HPV检测的进展PPT课件.ppt

HPV检测的进展 1 看看这些英年早逝的艺人 她们死于宫颈癌 宫颈癌的知晓率在不断提高 2 宫颈癌的流行特征 世界范围内统计 2000年 每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例其中80 的病例发生在发展中国家50 的病例发生在亚洲中国每年有新发病例15万左右 8 10万人死于子宫颈癌 3 1977年Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头瘤病毒 humanpapillomavirus HPV 颗粒 70年代末ZurHausen首先提出人乳头瘤病毒与宫颈癌发病可能有关的假想后 国内外学者进行了大量的研究 并获取了许多证据 1995年国际癌症协会 IARC 专题讨论会的学者们认为 HPV感染是宫颈癌的主要病因 即HPV感染是宫颈癌发生的必要条件2005年 IARC WHO推荐HPV检测可以用于宫颈癌筛查 HPV在宫颈癌研究中的历程 4 2008年诺贝尔生理学或医学奖 瑞典卡罗林斯卡医学院10月6日宣布 将2008年诺贝尔生理学或医学奖授予德国科学家哈拉尔德 楚尔 豪森 右 及两名法国科学家弗朗索瓦丝 巴尔 西诺西 左 和吕克 蒙塔尼 中 这是三名诺贝尔奖得主的拼版照片 新华社 法新 5 HPV与宫颈癌 什么是HPV HPV是一种性传播性疾病 通常没有症状 HPV是一种双链DNA病毒 具有嗜上皮性 在人和动物中分布广泛 有高度的特异性 病毒的种间不存在交叉感染 感染为局限性非系统性 其基因组长度约为8000bp 主要由早期基因区 E区 晚期基因区 L区 和长控制区 longcontrolregion LCR 组成 HPV病毒三维结构图 6 HPV16 L1 主要衣壳蛋白 是疫苗的主要成分 L2 次要衣壳蛋白 是市售抗体的主要识别位点 E4 结合并破坏细胞角蛋白网 形成挖空细胞的外观 E2 负性调节E6和E7 维持凋亡和细胞周期的调控 通常在病毒发生整合 病毒整合时会破坏E2基因的结构 时失活 HPV的主要致癌基因E6通过抑制p53而阻断凋亡E7通过抑制pRB使细胞周期失控 X 7 1 HPV感染的高发病率时期在女性开始性活动的性活跃期 随后感染率下降 因为大部分的HPV感染是自限性的 2 癌前病变的发病高峰在HPV感染高峰的若干年之后 并且大大低于HPV的感染率 只有一部分感染HPV的女性发生癌前病变 3 宫颈癌的发生又在癌前病变的若干年之后 出现癌前病变与宫颈癌发病之间有较长的时间间隔 HPV感染 癌前病变及宫颈癌 8 HPV的增殖周期病毒基因组以附加体的形式潜伏与基底层细胞 病毒的复制依赖于上皮细胞的分化 在基底层上层细胞中开始复制 病毒的存在使细胞的形态学发生改变 包括多发性乳头瘤病 角化不全等 子代病毒在脱落细胞中释放 HPV的感染特点 9 从宫颈良性病变向浸润性宫颈癌进展示意图 宫颈组织与宫颈组织病变 10 我国宫颈癌诊断现状 主要是肉眼观察和细胞学 仍沿用60年代制定的宫颈涂片巴氏染色假阴性率较高 容易漏诊早期宫颈癌不典型鳞状细胞性质未定者 需要反复随访 难以确诊 常造成病人失访TCT 11 50 5 000 名女性将患有CIN2 3 根据美国已经公布的数据 这些女性中约有1 将患有CIN2 3 因此这个人群中将有50人患CIN2 3 12 如果单独使用液基细胞学筛查人群 大约会有13例CIN2 3的患者在第一轮筛查中不能被查出来 因为液基细胞学的敏感性为75 13 如果使用高危型HPVDNA检测 仅有3例CIN2 3不能被查出 这是因为HPVDNA检测的敏感性大约在94 14 将HPV和液基细胞学结合起来以代替单独使用HPVDNA检测 筛查中遗漏的CIN2 3患者将只有1名 然而 为了找出单独使用HPVDNA检测时遗落的另外两名CIN2 3患者 我们将不得不进行5 000个液基细胞学样本检查 这确实有用吗 特别是当我们意识到仅用细胞学进行初次筛查会漏掉13例CIN2 3 出于这些考虑 将来HPVDNA检测可能被批准在没有同时进行宫颈细胞学检查的情况下单独作为筛查手段使用 15 推荐的子宫颈癌筛查方案 HPV DNA检测 阳性 液基细胞学检查 阴道镜检查 组织检查 异常 阴性 正常 筛查 1次 3 5年 筛查 1次 6个月 1年 16 HPV基因分型 E6 E7 和L1ORF的核酸序列与已知基因型的核酸序列同源性小于90 则认为是一个新的基因型 现在已发现200多个亚型的HPV 一些HPV的天然的变异可能会改变一些重要的生物和生化性质 从而改变致癌风险程度 注 根据HPV的致癌危险性的大小 可把HPV分为低危型和高危型两大类 17 HPV与宫颈癌 HPV感染特点 HPV引起的常见临床疾病与HPV亚型疾病HPV亚型扁平疣3 10 27 28 41寻常疣1 2 4 7 27 29 40 54疣状表皮发育不良5 8 12 14 15 17 19 2538 46 47 49 50尖锐湿疣6 11 16 18 31 33 34 35 39 51 64 68 70 73鲍温样丘疹病16 18 39 42宫颈上皮内瘤6 11 16 18 31 33 35 43 44 51 56 58 61浸润性宫颈癌16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 68阴茎癌16 18女阴癌16 18 18 以HPV感染为主要病因在各种癌症中所占的比例 HPV 感染例数 总病 例数 宫颈 咽 肛门 口腔 喉 外阴 阴茎 每年病例数 0 100 000 2 00 000 3 00 000 4 00 000 5 00 000 19 宫颈湿疣CIN3 20 HPV感染途径 性接触传播丈夫阴茎HPV的存在可使妻子宫颈受染的危险增加9倍 相同的HPV亚型可以在性伴侣中检出 与此相反 处女通常是检测不到HPV感染直接皮肤接触也被认为是主要的传播方式母婴传播母亲生殖道的HPV感染也可以传播至她们的婴儿的口腔中 21 什么人应该检查HPV感染 任何有三年以上性行为或21岁以上有性行为的妇女均为筛查对象 因为21岁以下子宫颈癌患者极为罕见 而且从HPV感染到CIN需要3 8年时间 高危妇女人群定义为有多个性伴侣 性生活过早 HIV HPV感染 免疫功能低下 卫生条件差 性保健知识缺乏的妇女对决定妊娠的妇女 在妊娠前应进行HPV检查 22 HPV阳性的处理 据统计 80 以上的生育年龄妇女都曾有HPV感染 大多数妇女 90 以上 能自动清除感染 HPV阳性 细胞检查阴性无需临床治疗 但需随访跟踪 宫颈癌是一种常见感染的罕见结局 23 HPV分型的临床意义 24 1 HPV16 18感染可能更容易使LSIL进展为HSIL或SCC 2 HPV45 31 33 58 52具有潜在促进LSIL向HSIL或SCC发展的可能 这5种基因型占LSIL中HPV感染的40 只占SCC的15 3 HPV35 39 51 56 59这5种基因型与其他高危型相比致癌能力更低 它们占LSIL中HPV感染的40 只占SCC的3 GaryM Cliffordet al HumanPapillomavirusGenotypeDistributioninLow GradeCervicalLesions ComparisonbyGeographicRegionandwithCervicalCancer CancerEpidemiolBiomarkersPrev2005 14 5 1157 64 1 可根据感染的HPV类型预测受检者HPV阳性的发病风险度 决定其筛查间隔 预测受检者CIN的转归 25 Plummeretal10058例宫颈癌 8550宫颈鳞癌 1508宫颈腺癌和宫颈腺鳞癌HPV16感染与宫颈癌的相关具有普遍意义宫颈鳞癌 HPV16占46 63 HPV18占10 14 宫颈腺癌和宫颈腺鳞癌 HPV18占37 41 HPV16占26 36 HPV分型与宫颈癌 26 病例 液基细胞学 阴道镜 宫颈光滑HPV分型结果 HPV18 复检阴道镜 发现微小病灶取组织活检 宫颈腺癌发现3例病例 27 2 HPV基因分型检测结果可以有效对HPV阳性病人进行很好的随访监控 即可避免对病人进行过度治疗 又可控制病人的病情发展 随访前后为同一亚型长期感染 高危人群 随访前后为不同亚型感染 非高危人群 28 该研究对丹麦哥本哈根11088名登记在册的妇女进行了为期数年的跟踪随访研究 对受检人群进行了宫颈细胞涂片检查 HPV检测和组织病理检查 该研究中假定连续两次HPV检测阴性的危险系数为1 0 各种持续感染情况的危险系数是其与1 0的比值 SusanneKKjaer etal Typespecificpersistenceofhighriskhumanpapillomavirus HPV asindicatorofhighgradecervicalsquamousintraepitheliallesionsinyoungwomen populationbasedprospectivefollowupstudy BMJVOLUME32514SEPTEMBER2002 29 HPV持续感染的危险性评定 1 SusanneKKjaer etal Typespecificpersistenceofhighriskhumanpapillomavirus HPV asindicatorofhighgradecervicalsquamousintraepitheliallesionsinyoungwomen populationbasedprospectivefollowupstudy BMJVOLUME32514SEPTEMBER2002 30 HPV持续感染的危险性评定 2 SusanneKKjaer etal Typespecificpersistenceofhighriskhumanpapillomavirus HPV asindicatorofhighgradecervicalsquamousintraepitheliallesionsinyoungwomen populationbasedprospectivefollowupstudy BMJVOLUME32514SEPTEMBER2002 31 3 HPV基因分型检测结果对宫颈病变病人手术前后随访提供依据 HoufflinDebangeVetalLEEP治疗205例CIN2或3的患者术前 HPV阳性94 1 术后 HPV阳性34 6 提示 治疗后HPV仍为同一亚型阳性者 复发的可能性大 32 不同区域LSIL CIN1中常见HPV亚型的分布InAsia upper95 CIforHPV16is39 6 andHPV53isnotshownbecausethedenominatorwas33casesonly 4 HPV感染的流行病学调查 33 5 HPV基因分型检测结果对我国开发针对于不同区域人群的HPV疫苗提供可靠的依据 北京市正常人群筛查HPV 23 9 HR HPV 19 5 LR HPV 4 4 Mixed HPV 2 0 分布前10位的亚型 16 58 52 68 CP8304 31 33 59 18and11 国家十五科技攻关项目 34 6 疫苗引进 疫苗接种效果的评价 不同型别的HPV机体产生特异性抗体的时间不同 HPV16感染者会在6个月后产生特异性抗体 并持续约4个月HPV18的感染者与HPV16类似 血清学转化很慢 HPV6的感染者则会在感染后很快产生抗体 L1蛋白是HPV的主要衣壳蛋白 机体可针对其产生中和抗体 细胞免疫在抵抗HPV感染时起重要作用 在T淋巴细胞功能受损时 则易出现HPV感染 细胞毒性T细胞的免疫应答主要决定于E7蛋白 HPV疫苗主要为针对HPVL1设计的病毒样颗粒 L1基因也是HPV基因分型中的关键基因 35 HPV检测方法 36 中心法则 37 HPV抗原检测法 38 1 血液样本中检测HPV抗体 HPV抗体检测阳性率为50 90 因为有部分人群感染HPV后并不能产生HPV抗体 HPV抗体检测阳性只代表曾经感染过HPV 并不代表现在HPV感染状态 研究表明 由于HPV亚型繁多以及人体对HPV免疫应答差异很大 抗体检测法的阳性率和特异性都不理想 妇女中有20 50 的人呈 阳性而不能检出型特异性抗 抗体 可能是由于被感染者过期抗体效价已下降 随访研究证实 检出后6 18个月间常发生血清转移 短暂 检出病例罕见抗HPV抗体 因此 很多学者认为HPV抗体检测意义不大 39 2 局部组织 细胞 分泌物样本 抗体检测抗原 检测HPV的衣壳蛋白L1 L2 因潜伏状态的存在 灵敏度不足 不能分型 基因分型 40 HPV DNA检测方法 41 1 传统杂交方法 原位杂交 Southern印迹杂交 斑点杂 该法不能达到临床所需的灵敏度 且操作繁琐 费时耗力 不适合于大通量临床样品的筛查 目前较少使用 42 2 HC 杂交捕获法 灵敏度为95 左右 特异度为85 左右 43 3 PCR方法 型特异PCR 型特异PCR试验基于HPV亚型E6 E7基因序列的差异而设计 此类试验可检测出每个反应中的10 200copies的HPV 电泳后染色显示结果 通过型特异性PCR对HPV进行分型通常用于研究 因为每一份样本通常要进行多个PCR反应 通用引物PCR 在一个PCR反应中 用1套引物可以扩增多种HPV亚型 这种引物通常针对HPV基因组中的保守区域设计 例如L1衣壳蛋白基因 这种检测方法的敏感性大约10 200DNAcopies 44 实时荧光PCR realtimePCR a 分型检测 需要多管反应b 不分型检测 多种亚型在一管内检测 45 4 导流杂交HPV基因分型检测 应用 可以快速准确诊断临床尖锐湿疣体表面脱落细胞 妇女宫颈细胞及宫颈粘液标本中33种HPV病毒DNA的存在 可作为临床可疑尖锐湿疣确诊 宫颈癌病因确定 早期筛查 治疗效果监测的诊断依据 46 核心技术 导流杂交原理DNA快速杂交装置 美国发明专利 5741647美国实用专利 6020187中国发明专利 02102795 1 47 导流杂交法与传统杂交法比较 动力学比较 导流杂交法的效率是传统杂交法的几十倍甚至上百倍 48 HPV基因分型检测试剂盒操作步骤 49 导流杂交 步骤 杂交进行时 样本的单链DN