序列。13. 粘性末端cohesive ends当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切断DNA时，就可在切口处留下几个未配对的核苷酸片段，即5突出。这些片断可以通过重叠的5末端形成的氢键相连，或者通过分子内反应环化。因此称这些片断具有粘性，叫做粘性末端。14. 平末端Bluntends 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。15. 同裂酶isoschizomers有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶的切割位点可能不同，识别和切割位点都相同的叫同序同切，识别位点相同但切割位点不同的叫同序异切酶。16. 同尾酶Isocaudiners切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。17. 考斯质粒cosmid本意是带有粘性末端位点的质粒, 因此, 柯斯质粒是人工建造的的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。18. YAC（酵母人工染色体）利用酵母着丝粒载体所构建的大片段DNA克隆。克隆载体上含有着丝粒、端粒、可选择标志基因、自主复制等序列，可携带插入的大片段DNA(1001000 kb)在酵母细胞中有效地复制，如同微小的人工染色体。是基因组研究的有用工具。19. BAC（细菌人工染色体）是指一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，长用来克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对。1、cDNA文库有什么特点。如何利用噬菌体构建cDNA文库? （15分）以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。 (1) 总RNA的提取 (2) mRNA的分离 (3) mRNA的纯化(4) cDNA第一条链的合成随机引物法；oligo-dT(12-18)引物法;(5) cDNA第二条链的合成(6) cDNA的甲基化和接头的加入(7) cDNA同载体的连接 (8) 噬菌体蛋白的体外包装(9) 噬菌斑原位杂交分离基因2、用叶盘法将克隆好的抗除草剂的双载体体系转化植株，获得抗除草剂的植物。请设计实验步骤。If you have cloned the herbicide resisting gene and only have binary vectors in your lab, please design an experimental procedure to produce a plant bearing herbicide resisting ability using the leaf-disc transformation method. （15分）1通过电穿孔或“大肠杆菌与根瘤农杆菌接合，使除草剂抗性基因中间表达载体转化根瘤农杆菌。并经卡那霉素筛选和PCR鉴定阳性菌株。2 在叶片上打孔得到小叶盘（直径几毫米），并将其表面消毒3小叶盘与携带重组T-DNA的根瘤农杆菌液体共培养过夜 。4小叶盘干燥后，转移到固体培养基培养2天。Or in English 3、PCR技术的原理及技术特点？（15分）原理：首先是双链DNA分子临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子，（2分）然后DNA聚合酶（1分）以单链DNA为模板（1分）并利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）（1分）合成新生的DNA互补链。此外，DNA聚合酶同样需要有一小段双链DNA来启动“引导”新链的合成。因此，新合成的DNA链的起点，事实上是由加入的反应混合物中的一对寡核苷酸引物（1分）在模板DNA链两端的退火位点决定的。（或者利用PCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、（1分）引物（1分）和4种脱氧核糖核苷酸（1分）存在的条件下利用DNA聚合酶（1分）的酶促反应，是通过3个温度依赖性步骤（2分）完成的反复循环。）特点：(各1分)1、特异性强 2、敏感性高 3、快速：整个PCR操作过程需3-4小时即可完成。4、简便：扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆，摆脱了繁琐的基因分析方法。5、可扩增RNA或cDNA 6、对起始材料质量要求低 7、具有一定程度单核苷酸错误掺入 4、植物/动物转基因有哪些方法？各有什么特点？ 动物转基因有： l 磷酸钙转染法DNA磷酸钙共沉淀l 脂质体介导法l 葡聚糖化学法l 电穿孔法l 显微注射法l 基因枪法l 逆转录病毒法l 胚胎干细胞法l 体细胞核移植法l 病毒颗粒转导法l 聚阳离子转染法1、显微注射法：用显微注射法如何获取转基因小鼠？l 准备DNA：纯度高，不带有载体序列l 准备小鼠l 分离受精卵l 显微注射l 移植受精卵l 鉴定转基因小鼠l 建立转基因小鼠品系2、逆转录病毒法：3、胚胎干细胞法：4、体细胞核移植法： 植物转基因有：1 植物转基因有：1.1 直接转移法：1.2 原生质体转化法多聚物介导法化学刺激法1.3 电穿孔法1.4 基因枪法微粒轰炸法1.5 花粉管通道法1.6 超声波介导转化法1.7 脂质体介导法1.8 激光微束穿孔转化微激光束法1.9 显微注射法2 农杆菌介导的质粒载体转化法2.1 叶盘法转化植物细胞2.2 整体植株接种转化法2.3 原生质体共培养转化法2.4 悬浮细胞共培养转化法3 植物病毒介导感染法1、原生质体转化法；2、基因枪法；3、农杆菌介导法；4、电穿孔法；5、花粉管通道法；6、超声波法；7、植物病毒介导感染。简答题目举例说明基因工程的技术路线。答：分，切，接，转，筛，表。1）分离目的基因和载体；2）切割目的基因和载体；3）将目的基因和载体连接；4）将重组体转入宿主细胞；5）筛选重组克隆；6）表达外源蛋白。1、理想的质粒载体应具备哪些条件？答：1、复制子。2、一个或多个有利于检测的遗传表型。3、一个或多个限制性内切酶的单一识别位点，便于外源基因的插入。4、适当的拷贝数。2、举例说明限制性内切酶的命名原则一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。3、说明Sanger DNA测序法的原理利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。4、基因工程建立的理论基础和技术基础是什么？基因工程建立的理论基础：1、DNA双螺旋的发现。2、遗传密码子。 3、中心法则。 技术基础 ：1、DNA连接酶的发现。2、DNA限制性内切酶的发现。 4、载体的发现。5、简述Southern 印迹杂交的步骤。待分析的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳按照分子量的大小进行分离，凝胶经碱变性处理，将DNA分子变成单链，经毛细管作用或物理方法将凝胶中的单链DNA分子从胶上转移到固相支持物上（一般使用的是尼龙膜和硝酸纤维素膜）。用标记的DNA或RNA探针对附着于膜上的DNA进行杂交来检测被转移的RNA片段，与探针有同源性的DNA片段在膜上的位置可以通过特定的检测方法如放射自显影或显色而显示。主要步骤如下：1 待测核酸样品的制备 制备待测DNA DNA限制酶消化2琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品3电泳凝胶预处理， 4转膜，5探针标记，6预杂交7、Southern杂交将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交8、洗膜 9、放射性自显影检测6、限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响？1、温度。大部分限制性内切核酸酶最适反应温度为37，但也有例外。降低蕞适反应温度，会导致只产生缺口，而不是切断双链DNA。2、盐离子浓度。不同限制性内切酶对盐离子强度（Na离子）有不同的要求，分为低、中、高盐三类。Mg离子也是限制性内切酶酶切反应所需。3、缓冲体系。限制性内切核酸酶要求有稳定的PH环境，这通常由Tris.HCl缓冲体系来完成。保持酶活性和稳定常用DTT。4、反应体积和甘油浓度。在进行酶切反应时，加酶体积一般不超过总体积的十分之一。5、时间。限制性内切酶反应时间通常为1h，但大多数酶活性可维持很长时间，进行大量DNA酶解反应时，一般让酶解过夜。6、DNA的纯度和结构。DNA样品中所含蛋白质、有机溶剂及RNA杂质均会影响酶切的速度和完全程度。7、简述宿主细胞必须具备哪些性能？8、YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性?(1)复制元件，端粒重复序列，自主复制序列，标记基因。(2) YAC 载体主要是用来构建大片段 DNA 文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。YAC 载体功能强大。酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的 DNA 有更强的容忍性。另外， YAC 在功能基因和基因组研究中是一个非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多数是多外显子结构并且有长长的内含子，大型基因组片段可通过 YAC 载体转移到动物或动物细胞系中，进行功能研究。7、简述基因组文库与cDNA文库的区别基因组，即某种生物一个细胞内全部的DNA信息。将这些基因组DNA打断，连接到载体上并转入微生物，使这些微生物细胞内含有某生物的全部基因组。那么这些微生物就组成了基因组文库。因此，基因组文库包含的是遗传信息。对于某种生物来说，任何一个细胞的遗传信息都是相同的。cDNA是由细胞内的mRNA通过逆转录的方式获得的，其包含的一个细胞内的表达信息。多细胞生物的不同细胞的表达信息往往是不同的。若将某