植入前遗传学诊断.ppt

植入前遗传学诊断新进展preimplantationgeneticdiagnosis PGD slatestprogress 主讲 吴振楠2009041101组员 王芳 吴明瑶 PGD的定义 应用及分类 植入前遗传学诊断 preimplantationgeneticdiagnosis PGD 是辅助生殖技术与遗传学诊断技术相结合的一种植入前诊断技术 为遗传病高危夫妇提供尽可能大的选择范围 把对某些疾病发现和诊断的时机提前到胚胎发育的最早阶段 阻断一些单基因疾病及染色体异常疾病的发生是辅助生殖技术的一个重要方面 PGD的常规方法目前应用于PGD的常规方法有聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 和荧光原位杂交 fluorescenceinsituhybridization FISH 常用的PCR类型有巢式PCR 多重PCR 荧光PCR 荧光定量PCR等 PCR扩增后 用于后续基因诊断的方法主要有 根据特异性目的条带的有无做出诊断 主要用于由基因缺失而引起的疾病的诊断 多态性分析 即在致病基因附近寻找几个与其紧密连锁的DNA多态性位点 通过连锁分析进行诊断和携带者检测 等位基因寡核苷酸特异探针 allele specificoligonucleotide ASO 斑点杂交及反向斑点杂交 reversedotblot RDB 单链构象多态性 single strandconformationpolymorphismanalysis SSCP 及变性梯度凝胶电泳 denaturinggradientgelelectrophoresis DGGE 等 FISH是用带有荧光标记的特异性探针与染色体结合后 在荧光显微镜下观察特定染色体的情况 常用于PGD的FISH探针有染色体记数探针 CEP 染色体特异单一序列探针 CSI 等 针对不同的需要可以选用不同的探针 除了上述方法外 一些新方法 新技术不断出现并应用到临床PGD中 一 微阵列比较基因组杂交二 微测序技术三 多重置换扩增 一 微阵列比较基因组杂交 微阵列比较基因组杂交 comparativegenomiehybridization CGH CGH原理是提取待测与对照基因组DNA 标记不同荧光后以1 1的比例混合 与正常人中期染色体杂交 根据荧光的不同判定待检测基因组中对应序列拷贝数的改变 CGH可检测出一些不常见的异常 如5号与9号染色体三体 其发生率在l000次自然流产中不足1 这也间接说明 一些未被识别的非整倍体异常同样对胚胎的发育具有致死性 CGH在PGD的应用有两种方式 单卵裂球CGH和第一极体CGH 因CGH需要3 4d才能出结果 考虑到体外受精治疗周期中的移植窗口期限制 拟施行CGH的卵裂球在活检后就需要对胚胎进行冻存 因此冻融后胚胎存活数目的下降是目前单卵裂球CGH的主要缺陷 缺点 而第一极体在胞浆内配子注射后取出 即当日 这样便有足够时间等待CGH结果以挑选正常卵母细胞受精的胚胎 这种对卵母细胞间接的细胞遗传学分析 可检出在减数分裂I期分离过程异常造成的非整倍体 如三倍体或单倍体等 这也正是造成早期流产的主要原因 第一极体CGH虽然避免了胚胎冻融 优点 但对第一极体的检测不能检测卵母细胞减数分裂 期及精源性异常 此外 第一极体CGH不能检测出嵌合性胚胎 但通过对第二极体的检测则能部分弥补这点缺陷 缺点 二 微测序技术 微测序技术 又称为单核苷酸引物延伸法 singlenucleotideprimerextension SnuPE 是一种有多种用途的新技术 已经广泛应用于法医学 人口遗传学等领域 其原理是设计一对针对突变位点的特异性引物 退火后直接结合于突变位点附近 同时加入与野生型及突变型模板互补的一种荧光双脱氧核苷酸 分别用不同的颜色标记4种双脱氧核苷酸 经过多轮的延伸与链终止过程 产生许多带有荧光标记的核苷酸片段 经毛细管电泳从而实现对模板序列的推导 微测序技术具有快速 敏感的特点 结合毛细管电泳技术可以一次实现对多个突变位点的检测而实现高通量分析 微测序技术开始主要用于检测单核苷酸多态性 singlenucleotidepolymorphism SNP 的突变位点 三 多重置换扩增 多重置换扩增 multipledisplacementamplification MDA MDA是一种基于酶促反应而不依赖热循环的DNA体外等温扩增技术 可用于质粒 细菌人工染色体 bacterialartificialchromosome BAC 及全基因组DNA的扩增 认为用MDA进行全基因组扩增 wholegenomeamplification WGA 是当前效率最高的全基因组扩增方法 基因组中不同位置的各个位点都能通过MDA实现相似的扩增效率 Hellani等报道首例应用MDA诊断地中海贫血及囊眭纤维化的PGD 后来用于其他疾病的报道逐渐增多 如Marfan综合征等 MDA的缺陷有嵌合性DNA重排 包括序列倒位 序列重新拼结等 用于PGD时 MDA的主要缺点是等位基因脱手13 alleledropout ADO 不同位点的ADO大致在13 36 左右 虽然ADO发生率较高 但误诊的风险仅为0 02 这是因为在同时分析多个诊断性相关的位点的情况下 即使MDA有较高的ADO率 但不可能同时干扰所有的诊断位点 从而保证其有较低的误诊率 PGD的安全性 PGD是建立在IVF 体外受精 基础上的一项技术 除了常规的体外操作外 胚胎还受到在配子或胚胎时期取材所受的机械或化学刺激 以及胚胎时期取材导致的胚胎物质减少等方面的影响 表观遗传学的研究表明 遗传印迹的甲基化等表遗传修饰主要发生于配子发育和种植前阶段 而此期正是体外操作阶段 会干扰基因组印迹的建立与维持 从而造成表观遗传学疾病 Nekkebroeck等比较PGD IVF和自然妊娠 naturalconception NC 的单胎出生儿童2岁时在心理行为 运动发育方面的状况 结果显示 PGD出生的儿童与IVF或NC出生的儿童在上述方面无差异 PGD对其无影响 后续研究又比较三者在情感 语言习以及孩子父母在社会压力 健康状况等方面的情况 三者间也无显著差异 THANKYOUFORLISTENLING IVF invitrofertilization 试管婴儿 体外受精 又称试管婴儿 是指分别将卵子与精子取出后 置于试管内使其受精 再将胚胎前体 受精卵移植回母体子宫内发育成胎儿 试管婴儿是用人工方法让卵子和精子在体外受精并进行早期胚胎发育 然后移植到母体子宫内发育而诞生的婴儿 一例试管婴儿 退火 annealing 两条单链多核苷酸通过互补碱基之间的氢键形成双链分子的过程 可发生在同一来源或不同来源核酸链之间 可以形成双链DNA分子 双链RNA或DNA RNA杂交分子 地中海贫血 Thalassemia 是一组遗传性溶血性贫血 其共同特点是由于珠蛋白基因的缺