硫脲的作用.doc

1M 硫脲+10mM EDTA+1M 尿素可否用于解决DNA-蛋白质交联？同时含有高浓度的解聚剂尿素和硫脲，两者联合发挥协同作用，增强溶解疏水蛋白质效应.一同使用的时候通常尿素的浓度是5-7M，而硫脲是2M。含有尿素的溶液在操作时一定要注意控制温度，温度过高（37）会造成分解，而温度过低可能造成析出。裂解液7M 尿素 / 2M 硫脲 / 1%(w/v) ASB14（amidosulfobetaine 14） / 0.5%(v/v) Triton X-100 / 30mM DTT / 40mM Tris碱 / 0.5% Biolytes pH3-107M尿素硫脲构成的变性环境已经足以抑制大部分蛋白酶的活性，硫脲对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过如果 您专职做膜蛋白建议采用分级抽提法。用于灭活金属蛋白酶（主要是其鏊合作用）蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）中纯化得到。该酶有两个Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA（以抑制依赖于Mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGT（pH8.0）至终浓度为2mmol/L,以鳌合Ca2+。蛋白酶K，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50100g/ml。在较广的pH范围内（pH 4-12.5）均有活性。推荐反应缓冲液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2。值得注意的是，蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,以增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时,都会对细胞的结构有一定的破坏,导致组织切片的脱落,细胞核的消失,从而影响杂交结果.EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用,解决上述出现的问题,并能达到理想的染色效果.孵育温度为55至65，理想孵育温度为58，孵育时间为15分钟至48小时；理想孵育时间为2小时Marker的相关疑问MM. 我用的是可视marker（BIO_RAD），但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8，10，12，都是这样。marker是新买的。解答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。用80V进行SDS-PAGE电泳，用恒压10V45min转印的。前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。但就是出不来结果，我很茫然。谢谢您过给予指点！ 解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。”有的时候，Prestained Marker 放久了效果就会变差，电泳是条带不清晰，扩散。但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不紧密。转移是多加点甲醇。2、“前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好。3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。”是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性对照？你要做这么大的蛋白最好转移时间延长到1.5hrs。6. 染色的选择OO. Western Blot哪种染色好？解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5g，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。（3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。7. 参照的疑问PP. 是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参？解答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。QQ. 用BANDSCAN分析结果行吗？解答：分析一般的结果没问题。RR. 核内抗原Western Blot内参选择什么合适？解答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。SS. 转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm2，一般1小时左右？解答：不是的， 半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。TT. 做半定量人卵巢癌细胞系的Western Blot，内参B-actin，GAPDH，那个好？解答：选用beta-actin就可以。8. 缓冲液配方的常见问题UU. 转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢？解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。TrisHCl就是Tris盐用HCl调ph值，配置而成。VV. 准备做大鼠脑子的Western Blot，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必须要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？解答：可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。WW. 想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？解答：一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。XX. 最近作了两次Western Blot，不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题。1、检测GAD-分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本-20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是 1:100。如果是一抗的原因，不会背景都没有把？3、第一次有不均匀背景，因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为 0.1%，不会是封闭液的问题吧？解答：可以在下面几个问题上找找原因。1. 封闭液用5Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有问题。YY. 加甲醇的目的是什么？解答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。ZZ. “转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大？解答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl， 0.2g of KCl， and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.AAA. 封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如现在我就在室温里做，或者要在4度下?解答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。BBB. 实验室暂无NP40我用sds可以吗？另外有过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗？配方如下：7M 尿素，2M 硫脲，Triton-x-100 0.2ml，新鲜加入：65mM DTT蛋白酶抑制剂：试剂盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v)是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？改良的RIPA裂解缓冲液(Tris.HCl， 50 mmol/L， pH 7.5; NaCl， 150 mmol/L; NP-40，1%; 脱氧胆酸钠， 0.5%; SDS， 0.1%; EDTA， 1 mmol/L; PMSF， 1 mmol/L; Leupeptin， 2 g/ml)不知对于膜蛋白效果如何？此外该方中的EDTA， 是否用做蛋白酶抑制剂？解答：做绝对不推荐使用（因为即使进口的也不纯，其中的杂质会影响质谱结果）。对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌等），可以不使用cocktail，因为7M尿素硫脲构成的变性环境已经足以抑制大部分蛋白酶的活性，硫脲对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过如果您专职做膜蛋白建议采用分级抽提法。此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。用于灭活金属蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加过多的蛋白酶抑制剂可以导致蛋白质的修饰，做无所谓，做时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲液中少了两性电解质(在2-D裂解缓冲液中，两性电解质起的作用：提供连续的PH梯度，从很大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一部分核酸)；也不推荐采用SDS，因SDS会与蛋白质结合导致其等电点发生改变，如果您实在要用，终浓度降到0.1%以下。CCC. Western Stripping Buffer的配方解答：METHOD11、stripping buffer: 62.5mmol/l Tris PH6.7；100mmol/l beta-mercaptoethanol；2%SDS二次发光protocol:1.stripping buffer洗膜：50度水浴30分钟，摇床上摇10-20分钟。2、1*PBST洗：摇床上摇30分钟。3、封闭，加一抗，二抗（同第一次发光）METHOD2（50ml总量）：?-mercaptoethanol 342 l；20% SDS 5 ml；Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O至 50 ml。方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。该方法的优点：省事，省力，省钱，符合国际惯例。METHOD31、beta-metaptoethanol 35ul 2、10%SDS 1ml 3、tris (0.5M，pH6.7) 625ul 4、dH2O 3.34ml 50-55，30min。浅析双向凝胶电泳的样品制备摘要：对于双向凝胶电泳实验来说最重要的环节就是样品制备，样品的好坏直接关系到整个实验最终的成败。本文将对样品制备进行简要的阐述，并以大肠杆菌细菌为例介绍具体的制备步骤。关键词：双向凝胶电泳；样品制备；大肠杆菌样品制备对于获得理想的结果是至关重要的，但是由于所研究的实验对象不同、采用的技术手段不同、需要达到的目标不同，所以迄今为止并没有一个理想的实验方案能够解决所有问题。由于在目前双向电泳技术仍然是蛋白质组学研究的一个主要技术手段，所以本章将围绕如何制备双向电泳所需要的样品来展开讨论。1 样品制备的原则（1）要注意样品的准确性问题：第一，样本是否处于所需要的状态？例如在研究某种疾病的时候，所要采集的组织是发病的哪个阶段（早期、中期、或者晚期）。第二，采集的样本是否单一？例如在采集肝脏组织的时候是否带有大量血管。（2）要避免蛋白质的丢失：样品制备的操作步骤越少、时间越短越好，这样能有效地减少蛋白质的特异性和非特异性丢失。（3）要避免蛋白质的修饰和降解：使用高质量的试剂，操作尽可能保持低温、快速。（4）样品中的杂质要尽量少：尽可能地除掉脂类、多糖、核酸、盐分等能够对后续实验造成干扰的杂质。2 裂解液在样品制备过程中都需要用裂解液来溶解并提取蛋白质，基本组分有离液剂、表面活性剂、还原剂等物质，一般来说裂解液有以下几方面的作用1：（1）将所有蛋白转化为单一构象。（2）去除氧化步骤。（3）防止蛋白质的沉淀。（4）防止蛋白质的修饰。（5）使疏水蛋白质充分并稳定地溶解。（6）灭活蛋白酶。（7）破坏二硫键和疏水键，充分暴露其内部基团。离液剂高浓度的尿素通过破坏蛋白质的二级和三级结构来使疏水蛋白溶解并防止其蛋白质之间的相互作用，硫脲可以增加一些难溶的疏水蛋白质（如膜蛋白）的溶解。单独使用尿素时浓度至少8M（最高可到9.8M），而硫脲的溶解性不好（通常最高2M），所以在一同使用的时候通常尿素的浓度是5-7M，而硫脲是2M。含有尿素的溶液在操作时一定要注意控制温度，温度过高（37）会造成分解，而温度过低可能造成析出。从加水溶解开始，尿素就会在溶液体系中逐步和氰酸铵达成一定的平衡。在37以下，尿素的水解很缓慢，对于绝大多数的样品制备程序都不会造成影响。异氰酸会与蛋白质的N末端、赖氨酸、精氨酸的氨基以及半胱氨酸的巯基发生氨甲酰化反应，分子量增加43，反应原理见图1。这些反应的速度依赖于pH值，与脂肪族胺反应的最适pH值是8.5-9.5，而与蛋白质N端的氨基反应最适pH值为7左右。如果异氰酸修饰了蛋白质的氨基，那么蛋白质所携带的正电荷减少，在2D图谱上会产生向酸性端的偏移。温度不是很高的情况下，会在原蛋白质点偏酸的位置出现横向成串的点。温度过高时，则蛋白质点会聚集在酸性端。由于分子量只增加43，所 以观察不到纵向上的变化。表面活性剂表面活性剂通过破坏离子键和氢键防止蛋白质通过疏水作用聚集，促进但蛋白质的分散和溶解。最初使用的是非离子型的Triton X-100（质谱对于Triton X-100中的杂质非常敏感）和NP-40，然而由于两性离子表面活性剂CHAPS（通常最高使用浓度4%）可以获得很高的纯度，所以得到了广泛的应用。后来又陆续研制出一系列的新型两性离子表面活性剂，如SB 3-10（由于SB 3-10在尿素溶液中不容易溶解，所以一般要求尿素浓度最高5M）、ASB14、C8等3。阴离子型的SDS有时也会使用，主要是为了防止寡聚体的形成（如血清中的白蛋白）和溶解一些难溶的疏水蛋白。通常最高使用浓度为2%，但是在等电聚焦（IEF）前必须稀释至少20倍以上（即稀释到8时存在一定的缓冲作用，且经常存在角蛋白污染，所以后来经常使用的是巯基型的二硫苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇（DTE）和非巯基型的三正丁基膦（TBP）5。在IEF的时候，由于DTT、DTE会带有负电荷，所以造成流失，不能很好地维持还原的环境。TBP由于不带电荷而被普遍认为是一种较好的替代品。蛋白酶抑制剂细胞中有很多蛋白酶能够对蛋白质进行降解，在破碎细胞的时候尤其严重。虽然添加硫脲也能有效抑制蛋白酶活性6，但是蛋白酶比一般的蛋白更能抵抗变性剂的作用，有些蛋白酶在高浓度的尿素和硫脲存在下仍然可以保持部分活性。使用SDS或者TCA沉淀的时候能够较为彻底地灭活蛋白酶7。不加蛋白酶抑制剂经常会造成高分子量蛋白的丢失，所以制备样品时间较长的情况下（如分级提取）一定要加。有时虽然在提取的过程中降解不严重，但是在IEF过程中会使降解增加8，一般在水化液中加入蛋白酶抑制剂和使用杯上样会解决这一问题。要注意的是目前没有一个特别确保灭活所有蛋白酶的好方法，而且某些蛋白酶抑制剂可能会修饰蛋白1。核酸酶在使用超声破碎制备一些核酸含量不高的样品的时候核酸会被打碎，不用添加核酸酶。但是对于一些核酸含量特别高的样品，经常需要使用核酸酶。核酸酶降解核酸的效率很高，在裂解液体系中，由于核酸呈变性的状态，所以更易于被核酸酶消化掉。尽管核酸酶自身在较短的时间内（约10-15分钟）也会变性，但是对于降解核酸已经足够了9。需要注意的是DNA酶的活性需要镁离子且核酸酶会出现在最终的电泳胶图上。载体两性电解质有些蛋白质的溶解需要一定的离子强度，而载体两性电解质可以增加缓冲能力和离子强度，所以常用于增强蛋白质的溶解性。由于其运动到等电点时变成不带电的状态，所以不会干扰IEF。特定的加到IPG中的载体两性电解质被称作IPG Buffer（通过对一般的载体两性电解质进行改造所获得，优点是不会在银染时造成背景），使用不同的载体两性电解质组合会得到不同的结果，具体的比例需要针对不同样品通过实验进行摸索。一般来说宽pH梯度的载体两性电解质可以用于窄pH梯度的胶条（如pH 3-10的IPG buffer用于pH 4-7的胶条），但是反之则不行1。指示剂指示剂用于判断聚焦是否开始并正常，通常使用溴酚兰，也可以用Orange G代替，少量使用的情况下不会对IEF形成干扰。此外，有文献报道用考马斯亮蓝（CBB R-250，使用浓度0.01%）替代溴酚兰会改善电泳图谱上点的质量，特别是在碱性pH梯度的区域。原因可能是改善了蛋白的溶解性并增强了转二向的效率10。Tris在溶解蛋白的裂解液中经常会加入微量的Tris（通常40mM）来使溶液呈碱性，其作用主要是（1）有些蛋白酶在碱性条件下会被抑制（2）烷基化和二硫键的还原也需要碱性的环境（3）碱性环境下许多蛋白质呈阴离子形式，难于同核酸相结合（4）由于大多数蛋白质的等电点是偏酸性的，所以碱性环境有助于蛋白质的溶解（5）有些蛋白质需要一定的离子强度来增强溶解性。不同样品所需最适pH不一样。需要注意的是在水化上样之后开始IEF的时候，Tris会迅速聚集到一个区域（例如18时在pH8.3附近，与其pKa值有关）形成离子边界，使这一区域的电导升高，此时移动能力不强的碱性蛋白便聚集在这一边界附近而无法移动到正确的位置。杯上样时在阳极端上样也可能出现同样的问题，因为Tris的移动非常快，最终可能会造成蛋白质的沉淀。当然，这一问题的严重程度与样品的性质相关，例如大肠杆菌中碱性蛋白较少，那么Tris的影响就相对较小（20mM时没有明显的影响）11。这个问题可以通过稀释、超滤或者沉淀来解决。精胺在制备样品的时候有时会用到精胺，因为精胺能够与核酸结合形成复合物沉淀，然后可以通过离心去除。此外，由于精胺同核酸的结合，能够释放出一些平时同核酸结合在一起的蛋白9。3 样品的破碎为了提取蛋白质，经常需要将组织或细胞等进行破碎，通常使用的方法有冻融法、酶法和机械破碎法。冻融法效率低，很少采用；酶法破碎比较温和，但是由于效率不高且引入外源蛋白质而很少采用；机械破碎依靠高能量，不会引入其它的化学物质或者酶等，但是有可能造成目的蛋白质的破坏。机械破碎通常是依靠液体的剪切力、细胞内外的压力差以及玻璃珠或者刀片的碰撞力等，具体方法主要有玻璃珠法、匀浆法、压力破碎、超声波破碎等。玻璃珠法操作简便，适用体积范围较大（0.2-50ml），适用于多种样品；匀浆法主要用于处理组织、植物样品等，处理量不能太大；压力破碎常用于处理细菌、细胞及酵母等样品，操作时需要注意蛋白的氧化降解；超声波破碎较为常用，但是容易造成样品的过热。此外，超声还可能会破坏分子簇之间的非共价结合（比如酶复合物），在研究复合物的时候需要引起注意12。4 分级分离由于受到方法学上的限制，双向电泳只能在有限的动态范围内来分析蛋白质。为了降低样品的复杂性并研究那些低丰度蛋白质，通常需要在制备样品的时候采用分级分离的手段。分级分离的手段多种多样，包括多种色谱技术、制备型IEF、超滤、亚细胞分级分离等，可以将蛋白质按照性质不同以及细胞定位的不同等依次分离。常见的例子有利用分别适合于溶解不同亲水性蛋白质的裂解液提取蛋白，利用超速离心等手段收集细胞器，利用亲和层析、免疫共沉淀等去除高丰度蛋白（如血液样本中的白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白等），富集磷酸化蛋白、糖蛋白等。需要注意的是，处理的步骤越多可能造成的问题也越多，例如使用色谱分离的重复性问题、制备型IEF时蛋白质暴露在高浓度尿素溶液中的时间过长的问题，富集特定蛋白质的过程中蛋白质丢失的问题。5 杂质的去除需要去除的杂质通常是指能够对双向电泳造成干扰的一些物质。盐分能够使导电性增加从而影响聚焦；核酸能够影响IEF的酸性端聚焦表现、增加样品的粘度并影响裂解的效果；多糖能够堵塞IEF凝胶的孔隙造成沉淀从而干扰聚焦且增加样品的粘度；酚类物质可以修饰蛋白质并使其溶解性下降；脂类会同蛋白质结合形成不溶的复合物13。常用的去除杂质并浓缩样品的方法有透析、超滤、沉淀以及凝胶过滤等。透析法操作时间长、难于自动化、操作体积大、需要再浓缩，可能会造成蛋白的降解或丢失，所以较少采用。超滤法可去除高分子量的多糖和盐，问题是在蛋白浓缩的同时一些高分子量的杂质也会被浓缩。当不存在同所需蛋白质无法区分的杂质且样品浓度过稀的时候可以选择超滤这一手段，但是要注意选用同蛋白质结合能力很低的滤膜14。沉淀法有硫酸铵沉淀、三氯乙酸（TCA）沉淀等，由于TCA沉淀能够有效地去除杂质，所以得到了普遍的应用，其缺点是不可逆变性和蛋白质重溶解困难。TCA沉淀曲线是U型的，在很低浓度（大于5%）和很高浓度（大于50%）的时候蛋白质都倾向于溶解，所以在15-40%的浓度能够沉淀绝大多数的蛋白。 一般来说TCA/丙酮沉淀比单独使用TCA或丙酮的效果好，但是沉淀的蛋白质重新溶解的时候要比丙酮沉淀困难一些，此外要注意，TCA沉淀可能会造成酸诱导的蛋白水解15。6 实验方案举例A：大肠杆菌全菌体蛋白样品的制备（1）取100ml菌液，5000g离心10min，弃上清。（2）低盐清洗缓冲液(3 mM KCl, 1.5mM KH2PO4, 68mM NaCl, 9 mM NaH2PO4)洗菌体三次，每次20ml。离心条件同上，最后残余的液体应尽量用Tip头（或者干净的滤纸条）吸尽。（3）用1.5ml纯水重悬菌体并转入10ml烧杯中。加入2.1g尿素，0.2g CHAPS，0.762g 硫脲和38.5mg DTT（终浓度分别为7M、4%、2M和50mM），加入全效蛋白酶抑制剂1片，轻轻吹打使之完全溶解后定容至终体积为5ml。（4）冰浴超声