G6PD缺乏高铁血红蛋白法检查分子生物学设计性实验(1)PPT课件.ppt

1 G6PD缺乏高铁血红蛋白法检查分子生物学设计性实验 2010级临床八大班第四实验室 组员 2 患儿 男性 3岁 因面色苍白伴血尿1天入院 1天前食用新鲜蚕豆后 今日出现恶心 呕吐 排尿呈酱油样色 面色苍白 据家长反映 患者的姐姐也曾发生过类似情况 体格检查 体温38 脉搏150次 分 呼吸40次 分 血压80 60mmHg 呼吸急促 神清 萎靡 面色苍白 皮肤及巩膜黄染 体型较同龄人瘦小 心 肺未及异常 肝 脾未触及 双肾区无叩击痛 神经系统检查未及异常 实验室检查 红细胞1 98 1012 L 血红蛋白53g L 血清总胆红素85 5 mol L 结合胆红素13 7 mol L 未结合胆红素71 8 mol L 尿蛋白 潜血 尿胆红素 尿胆素原 尿液镜下未见红细胞 案例 3 1 根据上述患儿的临床表现和实验室检查 初步判断患儿是何种疾病 蚕豆病起病急遽 大多在进食新鲜蚕豆后1 2天内发生溶血 最短者只有2小时 最长者可相隔9天 如因吸入花粉而发病者 症状可在数分钟内出现 潜伏期的长短与症状的轻重无关 本病的贫血程度和症状大多很严重 症状有全身不适 疲倦乏力 畏寒 发热 头晕 头痛 厌食 恶心 呕吐 腹痛等 巩膜轻度黄染 尿色如浓红茶或甚至如酱油 一般病例症状持续2 6天 最重者出现面色极度苍白 全身衰竭 脉搏微弱而速 血压下降 神志迟钝或烦躁不安 少尿或闭尿等急性循环衰竭和急性肾功能衰竭的表现 4 蚕豆病发病机理 1 蚕豆病的遗传机理蚕豆症是一种性染色体隐性遗传 意思是女性的一对X性染色体都带有疾病基因才会发病 男性只有一个X性染色体 所以只要这个X染色体异常就会发病 只有一个异常X染色体的女性没有症状 但是她们所生的男孩如果得到这个异常的X染色体 就会发病 2 蚕豆病的诱发机制蚕豆病属先天性酶代谢缺陷遗传病 与体内红细胞缺乏葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 G 6 PD 有关 在正常情况下 人体红细胞有一种具抗氧化作用的物质 谷胱甘肽 G 6 PD缺乏者 谷胱甘肽尤其是还原型谷胱甘肽明显减少 致使红细胞对氧化作用十分敏感 食入新鲜蚕豆后 蚕豆中所含的巢菜碱甙物质 可使血液中的氧化性物质增多 导致红细胞被破坏 从而发生以黄疸和贫血为主要特征的全身溶血性反应 5 2 请设计实验进一步明确诊断要求 实验名称 实验方法 主要试剂和仪器 实验操作流程及注意事项 结果如何分析 6 G6PD缺乏症的检查方法 高铁血红蛋白还原实验 变性珠蛋白小体生成实验 可做为G6PD缺乏的筛选实验 G6PD活性测定 G6PD荧光斑点实验 特异性较好 方法简单 抗坏血酸 氰化物实验 硝基四氮唑蓝定量法 G6PD比值法 高铁血红蛋白还原实验 7 高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查 实验名称 高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查 8 高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查 实验原理 在有足量的还原辅酶 NADPH 存在下 反应液中的高铁血红蛋白能被高铁血红蛋白还原酶即细胞色素b5 黄素酶 还原成亚铁血红蛋白 在体外 这一还原过程还需要递氢体亚甲蓝的参与 但红细胞内葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 G6PD 含量正常时 由磷酸戊糖代谢途径生成NADPH的数量足以完成上述还原反应 当红细胞内G6PD含量不足或缺乏时 高铁血红蛋白还原速度减慢 甚至不能还原 高铁血红蛋白呈褐色 在波长635nm处有吸收峰 可用分光光度计加以测定 9 高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查 实验试剂 0 18mol L亚硝酸钠和0 28mol L葡萄糖混溶液亚硝酸钠1 25g 葡萄糖5 0g 蒸馏水溶解 并加至100ml储存于棕色瓶中 放4 冰箱 可保存一个月0 4mmol L亚甲蓝溶液亚甲蓝 含3个结晶水 0 15g 蒸馏水加至100ml 先将亚甲蓝放入乳钵中 加蒸馏水少量研磨 待溶解后移到100ml容量瓶中 在再加蒸馏水至100ml 混匀过滤 此液可贮存3个月 0 02mol L磷酸盐缓冲液 PH7 4 磷酸氢二钠229 5mg 磷酸二氢钾52 2mg 加蒸馏水至100ml 或用0 0667mmol LPH7 4磷酸盐缓冲液稀释3倍 109mmol L枸橼酸钠溶液 32g L 10 高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查 操作 1 在试管中加入葡萄糖20mg 109mmol L枸橼酸钠溶液0 2ml 静脉血1 8ml 混匀 2 离心15min 取出 调整血细胞与血浆的比例为1 1后混匀 3 取上述抗凝血1ml 加亚硝酸钠葡萄糖混合溶液和亚甲蓝溶液各0 05ml 颠倒混合15次 使与氧气充分接触 加塞后放37 水浴或孵箱中3h 11 高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查 4 孵育后混匀 取血0 1ml 加PH7 4磷酸盐缓冲液10ml 混匀 2min后在波长635nm处测定吸光度 设为SA 5 空白对照 用未加亚硝酸纳葡萄糖的血液 同样孵育后取0 1ml 加PH7 4磷酸盐缓冲液10ml 2min后测定吸光度为B 然后加入亚硝酸钠葡萄糖混合溶液1滴 混匀 5min后再测其吸光度为ST 此为高铁血红蛋白对照 12 高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查 计算 高铁血红蛋白还原率 1 SA B ST B 100 式中 SA B ST B分别为还原后和还原前高铁血红蛋白的吸光度 SA B ST B为还原后剩余高铁血红蛋白的比值 13 高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查 注意事项 对于贫血患者应将红细胞比容调整在0 35 0 40 35 40 草酸盐抗凝剂具有还原性 不宜使用 试剂的比例要准确 否则易产生假阳性或假阴性 标本不应有凝块或溶血 以免影响测定结果 14 高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查 结果分析 高铁血红蛋白还原实验 MHb 正常人还原率 75 比色法 蚕豆病患者MHb还原率31 74 杂合子遗传者 还原率 30 纯合子型 患者如存在高铁血红蛋白 HbH 不稳定血红蛋白 高脂血症 巨球蛋白血症等均可造成假阳性 NADPH MHb还原酶缺乏 罕见 也可出现阳性结果 15 3 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验检查结果 红细胞和血红蛋白含量减少原因 G6PD缺陷不能通过磷酸戊糖途径提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽红细胞脆性增加 易于破裂红细胞在遇到蚕豆中的某些强氧化剂时 细胞膜破坏红细胞减少 实验检查结果 16 大量血红蛋白释放 形成原尿后 超过肾小管和集合管的重吸收作用 尿蛋白量增加 形成酱油样尿 胆红素增加 红细胞减少 实验检查结果 单核吞噬系统 17 红细胞大量破坏单核吞噬细胞系统产生胆红素增加超过肝摄取 转化和排泄的能力未结合胆红素浓度增加 血浆胆红素 未结合胆红素含量增高 结合胆红素浓度改变不大 当超过34 2mmol L时出现显性黄疸 肝对胆红素的摄取 转化和排泄增多进入胆道系统肠肝循环尿胆原和尿胆素增多 实验检查结果 18 实验检查结果 潜血 潜在的出血 也就是由肉眼下或是显微镜下无法观察到有红血球的存在 但如果用试纸检验时却有反应 当红血球被破坏时 其内含的血红素会释放出来 所以 尿液试棒才能侦测到血红素的反应 尿液下没有见红细胞可能是因为红细胞本身的寿命已到 也可能是喝了大量水 尿液稀薄红血球破裂 19 临床表现 血压降低 溶血性贫血 血红蛋白量减少 O2供应不足 呼吸急促 微弱 面色苍白 红细胞大量破坏 白细胞 巨噬细胞 血小板增多 炎症反应 体温升高 心率 脉搏加快 胃肠血流量不足 胃肠道平滑肌痉挛收缩 恶心 呕吐 20 4 要想探讨该病发生的分子基础 可以用哪些技术检测什么目的基因 可使用技术 扩增G6PD基因第10 11 12 13外显子639bpDNA片段结合寡核苷酸探针斑点杂交技术PCR SSCP片段结合寡核苷酸探针斑点杂交技术PCR SSCP分析法DNA序列分析探针技术 21 G6PD基因定位于X染色体长臂2区8带 因子及18Kb 中国人红 绿色盲基因之间 Xq28 长18Kb 中国人G6PD基因绿色盲基因之间 Xq28 Xq28目前依法显得突变种类很多 但能引起题目中所诉临床症状G1376 和G6PD的突变点可能是G1376 和G