HIV感染和 AIDS的实验诊断PPT课件.ppt

HIV感染和AIDS的实验诊断 1 HIV感染及AIDS的实验诊断 2 揭开AIDS历史的第一页MMWRJUNE5 1981 VOL 30 NO 21MORBIDITYANDMORTALITYWEEKLYREPORT 3 爱滋病是一种有病毒引起的全身性传染病 其定义是血液中查到人类免疫缺陷病毒抗体或其他相关的病毒学指标 机体抵抗感染和疾病的免疫机能受到破坏 而发生的一系列相应症状 HIV感染者的定义是血液呈HIV阳性而无症状的感染者 获得性免疫缺陷综合征 Acquiredimmuno deficiencySyndrome AIDS 4 1 发展简史1983年 法国巴斯德研究所分离到一种新的逆转录病毒 命名为LAV 1984年美国国立癌肿研究所分离出命名为HTLV 的病毒 同年 美国加州大学分离出AIDS相关病毒 AIDSRelatedVirus ARV 1986年 非洲西部发现了另一种病毒 国际微生物学会及病毒分类学会统一命名为HIV 一 生物学特征 5 2 HIV的结构与蛋白质功能HIV呈球形或卵形 直径为100 120nm 双层结构 核心由两个相同拷贝的RNA及蛋白质 反转录酶 核糖核酸酶及整合酶组成 核心外为病毒衣壳 20面体立体对称 有蛋白质 P17 P18 P24 P25 最外层是膜蛋白 包膜上有刺突 含糖蛋白gp120 在双层脂质中有gp41 一 生物学特征 6 HIV病毒颗粒及其结构蛋白和其他毒粒蛋白 7 人类免疫缺陷病毒HIV 8 HIV基因编码的产物及其功能 9 HIV结构蛋白包括 核心蛋白 gag 包膜蛋白 env 聚合蛋白 pol 核心蛋白包括 P17位于核蛋白与壳层之间的基质上 包被于包膜蛋白的内部 P24和P15包被于内部核酸外围核衣壳主要为P24 包膜蛋白为糖蛋白 gp160是前体分子 在感染初期产生 然后分解成gp120和gp41 聚合酶蛋白包括 P66 P51和P31 聚合酶抗原位于病毒的核区内 与病毒核酸紧密相关 其功能为转录RNA为DNA 整合病毒DNA到宿主细胞的DNA上和切割前体分子使之成为有活性的小分子 HIV的结构蛋白 10 HIV 1分为M O N三组 M组包括A B C D E F G H I J共10个亚型 加上O N型共12个亚型 HIV 2至少有A B C D E F等6个亚型 3 HIV的病原特异性 11 HIV亚型 A B C D E F G H I J O HIV2 SIV Adaptedfrom J Levy HIVandthePathogenesisofAIDS HIV1 12 HIV 1亚型全球分布 B a c d f o A O d g h B a d e o B B B B B f c B e B C A D e C a d C a b e C E b E b B e c B e B a c d g h B i UNAIDSDec 1996 非洲及亚洲部分地区有重组株病毒 13 HIV的亚型特点 有相对优势亚型同一亚型差异很大亚型内的变异水平估算存在时间不同亚型传播途径和致病性不一不同亚型对抗 HIV药物引起耐药不同亚型重组 14 属于逆转录病毒 复制速度快可感染人体各种细胞 造成多器官损伤破坏具有调节免疫系统功能T4淋巴细胞在血液 淋巴液 精液 阴道分泌液和乳汁中其抗体无保护作用对外界抵抗力弱 低于乙肝病毒 人类免疫缺陷病毒 15 1 艾滋病成为全球第四大杀手 传染性疾病的第一大杀手夺取了超过280万人的性命 2 截止2008年 15 49岁HIV患病人数已有4000万 其中40 是15 24岁的青年 有120万儿童 3 亚洲人感染艾滋病的增长速度最快 尤其是中国和印度 4 HIV的研究仍跟不上其破坏的速度 5 治疗性控制是可以达到的 二 流行病学 16 全球爱滋病感染人数及感染途径 根据联合国爱滋病委员会和世界卫生组织统计 全球每年新感染爱滋病带毒者410万 24h全球增加16000感染者 因HIV死亡的人数超过了280万 已超过了肺结核 病死率200万 和疟疾 100万 17 1 西方国家HAART的使用 患病率和病死率在下降 而发展中国家AIDS形势严峻 2 以注射吸毒和性传播 以异性间的传播为主 3 不洁的血液采集 4 女性病例上升 母婴传播5 儿童病例增加 15岁 近年AIDS流行特点 18 AIDS的流行情况 19 全国爱滋病患者报告人数已超过65万人2008年新感染人数已超过7万人31省市自治区全部发现HIV感染者三种传播途径均已存在全国爱滋病的流行经过散发期 1985 1988 局部流行期 1989 1994 现已进入广泛流行期 1995至今 爱滋病已成为名副其实的第三世界疾病 中国的爱滋病近况 20 苏州市自92年起共发现艾滋病例600多例 而去年一年的新感染者达190余例 这些统计数字充分表明了我国目前真可谓艾滋病病毒感染的迅速增长期 体检发现 联合国艾滋病中国专题组在北京以 中国艾滋病 危险的泰坦尼克号 为题发布了2001年中国艾滋病形势的最新报告 报告警告说 中国正处在艾滋病灾难的边缘 一艘巨轮正在冲向冰山 21 1 HIV借助CD4受体结合到靶细胞表面 通过靶细胞的内吞作用和gp41的融合作用 其细胞膜被穿透 病毒进入细胞质 2 在RT作用下 第一条RNA转录为DNA 继之以第一条DNA为模板 形成前病毒 3 在整合酶作用下 形成的双股DNA整合到宿主细胞中 感染持续存在 4 前病毒成为潜伏状态 5 前病毒DNA复制 具有新一代病毒的遗传物质 6 复制好的新病毒颗粒 再感染别的细胞 而原感染的细胞死亡 三 致病机制 22 2 HIV的感染过程 23 HIV感染 AIDS过程 窗口期 1 3月 无症状携带阶段 6 15年或更长人体感染HIV后大多经 年潜伏期 爱滋病前期 爱滋病期 机会性感染及机会性肿瘤HIV感染者及AIDS病人均具传染性 24 1 窗口期 感染HIV到相应抗体产生 2 急性感染期 一般在一月后产生抗体 平均45天 在急性感染期病毒复制明显 血中常可出现P24抗原和HIVRNA 也可培养到HIV 3 潜伏期 可持续数月至17年以上 此时仅能检出抗体 但有低浓度HIV复制 4 AIDS临床阶段 急性HIV感染诱导的宿主免疫应答的进程 HIV的感染过程 25 HIV的感染过程 26 感染初期 出现病毒血症 可检出HIV和HIVRNA 血清阳转后可检出多种结构蛋白引起的相应抗体 如P24 P55 gp160 gp120 gp41 P51等 均为IgG 抗HIVIgM出现峰度很低 持续时间短 抗gag抗体 如P55 P24是常规筛选和确认实验最早检出的抗体 平均22天 一般均出现血液淋巴细胞下降 CD4细胞数目为最重要反映临床进展的指标 HIV感染者 2m和新蝶呤水平升高并与其病程有关 3 感染后的免疫反应 27 HIV感染后的血清学变化 1 血清中的HIV抗原在感染后3 4周达到高峰 9 10周逐渐降低甚至消失 HIV抗体出现并维持高水平多年 尤以P41时间最长 2 HIV抗原消失或极少往往表示病毒的潜伏期 在血清中再次大量出现可能已是AIDS晚期 此时HIV抗体下降 HIV感染的血清学变化 28 4 HIV感染后的T细胞变化 CD4 T持续不断下降 及Th1 Th2亚群失调 对抗原反应性减低 细胞因子如IFN r TNF a水平升高 产生细胞因子的功能受损 如IL1 IL2能力下降 CD8 T早期有较明显上升 发病前1 2年明显下降 CTL功能下降 但如加IL 2处理可恢复活性 CD3 T在早期下降不明显 在AIDS发病前1 2年出现明显下降 29 CD4 淋巴细胞的格局 30 HIV的病毒培养与分离 HIV的毒株分析 HIV核酸测定 AbbottLCxHIV RNA P24抗原的测定 第四代酶免试剂HIV抗体测定 常分为初筛和确认两步 初筛实验室和常用初筛方法有 HIV病毒抗体金标快速法 InstantCHEK HIV1 2 爱滋病毒抗体筛选酶免试剂 MUREXHIV DetermineHIV1 2 0亚型试纸 Abbott 双抗原夹心酶免试剂确认试验主要是免疫印迹技术 WesternBlot WB 四 HIV的实验诊断 31 1 HIV抗体检测 试剂盒1985 3HIV 11990 6HIV 21992 4HIV 1 2敏感度和特异度不断提高 三代ELISA均达99 以上 1998 三代ELISA检测 IV1 HIV2 P24Ab 2008 四代ELISA IV1 HIV2 P24Ag 快速诊断试剂 胶体金标记 32 EIA实际试剂盒进展 代次抗原方法检测时间1全病毒间接 2个月2重组或多肽间接42 45d3重组 多肽夹心22d4抗原 抗体夹心16d 抗原5pg 5基因扩增法 基因芯片6 11 5d 33 HIV抗体筛查试剂 1 MurexHIV1 2 O 第三代抗体试剂的双抗原夹心法模式两步法酶标法测试 可以用来检测HIV抗体I型 II型和O亚型 手工 自动化酶标仪检测 用血清 血浆样本 34 MurexHIV 1 2 O 夹心模式 板底 样本 结合物 抗原包被 1 辣根过氧化物酶标记抗原 2 模式 双抗原夹心法 35 MurexHIV 1 2 O抗原 HIV 1env POD POD POD HIV O HIV 2 多肽抗原 重组抗原 板 结合物 CDSD POD HIV 1p24 P41 p36 36 前带 后带效应的机制 两步冲洗法 可避免此效应 低浓度的结合物 高浓度的结合物 37 HOOK效应的机制 Ag变构是二步夹心酶免出现钩状HOOK的原因 被测抗原如具有多重决定族与亲和性高于包被抗体的酶标抗体发生交叉重叠结合 由于立体效应和互相挤压 Ag分子发生构象改变而从包被抗体上脱落 造成反应信号下降 38 2 POCT在艾滋病毒检测中的应用 快速DetermineHIV1 2O抗体检测 第三代抗体试剂的双抗原夹心法模式可以用来检测HIV抗体I型 II型和O亚型 可用手指 静脉血 15分钟出结果 可用血清 血浆 全血样本结果可密封保存 39 40 41 42 快速试剂研制的背景 就地检测 POCT 概念 急诊 手术 紧急输血 事故紧急检测 医护人员和病人的保护 筛查概念 母婴筛查 就职 移民 性及吸毒犯罪人员体检等 简单易用 日常检测 大 中 小型实验室 及极少量HIV样本实验室 偏远地区 实验室条件或设备不齐 外出检测 方便携带 使用 结果可保存 43 灵敏度排名及分数 44 3 第四代试剂及抗原有关的试剂 HIV抗原 抗体联合试剂 MurexHIVAg Ab 第四代试剂大大提高灵敏度的筛查试剂 进一步缩短了检测 窗口期 RIADeltaHIVAg Ab 放免HIV抗原 抗体联合试剂 HIV抗原试剂 MurexHIV抗原单克隆试剂 临床上只用于HIV抗原检测以早期检测样本 或观察HIV疾病进程 MurexHIV抗原确认试剂 确认抗原试剂阳性样本 45 HIV 标记物 CDCgroupI CDCgroupII III CDCgroupIV HIVAg RNA IgM IgG env IgG p24 HIVAg RNA 第一代 第二代 第三代 第四代 抗原补充 46 47 48 4 HIV特殊试剂 HIV抗体WB确认试剂 为唯一一种经典和全球公认的抗体确认试剂 2 2版本包含有极早期血清转换片段 便于早期样本的确认 LCxHIV核酸物质定性 定量分析 LCR和PCR技术 用于HIV病人遗传物质检测 可用于部分确认 和病人治疗监测 49 WesternBlot分析HIV蛋白 50 Westernblot原理 51 52 HIV病毒核酸分析和血清学免疫测定比较 血清学免疫测定核酸分析 感染后天数 天 血清HIV抗体 核酸分析 53 5 自身红细胞凝集试验原理 双功能试剂 抗RBC gp120简单 快速 微量 不需分离血清有假阳性 54 6 HIV亚型分析 HIV变异的识别 7 细胞因子的测定 8 PCR追踪HIV自然感染史 HIV的实验诊断 55 世界爱滋病日 1988年 月将每年的 月 日定为世界爱滋病日 号召世界各