电化学发光免疫分析.doc

电化学发光免疫分析谢闻悦广州军区广州总医院一、发光免疫分析发光免疫分析（Luminescence immunoassay,LIA）是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫（RIA）和酶免疫分析法（EIA）相似均是利用抗原抗体间的特异性结合来检测待测物质，不同之处是发光免疫分析以发光物质代替核素和酶作为标记物，并藉助其自身的发光强度直接进行测定。二发光免疫分析的类型1.化学发光免疫分析 某些物质在进行化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应产物分子激发到电子激发态。当电子从激发态能级回到基态时产生辐射，多余的能量以光子的形式释放出来，这一现象称为化学发光（ChemiLuminescence CL）。以化学发光物质（如鲁米诺丫啶酯）标记抗原或抗体，免疫反应后，直接引发化学发光反应进行检测。2.化学发光酶免疫分析 用参与某一发光反应的酶来标记抗原或抗体，免疫反应后，加入发光试剂，测定发光体系的发光强度进行抗原或抗体测定。3.生物发光免疫分析利用生物发光物质或参与生物发光反应的辅助因子（如NADATP等）标记抗原或抗体。免疫反应后，利用生物发光反应进行检测。三电化学发光免疫测定(electro-chemiluminescence immunoassay ECLIA)1990年，Leland等人首次将化学发光中使用的三丙胺(TPA)与发光化合物三联吡啶钌Ru(bpy)32+组合，建立的属氧化-还原类型的ECL反应系统。是继放射免疫酶免疫荧光免疫化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物。其原理与一般的化学发光不同，是在电极表面由电化学引发的特异性化学发光发应，实际包括电化学和化学发光两个过程。其差异在于ECL是电启动发光发应，而CL是通过化合物简单混合启动的发光反应，因此，ECL反应更易精确控制，更具有灵活性。（一）ECL反应原理1 电子供体TPA和发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+在阳极表面可同时失去一个电子发生氧化反应，二价的Ru(bpy)32+ 被氧化成三价是一种强氧化剂；TPA变成阳离子自由基TPA+* ,后者不稳定可自发失去一个质子(H+),形成自由基TPA*，是一种强还原剂。2 还原剂TPA*将一个电子递给氧化剂Ru(bpy)33+，形成激发态的Ru(bpy)32+*，TPA本身被氧化成二丙胺和丙醛，能量来源于Ru(bpy)32+* 和TPA*之间存在的高电化学电位差。3 激发态的Ru(bpy)32+*通过荧光机制衰减，发射出一个波长620nm的光子，重新生成基态的Ru(bpy)32+。4 该过程在电极表面周而复始进行，产生许多光子，使信号增强。（二）ECLIA的反应模型1 根据待测分子大小 1）竞争法 一般检测半抗原和小分子为主 T3、T4、FT3、FT4、E2等2）夹心法 TSH、FSH、LH、AFP、CEA等2 根据未结合的标记物和结合的标记物是否需分离1）均相 在无需分离游离标记分子情况下，直接定量测出结合标记分子的ECL反应强度。2）异相 在测定结合标记分子的ECL反应强度前，需将未结合标记物与结合标记物分离。3 反应模式中加入生物素-链霉亲合素技术，提高检测的灵敏度和检测范围4 DNA探针检测 Blackburn曾用ECL检测HIVgag基因，发现在基因拷贝数50-2000范围内，ECL反应强度呈直线，并能鉴别出基因拷贝数小于10个的HIVgag基因。四、ELECSYS2010全自动电化学发光分析系统（一）仪器概况1.仪器组成 台式连续随机进样自动化分析仪 样本盘 试剂盒 温育反应盘 电化学检测系统 计算机控制系统2.测试速度 每小时90个测试，从样本放入到出第一个结果的时间是18min，以后每 0.5到1min出一个结果，平均为45秒。3.样本 直接上机，急诊标本可随时插入检测4.识别系统 所有试剂标准品质控品均有条码直接读入测定参数5.灵敏度 由于采用电化学发光技术及链霉亲合素生物素技术，灵敏度可达到或超过放免水平6.定标 主标准曲线已储存在仪器内，工作时用2点定标校准，以后为批定标。（二）ECLIA所用试剂1.Ru(bpy)32+标记抗体/抗原，是ECLIA的标记分子，经电化学激发可发射光子，但只有与抗体或抗原结合成复合物以后，这种反应才具有特异性。2.生物素标记抗体/抗原3.与链霉亲合素包被的磁性微球固相结合的特异性抗体或抗原。4.TPA如同酶免测定方法中的底物，是ECL反应系统中的电子供体。（三）ECLIA检测原理1.双抗夹心法检测抗原 以TSH为例1）Ru(bpy)32+标记抗TSH抗体+生物素标记抗TSH抗体+待测样品 共同温育 Ru(bpy)32+标记的抗体-抗原-抗体-生物素复合物2）加入链霉亲合素包被的磁性微球后，抗原抗体复合物通过链霉亲合素-生物素的结合而吸附在磁珠上。3）蠕动泵将反应液吸入流动室，同时用TPA缓冲液冲洗。磁性微球抗原抗体复合物被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面，游离的标记抗体被冲洗走，同时电极加压，启动ECL反应，使Ru(bpy)32+ 和TPA在电极表面进行电子转移，产生光信号。4）光信号由光信号监测器检测光强度，光强度与Ru(bpy)32+的浓度呈线性关系，由此测出待测抗原的含量。2.竞争法 以E2为例 1）样本与生物素标记抗体温育形成抗原抗体复合物2）加入链霉亲合素包被磁珠及Ru(bpy)32+标记E2衍生物，二者与游离的生物素标记抗体结合，形成复合物。3）与磁珠相结合的复合物被吸附于电极表面启动ECL反应，未与磁珠结合的样本+生物素抗体复合物则被冲走。4）光信号由光信号监测器检测光强度，光强度与Ru(bpy)32+的浓度呈线性关系，但与待测抗原浓度呈反比，由此测出其的含量。（四）ECLIA技术的优点1.灵敏度高，检测下限可达1pmol2.线性范围宽，可达7个数量级3.检测速度快，仅需几分钟4.应用范围广，无论待测分子大小，均可以同样的灵敏度和线性范围进行检测，还可以检测DNA5.检测稳定,可自动化五ECLIA在临床检测中的应用甲状腺功能 TSH 、T3、T4、