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新城疫病毒致病机理的分子基础及研究进展 文献综述 报告人 强喆 Page 2 新城疫病毒致病机理的分子基础及研究进展 内容提要 Page 3 一 引言 新城疫概述 概念 新城疫 newcastledisease ND 是由新城疫病毒引起禽的一 历史与分布 本病于1926年首次发现与印度尼西亚 同年发现于英国新城 Doyle 1927 首次证实该病由病毒引起 病原与鸡瘟病原 禽流感病毒 不同 为了有别于鸡瘟 故以地名而命名为鸡新城疫 此后本病迅速向世界各地传播 急性 热性 败血性和高度接触性传染病 以高热 呼吸困难 下痢 神经紊乱 黏膜和浆膜出血为特征 具有很高的发病率和病死率 是危害养禽业的一种主要传染病 1 我国新城疫的报道最早见于1935年河南 梁英 马闻天等 1946 经病原分离证实为新城疫 50年代末于全国范围内流行 虽然已经广泛接种疫苗预防 但该病仍不时在养禽业中造成巨大的损失 是最主要和最危险的禽病之一 2 Page 4 一 引言 新城疫概述 流行病学 本病不受季节的影响 一年四季均可发生 但以冬春两季多发 临床症状 潜伏期短 2 5天 可分为四型 最急性 突然发病 急性死亡 无明显症状 多见于流行初期 急性型 最常见 发病数量最多 有典型症状和发病过程 死亡率90 以上 慢性型 一神经症状为主 多见于流行后期 死亡率低 慢性消瘦 生产力下降 发病急 传播快 非免疫鸡群发病率和死亡率均极高 达90 免疫力不强的鸡群常呈温和型 非典型 亚临床型 ND 非典型新城疫 症状及病变不典型 主要原因为 母源抗体的干扰 Page 5 分子流行病学 曹殿军等人将68株NDV分为九个基因型 根据NDV毒株F基因的序列 特定的酶切图谱和F蛋白可变区氨基酸残基变的化 其中 老基因型 为新发现的基因型 特别是 为我国特有的基因型 4 基因IV型最早分离自欧洲 造成了NDV第一次世界性大流行 十九世纪六十年代第二次大流行出现了基因V型和 型 随后 基因Vl型NDV表现出对鸽的致病力 造成了第三次大流行 90年代在欧 亚流行的新城疫 分子流行病学上发生了很大变化 呈现以基因 型为主的新趋势 被认为是第四次大流行 一 引言 致病性的分子基础概述 病原分类 新城疫病毒 也称禽副黏病毒I型 国际病毒分类学委员会ICTV2002年发布的报告 将新城疫病毒正式列为单股负链病毒目 副黏病毒科 副黏病毒亚科 新城疫样病毒属中的成员 NDV为其模式种 3 禽副黏病毒 APMV 有9个血清型 即APMV 1至APMV9 NDV是APMV 1 Page 6 一 引言 致病性的分子基础概述 红细胞凝集特性 新城疫病毒表面具有血凝素 所有毒株都能凝集多种禽 抗原性与毒力 NDV只有一个血清型 其HN和F蛋白是重要的保护性抗原 5 世界各地的NDV分离株的分析结果表明 HN和F基因序列的某些位点发生了变化 致使毒株间的毒力有了较大的差异 抗原性也有差异 但其主要的抗原表位并没有发生变化 尚未发现有重大抗原性差异 所有的新城疫病毒仍属于同一血清型 类和哺乳类动物的红细胞 在病毒的血凝试验中 鸡的红细胞最为常用 马和猪的红细胞则不被凝集 病毒和红细胞的结合不是永久性的 一段时间后 在病毒表面神经氨酸酶的作用下 病毒与红细胞分离后又重新悬于液体 这种凝集能力可被抗新城疫血清所抑制 且这种抑制具有特异性 可进行病毒鉴定和诊断 还可以测定疫苗的免疫效果 进行流行病学报告 2 Page 7 二 病原及基因组详述 病毒粒子的形态与结构 NDV基因组的结构 NDV基因组的复制机制 Page 8 二 详述 病毒粒子的形态与结构 病毒粒子的形态与结构 新城疫病毒颗粒具多形性 有圆形 椭圆形和长杆状等 包膜为双层结构膜 由宿主细胞外膜的脂类与病毒糖蛋白结合衍生而来 完整的新城疫病毒为有囊膜的近似球形的颗粒 直径一般为100 400nm 病毒囊膜表面覆盖有8nm长的纤突 病毒粒子内部为一直径约17nm的卷曲的核衣壳 所有的NDV都含有6种病毒特异性结构蛋白 L NP P HN F M 和2种非结构蛋白V和W蛋白 L蛋白 大蛋白 是RNA依赖性RNA聚合酶 与核衣壳相连 NP 核蛋白 Mr为5 6X10 是构成核衣壳的主要成分 Page 9 二 详述 病毒粒子的形态与结构 病毒粒子的形态与结构 P蛋白 磷蛋白 Mr为3 9X10 M蛋白 基质蛋白 Mr为3 9X10 位于囊膜的内层 在RNA的合成和病毒的自身装配上起重要的作用 HN 血凝素 神经氨酸酶蛋白 Mr为6 3X10 它使病毒体吸附于细胞表面的唾液酸脂质受体 即神经节苷脂 并通过血凝素和神经氨酸酶两种生物活性破坏这种受体的功能 使释放的病毒不能再吸附到细胞上 F蛋白则参与病毒的穿入 细胞融合 溶血等过程 蛋白V和W蛋白由P蛋白基因经RNA编辑 从移码了的阅读框翻译出 前者主要抑制宿主细胞干扰素的产生 有利于病毒复制 后者的功能目前还不是很清楚 具体文献来源不详 Page 10 病毒粒子结构电镜图 二 详述 病毒粒子的形态与结构 Page 11 病毒粒子整体示意图 二 详述 病毒粒子的形态与结构 Page 12 病毒粒子蛋白位置示意图 二 详述 病毒粒子的形态与结构 Page 13 二 详述 病毒基因组结构 病毒基因组结构 新城疫病毒基因组是大小为15kb的单链负股RNA 现在已测序的十几个毒株的全基因组大小均为15156个 15186个或15192个核苷酸 都是6核苷酸的倍数 符合某些副黏病毒的 6倍律 即仅当基因组核苷酸长度为6的倍数时 RNA才能有效复制 这可能与NP蛋白正好能覆盖6个核苷酸有关 具体文献来源不详 病毒基因组的顺序为 3 Leader NP P M F HN L trailer 5 基因组RNA两端还有顺反子外片段 3 端为前导序列 1eader 47 57个nt 5 端为尾随序列 trailer 这些区域是病毒复制所必需的 Page 14 二 详述 病毒的复制 病毒复制策略与机制 一般而言 某种病毒采取何种复制和表达策略 主要取决于其遗传物质的性质和病毒基因组转化为病毒mRNA的途径 据此 Baltimore 6 首次将病毒的复制方式分为六组 后来又增添了以嗜肝DNA病毒和花椰菜叶病毒为代表的 组 单股负链RNA病毒复制 特点 单股负链RNA进入寄主细胞内后不能直接作为mRNA 而是先以负链RNA为模板由转录酶 何种转录酶不详 转录出与负链RNA互补的RNA 再以这个互补的RNA作为mRNA翻译出遗传密码所决定的蛋白质 这是其与正链RNA病毒所不同之处 NDV病毒的复制机制 NDV病毒在单股负链RNA病毒里属于不分节段的RNA病毒 其复制机制与负链分节段RNA病毒有不同 NDV的基因组非常高效 约95 用来编码病毒结构蛋白 基因和基因间有1个 47个核苷酸不等的基因间片段 Page 15 二 详述 病毒的复制 NDV复制机制示意 螺旋状的核衣壳是RNA复制的模板 核衣壳蛋白 NP 与基因组RNA共同组成了核心结构 磷蛋白 P 和大蛋白 L 附着在核心结构上 共同组成了RNP或转录复制复合物 HN蛋白参与宿主细胞的吸附 融合F蛋白通过与细胞膜的融合侵入宿主细胞 再与吞噬小体膜融合 进而将核衣壳释放到细胞质 转录从3 端的启动子开始 当RNA聚合酶无法识别末端型号 转录过程转为复制过程 复制出全长正链RNA 再以之为模板复制出完整负链病毒RNA分子 7 依次转录出先导RNA序列和相应编码的蛋白 由于只有一个启动子 每个基因结合处有暂停的弱化效应 原因不详 合成量按照转录顺序递减 Page 16 二 详述 病毒的复制 复制的关键因素 RNP 就负链RNA病毒而言 能否形成RNPs结构是NDV复制增殖的关键所在 其具有功能活性的最小单位为RNP复合结构 该结构由病毒的基因组RNA与核衣壳蛋白 NP 磷蛋白 P 和聚合酶蛋白 L 共同组成 在NDV的复制过程 首先进行的是各种基因的转录 病毒RNA聚合酶以核衣壳化的RNA RNPs 为模板 先与基因组RNA的3 端Leader序列中的单一进入位点结合 转录出一个短的LeaderRNA 然后利用病毒基因组各基因两端存在的各种转录起始及终止信号转录出各种病毒mRNA 该转录过程是在线性的基因组上 通过转录复合体的移动 并与位于基因组上的NP蛋白相互作用 按每一个基因的起始及终止位置不断转录 然后 ssRNA与各种翻译出的病毒蛋白装配生成子代病毒粒子 此对于建立负链RNA病毒的拯救具有理论指导意义 即共转染 8 Page 17 三 NDV致病性的分子基础详述 概述 F蛋白的功能 HN蛋白的功能 F与HN的相互作用 Page 18 三 NDV致病性的分子基础 概述 F蛋白破坏细胞诱导融合 感染及病毒血症 HN 相关蛋白 促进F的融合作用 致病机理的分子基础 合成的病毒蛋白被转运到细胞膜 将细胞膜修饰 在修饰区附近组装成核衣壳 进一步出芽使病毒释出 病毒血症使病毒传遍家禽各种脏器 通过溶血 合胞体形成和细胞破坏 引起严重的组织损伤 甚至发生普遍的出血性病变 导致家禽死亡 F蛋白具有使病毒囊膜与宿主细胞膜融合 进而使病毒核衣壳释入胞浆中的作用 F蛋白基因编码一个553个氨基酸的多肽 F蛋白首先以非活性前体FO的形式存在 经裂解形成Fl和F2后 使病毒具有感染性 HN蛋白识别细胞上的受体位点并与之结合 使自身构象发生变化 进而触发F蛋白构象发生变化 F蛋白构象改变后 其内部的融合多肽释放出来 发挥穿膜作用 引起病毒囊膜与细胞膜的融合 Page 19 三 NDV致病性的分子基础 F蛋白的功能 F蛋白 核苷酸序列分析表明 F蛋白基因编码一个553个氨基酸的多肽 F蛋白首先以非活性前体F0的形式存在 此时无融合活性 当其运输至高尔基体经裂解形成由二硫键连接的Fl和F2后 才能使病毒具有感染性 这种翻译后的裂解过程是由宿主细胞的蛋白酶完成的 如果F0不能被裂解 包装成的病毒颗粒就是非感染性病毒颗粒 胰蛋白酶能裂解所有的NDV毒株 非感染性病毒经胰蛋白酶体外处理后可恢复感染性 所有病毒在鸡胚体内都能复制并产生感染性后代 在体外 无论是否添加胰蛋白酶 强毒株都可在多种细胞类型中复制 而低毒力毒株则仅在添加胰蛋白酶时才能在细胞中有效复制 而胰岛素可以裂解所有新城疫病毒F0 此部分未见详细文献 由此可见 强毒F0分子能被多种细胞或组织中存在的一种或多种蛋白酶所裂解 而弱毒F0分子 仅能在某些特殊宿主细胞类型中生长 其敏感性受限 Page 20 三 NDV致病性的分子基础 F蛋白的功能 F蛋白 Reitter等为了研究F1的HR区的变异对 蛋白生物活性的影响 把481 488 495处的亮氨酸依次被丙氨酸代替 结果发现单个氨基酸的改变对细胞融合影响较小 而 到 个亮氨酸的改变就取消了F蛋白融合特性 但不影响细胞的跨细胞转运用及蛋白的低糖基化 保守亮氨酸在细胞融合中是必要的 但不是形成糖基化分子所必要的 用丙氨酸代替F1下游丝氨酸 473 丙氨 482 天门冬氨酸 489 改变F1螺旋体非保守区 变异F1蛋白的融合能力没有较大改变 这说明HR保守区具有与细胞膜相接触和促进细胞融合的作用 9 但是 SV HPV3以及麻疹病毒的 蛋白单独作用也可以诱发细胞融合 详细文献尚未查到 Page 21 疏水亚单位F2 疏水亚单位F1 F0蛋白的裂解 对鸡有致病力的绝大多数新城疫病毒F1蛋白N 端117残基有F 苯基丙氨酸 具有嵌入宿主细胞的融合机能 对鸡有致病力的绝大多数新城疫病毒在F2蛋白C 端有112R K R Q K R R116序列 三 NDV致病性的分子基础 F蛋白的功能 F0蛋白无活性 宿主细胞蛋白酶裂解成F1和F2后方能发挥 F0蛋白中F1 F2片段的排列顺序为NH2 F2 Ph F1 COOH 这是副黏病毒的共同特征 F0的裂解特性由第112 217位氨基酸的性质决定 裂解酶切位点距离氨基端100个氨基酸 如何确定的未见具体文献 Page 22 三 NDV致病性的分子基础 HN蛋白的功能 HN蛋白 HN纤突可分为根部 胞质区 跨膜区和胞外域 胞外域又分为两个部分 靠近膜端的茎部和纤突末端的球状体 HN蛋白在融合过程中能够识别和结合细胞受体 HN蛋白和 蛋白的穗部相互作用 诱导细胞融合 HN蛋白的球状结构的穗部具有识别细胞受体和促进细胞融合的功能 在HN蛋白氨基酸序列中 从L95到L110这段序列组成一个亮氨酸拉链 它涉及HN的促融合活性 Sergel等成功地从HN蛋白的HA活性中分离出促融合活性 如果去掉HN蛋白茎部的91 99氨基酸残基 其促融合作用就大大消失 MeGinnes等通过对HN上的部分氨基酸残基定点突变研究表明 如果用 个丙氨酸代替84 96 97位的亮氨酸残基 突变蛋白有完整的神经氨酸酶活性和HA活性 但促融合活性消失 这证明促融合活性与其神经氨酸酶活性水平无关 Page 23 三 NDV致病性的分子基础 F与HN的相互作用 二者的相互作用 F0蛋白的裂解 HN蛋白的头部 HN茎区与F蛋白 置换HN基因 同时置换HN和F 不同的表达载体和宿主细胞 单独表达NDV的F蛋白的细胞没有融合现象 必须在同一个细胞表达F蛋白和HN蛋白才能引起细胞融合 其分子生物学为 两种糖蛋白形成一种复合物 HN与受体结合之后 复合物结构发生变化 F蛋白插入靶细胞 诱导细胞融合 结构不详 对鸡有致病性病毒的F0分子可以被宿主蛋白酶或者广泛存在于宿其它细胞和组织中的蛋白酶裂解但是低毒力病毒F0分子在一些宿中蛋白酶裂解受到限制 进而生长受到限制 具体文献出处不详 HN头部具有血凝素和神经氨酸酶活性 在病毒侵染过程中识别受体 介导病毒吸附细胞膜以及子代病毒粒子的解离 对NDV毒力强弱具有很重要的影响 10 2004年Melanson等发现HN蛋白茎区F蛋白特异的氨基酸对F蛋白融合活性至关重要 11 Huang等试验证明HN基因嵌合型病毒的致病力和组织侵嗜性变化取决于供体株的毒力 12 王永等人以HN F双基因替换LaSota株 证实其融合能力在单基因置换的基础上再次提升 13 Page 24 三 NDV致病性的分子基础 其他蛋白与HN F P蛋白 抑制核衣壳的非法组装 即将非病毒的基因组组装如核衣壳 M蛋白 可以抑制宿主细胞基因的转录和翻译 破坏宿主细胞的骨架结构 参与病毒的组装和复制 V蛋白 有研究显示 其是重要的毒力因子 与致病性密切相关 NP蛋白 具有自动组装的特性 与病毒基因组RNA紧密结合 难以去除 从而使RNA具有转录活性 L蛋白 将宿主细胞mRNA上的5 端帽子结构切下来 作为病毒基因转录的引物 因为帽子结构具有优先翻译的特点 可再早期大量翻译蛋白 P L NP三者共同组成RNPs 二者共同作用 在病毒感染和细胞融合方面起作用 P蛋白 H和F蛋白 L蛋白 NP蛋白 VW蛋白 Page 25 三 NDV致病性的分子基础 HN和F结合的特异性 2004年Huang等人证明HN嵌合型病毒致病力和组织侵嗜性变化取决于HN供体株的能力 Theresa等人的研究提示 HN和F促融合具有特异性 异源HN不能促进F的融合作用 HN对NDV致病力的影响 2007年 Estevez等人研究表明 经反向遗传手段拯救的重组嵌合型病毒 毒力并无明显增强 14 王永等人的研究提示 异源的HN和F的配对并不影响其发挥正常的生物功能 Page 26 四 HN功能的研究 概述 反向遗传技术 遗传及变异性 保守序列的功能研究 Page 27 四 HN功能的研究 概述 概述 血凝素 神经氨酸酶 HN 是NDV的致病基础和主要宿主保护性抗原 也是与细胞融合密切相关的糖蛋白 既表达黏附蛋白又表达F蛋白的感染细胞能够融合邻近的细胞形成多核细胞或称核胞体 HN蛋白和F蛋白对于细胞融合来说都是必需的 NDV基因组全长序列的测定导致该病毒反向遗传学的诞生 为基因组各基因结构和功能研究以及新疫苗的研制开辟了新的道路 其作为一种研究手段 主要开展以下几种工作 构建疫苗株 开展病毒各基因及序列的功能研究 进行外源基因的表达 基因治疗 四 HN功能的研究 反向遗传的技术路线 反向遗传系统的建立 基础 建立感染性cDNA克隆 前提 获得忠实性全长cDNA序列 同时 需获得基因组末端的精确结构 NDV NDV属单股负链不分节段得RNA病毒 其病毒RNA单独不具有感染性 RNA聚合酶识别RNP RNP由基因组RNA NP P L组成 拯救NDV需四种重组质粒共转染 技术发展 Peeters 1999 拯救出Lasota株 15 突变F0裂解位点 证明其为毒力决定因素 Mebat拯救出P基因编辑位点一个碱基突变的NDVP1可做鸡胚免疫疫苗株 16 Nakaya等将流感HA插入P基因5 端 终止序列之前非编码区证实为安全疫苗株 NDV的cDNA 先分段扩增再拼接 上游引入T7RNA酶启动子核心序列 启动子与病毒基因组之间插入3个G 下游加入具有自我剪切的丁肝核酶 RBZ 部分序列 Page 29 四 HN功能的研究 遗传及变异性 国内NDV分离毒大多具有五个糖基化位点 国内分离毒的遗传距离较近 与Lasota和F48E9强毒遗传距离较大 16 国内十个野生株HN核苷酸同源率94 8 100 与Lasota株同源率较低 为80 左右 17 NDV遗传 HN抗原性已发生变化 NDV变异 Page 30 四 HN功能的研究 遗传及变异性 国内NDV的HN基因高度同源 但与疫苗株同源性已较大 说明其抗原性可能已发生变化 今年来高抗体水平均度较好的鸡群NDV呈现发病较多的趋势 国内外不同地方和不同地区的情况也有差异 同一个地区 基因型相同则同源性较高 反之则较低 呈现出地域性的差异 实质上 任何生物种群的基因均是在进化压力下不断发展变化的 以蛋白为例 基因编码蛋白 其三级结构在其整体的生物活性的发挥上占有重要地位 而三级结构是在进化压力下反作用于基因 进而促进一级结构的筛选与变化 而基因本身就具有变化发展的特性 中性学说 Page 31 四 HN功能的研究 保守序列功能的研究 遗传稳定性的变化 难以稳定遗传或增殖 则此变异病毒不具有作为载体或疫苗株的价值 若上述二者均无变化 则以此为固定的序列 可载入药物或作为其他治疗手段的目的基因 保守序列在生物基因中占有关键的作用 如若变化 有可能引起HN丧失活性或者病毒的死亡 保守序列变化的可能结果 变异性增强 由于RNA聚合酶缺乏对核酸校正的功能 其相比DNA病毒变异率更高 改变其序列 很可能导致其在选择压力下突变性进一步增强 若对于保守序列变化之后未导致生物死亡 则有可能影响其遗传稳定性和变异性 Page 32 四 HN功能的研究 保守序列功能的研究 随着NDV变异及引起其宿主范围不断扩大 个案已经在某种程度上不能全面的体现病毒作为一个物种的发展趋势 如 扬州大学王永坤等人报道 从鹅分离到的对鹅有高致病性的YG97株NDV 型 与我国经典NDV强毒株F48E9 基因 型 在交叉HI中有明显差异 而且在交互免疫保护免疫中 都是来自及鸡的NDV强毒蛋属于不同基因型的株间差别也很大 如在用基因 型的鸡NDV的Y98和T99株攻毒时 只有用Y98和T99株制备的灭活苗才又96 98 的保护率 而用F48E9或Lasota制备的灭活苗只能提供10 的保护率或者完全没有免疫保护作用 然而 哈尔滨兽研所曹殿军等报道 在分别用我国经典的F48E9于最近分离的 型DY和CH株NDV强毒间表现100 的交叉保护作用 一点思考 Page 33 四 HN功能的研究 保守序列功能的研究 病毒作为一个物种 其在感染过程中 要不断的克服不同细胞 不同宿主 不同免疫反应及不同环境给予的压力 从而在选择压力下 不断变异 朝着有利于自己生存的方向发展 从而最终病毒群体和宿主形成群体动力学的平衡状态 因此 无论是对个别毒株进行变异研究 还是对个别基因型进行变异研究 都要考虑到在整体环境下病毒的发展与变化 在一定的基数的保证下 进行自然突变体的相关筛选 包括宿主 以期能在其变异的条件下 找到弱毒株 或者免疫性强的宿主 从而在整体上控制其致病性的发展及宿主范围的扩大 在选择压力下 NDV所有的蛋白都在发生变异 18 但是 相对于受选择压力较小的NP蛋白 仍然和囊膜蛋白H和F变异的速率大致相同 所以 其也具有大量的自然变异 此基于基因的中性漂变原理 一点思考 Page 34 四 HN功能的研究 保守序列功能的研究 病毒感染与宿主群体相互进化 最终会达到对等的模式 而其表型的变异基本是在其完成一次流行之后完成的 那么 是否可以从两个相反的方向考虑这个问题 一 找到其未变异的 或者对于其生存不可改变的蛋白 针对此进行免疫治疗 或者以生物手段将其控制在一定的范围 二 在其完成一次大流行之后 找到在选择压力下变异的宿主 针对其特殊的防御机制 扩大此种基因型 以达到控制病毒感染的目的 三 特别是在病毒感染的早期 相互作用的压力下 在病毒和机体免疫系统之间相反方向的变异最为明显 如 Anna M G等对HIV在猕猴上的研究 此基于病毒感染的进化意义 一点思考 Page 35 说明 由于篇幅有限 时间仓促 大量相关文献未能及时查阅 相关方面的问题未能阐述 现列举如下 1 RNA聚合酶系统的选择 依据具体病毒的拯救策略 建立稳定表达的相关聚合酶系统的细胞系例如T7聚合酶系统 或者在5 加丁型肝炎病毒核酶 3 加入锤头状核酶 以期获得精确末端 2 载体选择和全长cDNA分子拼接策略3 对拯救的病毒在复制 表达 遗传和变异方面的讨论4 对拯救的病毒生物学特性 毒力检测等方面的讨论 如 稳定期病毒效价和潜伏期病毒效价 5 细胞内免疫系统和蛋白翻译系统对新变异的病毒干扰作用方面 如宿主细胞对于新的变异病毒的抑制方面 以及互相在新的作用条件下的共同进化选择 6 新变异病毒的逃逸机制的变化讨论7 发卡结构RNA对病毒增殖的干扰 未详细了解 谢谢 Page 37 参考文献 参考文献 1 崔治中 我国家禽新城疫流行现状 J 中国家禽 2002年第24卷第四期 2 马闻天 鸡新城疫 J 中国兽医杂志 1982年06期 3 http www ncbi nlm nih gov ICTV 4 曹殿军 郭鑫 梁荣等 第四届中国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集 C 2001年 5 李崇华 鸡新城疫的病型及禽副粘病毒的血清型 J 中国兽医科技 1989年03期 6 BaltimoreD Expressionofanimalvirusgenomes BacteriolRev 1971 35 3 235 241 7 FuZ Rabiesandrabiesresearch past presentandfuture Vaccine 1997 15 S20 24 Page 38 参考文献 参考文献 8 SchnellMJ MebatsionT ConzelmannKK InfectiousrabiesvirusesfromclonedcDNA EMBOJ 1994 13 4195 4203 9 JNReitter TSergel andTGMorrisonJ Virol October199569 5995 6004 10 AldousEW AlexanderDJ Detectionanddifferentiat