生物反应器原理.ppt

生物反应器原理 吴第一章生物反应器及其操作特征生物反应器Bioreactor是bio与reactor的组合词 是指有效利用生物反应机能的系统或场所 生物反应器不仅包括传统的发酵罐 酶反应器还包括采用固定化技术后的固定化酶或细胞反应器 动植物细胞培养用反应器和光合生物反应器等 生物反应器这一术语出现的时间并不长 但人们利用生物反应器进行有用物质的生产却有着悠久的历史 古代欧洲用牛胃盛牛奶 牛胃中的活性物质把牛奶转化成乳酪 这是传统的乳酪生产方法 而牛胃便是原始状态的生物反应器 活性物质是凝乳酶 它催化牛奶中的蛋白质的限制性水解 促使凝聚为乳酪 我国酒类生产开始于商周时期 制酒的密闭容器也是一种早期的反应器 20世纪40年代是生物反应器的开发 研制和应用获得迅速发展的阶段 传统生物工业中使用的生物反应器称为 发酵罐 20世纪70年代 Atkinson提出了生化反应器 biochemicalreactor 一词 其含义除包括原有的发酵罐外 还包括酶反应器 处理废水用反应器等 同一时期ollis提出了另一术语 生物反应器 biologicalreactor 20世纪80年代 生物反应器 bioreactor 一词开始在专业期刊与书籍中大量出现 生物反应器是使生物技术转化为产品 生产力的关键设备 其在生物过程中处于中心位置 使用高效率的生物反应器的目的在于提高产品的生成速率 减少有关辅助设备 降低生产成本 获得尽可能大的经济效益 由于生物反应的多样性 生物反应器的型式也是多样的 但由于生物反应的复杂性 加上外界的影响及相关理论的不完善 目前生物反应器的型式还不能完全适应生物反应过程多样性的需要 为了了解生物反应器的基本原理 有必要了解 1 生物反应体系的流变学特性 氧传递与微生物呼吸 体积溶氧系数与相关因素 溶氧方程与溶氧速率的调节 2 酶反应器及其设计 机械搅拌式发酵罐及其设计 气升式生化反应器设计 生物废水处理设备及动植物细胞培养用反应器等 3 分批式 流加式 连续式操作 以及动植物细胞培养技术等 一个新生物反应过程的开发 最初阶段是认识与发现新的生物反应 然后才进入工程阶段 在工程阶段中 开发工作者首先遇到的是生物反应器的选型 确定选型后 进入操作条件的选择和反应器的工程设计 生物反应过程与化学过程的本质区别在于有生化催化剂参与反应 本课程 通过生物反应过程分析和生物反应器的选型与设计 阐明细胞反应过程的动力学规律 同时以基本生物反应器为基础 通过例题 讨论了生物反应器设计与分析的基本原理和方法 生物反应器开发的趋势和未来方向 1 开发比活力和选择性高的生物催化剂将继续占据重要地位 2 生物反应器的性能常极大的受到热质传递能力的限制 必须改进生物反应器中热质传递方法和设备 3 生物反应器正向大型化和自动化方向发展 4 一些特殊用途的和具有特殊性能的生物反应器得到了较快的应用和开发 例如 动物和植物细胞反应器 固体发酵反应器 边发酵边分离的特殊反应器等都得到了不同程度的发展 5 在降低设备投资方面 近年来对连续过程更加重视 6 生物过程中的单元操作是相互联系的 上游过程必然影响到下游过程 把生物反应器和后面的产物回收过程联系起来 考虑整个过程的合理性才显得有意义 课程简介 生物反应器的型式 生物反应器主要有三种类型 间歇式 半连续式 流加 连续式反应器 连续反应器进而又可分为连续搅拌罐反应器 CSTR 和活塞流反应器 PFR 生物催化剂又可分为两种 一种是酶 包括游离酶和固定化酶 另一种是细胞包括生长细胞和非生长细胞 生物催化剂和生物反应器的树形联系 工业上应用的固定化酶反应器 微生物反应的特征 工业微生物具有如下特点 1 微生物反应是生物化学反应 通常在常温常压下进行 2 原料多为农产品 来源丰富 3 易于生产复杂的高分子化合物和光学活性物质 4 除生产产物外 菌体自身也可是一种产物 如果其富含维生素或蛋白质或酶等有用产物时 可用于提取这些物质 5 通过菌种改良 有可能使统一生产设备的生产能力大大提高 微生物反应的5点不足 1 基质不可能全部转化为目的产物 副产物的产生不可避免 这将给目的产物的提取和精制带来困难 这正是造成目前发酵行业下游操作复杂的原因 2 微生物反应是利用活的生物体进行目的产物生产的反应 因此 产物的获得除受环境因素影响外 也受细胞内因素的影响 并且微生物菌体会发生遗传变异 因此 实际控制有一定难度 3 因原料是农副产品 所以受价格变动影响大 4 生产前的准备工作 开发新菌种 扩大培养等 量大 且花费高 对于好氧反应 需氧 故增加了生产成本 且氧的利用率不高 5 一般的 废水需进行处理 微生物反应过程的质量与能量衡算 微生物反应过程的质量衡算微生物反应与化学反应的主要区别是 微生物反应中参与反应的培养基成分多 反应途径复杂 如果将微生物反应看成是生成产物的复合反应 那么 从概念上讲可写成如下形式 碳源 氮源 氧 菌体 有机产物 CO2 H2O如果碳源由C H O组成 氮源为NH3 细胞的分子式定义为CHxOyNz 忽略其它微量元素P S和灰分等 CHmOn aO2 bNH3 cCHxOyNz dCHuOvNw eH2O fCO2式中 CHmOn 碳源的元素组成CHxOyNz细胞的元素组成CHuOvNw产物的元素组成对元素做元素平衡 得到如下方程 C 1 c d fH m 3b xc ud 2eO n 2a yc vd e 2fN b zc wd 例 葡萄糖为基质进行面包发酵 S cerevisiae 培养 培养的反应式可用下式表达 求计量关系中的系数a b c和d C6H12O6 3O2 aNH3 bC6H10NO3 面包酵母 cH2O dCO2解 根据元素平衡式有 C 6 6b dH 12 3a 10b 2cO 6 2 3 3b c 2dN a b以上方程联立求解 得a b 0 48c 4 32d 3 12 所以上述反应的计量关系式为C6H12O6 3O2 0 48NH3 0 48C6H10NO3 4 32H2O 3 12CO2配平微生物反应方程式时 一部分系数是由实验测得的 另一部分系数需计算获得 一般基质和产物的分子式是已知的 微生物细胞的元素组成可通过元素分析方法测定 另外 通过测定O2的生成速率来确定好氧培养中评价微生物生物代谢机能的重要指标之一的呼吸商 respiratoryquotient RQ 其定义式为CO2生成速率RQ O2消耗速率 乙醇为基质 好氧培养酵母 反应方程式为C2H5OH aO2 bNH3 cCH1 75N0 15O0 5 eH2O dCO2呼吸商RQ 0 6 求各系数a b c d e a 2 394b 0 085c 0 564d 1 436e 2 634 葡萄糖为碳源 氨气为氮源进行酵母的厌氧培养 培养中分析结果表明 消耗100摩尔葡萄糖和12摩尔氨气生成了57摩尔的菌体 43摩尔甘油 130摩尔乙醇 154摩尔二氧化碳和3 6摩尔水 求酵母的经验分子式 CH1 84N0 21O0 52 葡萄糖中有2 3的碳源转化为细胞中的碳 求各系数a b c d e反应式为 C6H12O6 aO2 bNH3 c C4 4H7 3N0 86O1 2 dH2O eCO2 结果 则计算a1 47 b0 78 c0 91 d3 85 e2 微生物反应过程的得率系数得率系数是对碳源等物质生成细胞或其它产物的潜力进行定量评价的重要参数 消耗1克基质生成细胞的克数称为细胞得率或生长得率YX S 其定义式为YX S 生成细胞的质量 消耗基质的质量 X S细胞得率的单位是 细胞 基质 g g或g mol 同一菌种 同一培养基 好氧培养的YX S比厌氧培养大得多 另外同一菌种在基本 合成 复合培养基中的培养所得的YX S的大小顺序为复合培养基 合成培养基 基本培养基 几种微生物细胞的菌体得率 例题 葡萄糖中有2 3的碳源转化为细胞中的碳 求各系数a b c d e及YX S和YX O反应式为 C6H12O6 aO2 bNH3 c C4 4H7 3N0 86O1 2 dH2O eCO2 YX S 83 1 180 0 46 g g YX O 83 1 1 47 32 1 77 g g 作业 微生物反应动力学 描述微生物动力学的方法不是指生物分离成为不连续的单个生物 而是指群体的存在 一般的 微生物在一定场所中存在的形式是大量聚集 一般可将微生物群体变化过程分为生长 繁殖 维持 死亡 溶胞 能动性 形态变化及物理群体变化等过程 生长速率一般的说 菌体的量是指微生物菌体的干重 深层培养中微生物菌体的生长速率常以单位容积计 是单位体积 单位时间里生长的菌体量 在表面上生长的菌体 其生长速度以单位表面积计 微生物细胞的生长速率rx的定义式为 rx dx dt X式中X 微生物的浓度 为微生物的比生长速率 其除受细胞自身遗传信息支配外 还受环境因素所影响 与倍增时间 doublingtime td的关系为 rx dx dt X 积分 ln2 td 0 693 td 生长的非结构模型 自20世纪40年代至今 微生物生理学学者和生物化学工程学的工程师提出了许多关于微生物生长动力学的数学模型 这些生长模型可分类为 1 确定论的非结构模型 是一种理想状况 不考虑细胞内部结构 每个细胞之间无差别 2 确定论的结构模型 每个细胞无差别 细胞内部有多个组分存在 3 概率论的非结构模型 不考虑细胞内部结构 每个细胞之间有差别 4 概率论的结构模型 细胞内部结构有差别 每个细胞之间有差别 一般人们提到微生物生长动力学模型指的是确定论模型 在确定论模型基础上 不考虑细胞内部结构 即认为细胞为单一组分时 在这种理想状况下建立起的动力学模型称为非结构模型 从工程角度看 理想的微生物生长模型应具备下列4个条件 1 要明确建立模型的目的 使用模型的目的 与其说是对微生物生长繁殖的复杂现象有统一深刻的认识 不如说是为了进行微生物反应器的设计 找到最佳的操作条件和确定出反应过程的合理管理方法 2 明确的给出建立模型的假定条件 这样才能明确模型的适用范围 3 希望所含有的参数 能够通过试验逐个确定 4 模型应尽可能简单 目前 常使用的确定论的非结构模型是Monod方程 基质消耗动力学 代谢产物的生成动力学 微生物反应器操作 微生物培养过程根据是否要求供氧 分为厌氧和好氧培养 前者主要采用不通氧的深层培养 后者可采用以下几种方法 1 液体表面培养 如使用浅盘 2 通氧固态发酵 3 通氧深层培养就操作方式而言 深层培养可分为 1 分批式操作 2 半分批式操作 3 连续式操作 分批式操作 分批培养 batchculture 将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养 培养基一次性加入 不再补充和更换 最后一次性收获 生长曲线 A延迟期 延迟期是细胞在新的环境中表现出来的一个适应阶段 如果新环境中存在某种老环境中没有的营养物质 细胞须合成有关酶来利用该营养物质 从而出现延迟期 许多胞内酶需要辅酶活化剂 他们是一些小分子物质或离子 具有较大的通过细胞膜的能力 当细胞转移到新环境中 这些物质可因扩散作用而从细胞中向外流失 延迟期的长短与种子的种龄及接种量的大小有关 年轻的种子产生的延迟期较短 而种龄较老的种子需要较长的延迟期 B指数生长期在这一阶段中 由于培养基中的营养物质比较充足 有害代谢物很少 所以 细胞的生长相对不受到限制 细胞浓度随培养时间指数增长 称为指数生长期 也称为对数期 C减速期随着细胞的大量繁殖 培养基中的营养物质迅速消耗 加之有害代谢物的积累 细胞的生长速率逐渐下降 进入减速期 D静止期因营养物质耗尽或有害物质的大量积累 使细胞浓度不再增大 这一阶段为静止期 细胞的浓度达到最大值 E 衰亡期由于环境恶化 细胞开始死亡 活细胞浓度不断下降 这一阶段为衰亡期 有关衰亡期的研究不多 因多数分批培养在衰亡期前结束 连续培养 在培养过程中 不断向反应器流加培养基 同时以相同流量从反应器中取出培养液 这种操作方式就是连续培养 连续培养使用的反应器可以是搅拌罐反应器 也可以是管式反应器 原理 当微生物在分批培养方式下生长达到对数期后期时 一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌 另一方面以溢流方式流出培养液 使培养物达到动态平衡 其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率 恒化培养 以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法 原理 通过控制某一种营养物浓度 如碳 氮源 生长因子等 使其始终成为生长限制因子 而达到控制培养液流速保持不变 恒浊培养 通过调节培养基流速 使培养液浊度保持恒定的连续培养方法 原理 通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变 即浊度不变 当浊度高时 使新鲜培养基的流速加快 浊度降低 则减慢培养基的流速 连续培养器 按控制方式分按培养器的级数分按细胞状态分按用途分 内控制 控制菌体密度 恒浊器外控制 控制培养液流速 以控制生长速率 恒化器 单级连续培养器多级连续培养器 一般连续培养器固定化细胞连续培养器 实验室科研用 连续培养器发酵生产用 连续发酵罐 流加操作 补料分批培养法就是指在培养过程中不断向反应器内加入培养基 但不同时取出培养液的培养方法 它是一种介于分批培养和连续培养之间的培养方法 有时也称为半分批培养法 透析培养 在培养过程中 培养液里积累的细胞代谢产物有时对细胞的生长有抑制作用 影响产物的生产 这时可以利用透析膜分离这类代谢产物 提高产物的生产率 不同操作方法的优缺点 氧的供需 细胞对氧的需求 培养过程中的氧传递 当氧传递达到稳定时 总的传递速率与串联的各步传递速率相等 这时通过单位面积的传递速率 影响氧的饱和浓度的主要因素有 1 温度温度越高 C 越低2 溶液的性质一般 溶质含量越高 氧的溶解度就越小 3 氧分压氧在溶液中的溶解度与氧的分压成直线系即亨利定律 二 影响微生物需氧量的因素 1 微生物种类 生长阶段和菌体浓度一般说 菌体处于对数生长阶段的Q 2较高 生长阶段的耗氧率 生长大于合成阶段的耗氧率 合成 所以可认为培养液的耗氧率 达到最高时 菌体浓度达到了最大值 2 培养基的组成一般 在一定碳源浓度范围内 需氧量随碳源浓度的增加而增加 另外 培养液中溶质浓度影响氧的溶解度 从而影响菌体的耗氧能力 3 培养液中溶解氧浓度 的影响发酵过程中 培养液中的溶解氧浓度 若高于菌体的 长临时 菌体的呼吸不受影响 菌体的各种代谢活动不受干扰 微生物生长阶段的呼吸临界氧浓度分别以 长临表示 若 小于 长临 菌体的各种生化代谢就受到影响 严重时会产生不可逆的抑制菌体生长和产物合成的现象 4 培养条件培养条件如PH 温度等影响微生物需氧量 PH影响代谢 代谢最旺盛或合成最旺盛时Q 升高 另外在一定的温度范围内温度升高则Q 的值增大 5 的影响CO 在水中的溶解度是相同条件下O 的30倍 当CO 浓度较高时 溶在培养液中影响菌体的呼吸 进而影响菌体的代谢活动 因此 要保证菌体的正常代谢需及时除去CO2 KL 的测定 一 亚硫酸盐氧化法此法是利用亚硫酸根在铜或镁离子作为接触剂时被氧迅速氧化的特性來估计发酵设备中的通气效率 反应式如下 剩余的Na2SO3与过量的碘作用 再用标定的Na2S2O3滴定剩余的碘 蓝色 无色 二 极谱法发酵液中的溶解氧可用极谱仪来测定 其原理是当电解电压为0 6 1 0V时 扩散电流的大小随液体中溶解氧的浓度而成正比变化 三 溶氧电极法溶氧电极可以看做是一种电解池 它有两只具有不同电性的电极 一只是银丝做成的阴极 另一只是铝皮卷成的阳极 复膜氧电极示意图 影响传氧速率的因素 一 搅拌好气性发酵罐通常都设有通风与搅拌装置 通风是为了供给需氧或兼性需氧微生物适量的空气 以满足菌体生长繁殖和积累代谢产物所需要的氧 搅拌的作用则是把气泡打碎 强化流体的湍流程度 使空气与发酵液充分混合 气 液 固三相更好地接触 一方面增加溶氧速率 另一方面使微生物悬浮液混合一致 促进代谢所需的传质速率 一 搅拌提高溶氧系数的机制 利用机械搅拌来提高溶氧系数是行之有效而普遍采用的方法 这是因为搅拌可以从下列几个方面改善溶氧效果 1 搅拌能把大的空气气泡打成微小气泡 增加了接触面积 而且小气泡的上升速度要比大气泡慢 因此接触时间也增长 2 搅拌使液体作涡流运动 使气泡不是直线上升而是作螺旋运动上升 延长了气泡的运动路线 即增加了气液的接触时间 3 搅拌使发酵液运动加强 从而减少了气泡周围液膜的厚度 进而减少了液膜阻力 因而增大了KL 值 4 搅拌使菌体分散 避免结团 有利于增加固 液传递中的接触面积 使推动力均一 同时 也减少了菌体表面液膜的厚度 有利于氧的传递 二 空气流速 通气效率或kL 是随着空气量的增多而增大的 三 空气分布管 空气分布管的形式 喷口直径及管口与罐底距离的相对位置都对氧溶解速率有较大的影响 喷口直径越小 气泡的直径也越小 溶氧系数就越大 四 氧分压 适当提高空气压力 即提高罐压 对提高通风效果是有好处的 但过分增加罐中空气压力是不值得提倡的 1 罐压增大 空气压力增大 整个设备耐压性要提高 从而大大增加设备投资费用 2 氧的分压过高也会影响菌的生理代谢 氧分压过高会造成微生物暂时的中毒现象 五 罐内醪液高度 在不增加功率消耗和空气流量不变时 增加发酵液体积会使通风效率降低 特别是在通风量较小时比较显著 但是在空气流量和单位发酵液体积消耗功率不变时 通风效率随发酵罐的高径比H D的增大而增加 六 罐容 通常大体积发酵罐的氧利用率高 体积小的氧利用率差 在几何形状相似的条件下 发酵罐体积大的氧利用率可达7 10 体积小的氧利用率只有3 5 发酵罐大小不同 所需搅拌转数和通风量不同 大罐的转数低些 通风量较小些 七 醪液性质 发酵过程中 由于微生物的生命活动 分解并利用培养液中的基质及大量繁殖菌体 积累代谢产物等 都能引起培养液的物理性质的改变 特别是黏度 表面张力 离子强度等 从而影响气泡的大小 气泡的稳定性和氧的传递速率 通常当发酵液浓度增大 黏度增大时 kL 值降低 发酵过程中由于泡沫大量形成 菌体与泡沫形成稳定的乳浊液 也影响氧的传递 这种情况下加入适量的消泡剂 消除泡沫 对氧的溶解有利 八 有机物质和表面活化剂 某些有机物质如蛋白胨能降低kL 值 但某些少量的醇 酮和酯反而会使kL 值提高 同样 加入表面活化剂也有这种情况 当加入少量洗涤剂时会使kL 值降低 当加到一定量时kL 值反而增高 三 发酵过程中供氧和需氧的异常变化 引起溶氧异常下降 可能有下列几种原因 污染好气性杂菌 大量的溶氧被消耗 菌体代谢发生异常现象 需氧要求增加 使溶氧下降 某些设备或工艺控制发生故障或变化 也可能引起溶氧下降 引起溶氧异常升高的原因 菌体代谢出现异常耗氧能力下降 使溶氧上升 污染烈性噬菌体 溶氧浓度的测定和控制 一 溶氧浓度的测定为了掌握发酵液中的通气情况 需要对发酵液中溶氧进行测定 生产上所测得的溶氧浓度是发酵液中发酵前的溶氧浓度减去发酵接种后微生物已消耗的溶解氧 是发酵时微生物菌体对发酵液利用后的剩余量 生产上测定溶氧浓度最常用的方法是复膜氧电极法 二 溶氧浓度的控制发酵液的溶氧浓度 是由供氧和需氧两方面所决定的 也就是说 当发酵的供氧量大于需氧量 溶氧浓度就上升 直到饱和 反之就下降 因此要控制好发酵液中的溶氧浓度 需从这两方面着手 在供氧方面 主要是设法提高氧传递的推动力和液相体积氧传递系数KLa值 在需氧方面我们已知 发酵液的需氧量 受菌体浓度 基质的种类和浓度以及培养条件等因素的影响 其中以菌浓的影响最为明显 控制菌体的浓度可以通过控制培养基浓度和接种量来实现 培养装置 一个优良的培养 发酵 装置应具有严密的结构良好的液体混合性能 较高的传质 传热速率同时还要具有配套而又可靠的检测及控制仪表 判断培养装置好坏的唯一方法应该是装置能否适合工艺要求 以获得最大的生产效率 发酵罐 进行微生物深层培养的设备统称为发酵罐 按照能量输入的方式 发酵罐可以分为三类 1 内部机械搅拌式发酵罐 3 空气喷射提升式发酵罐 通用式发酵罐 发酵罐的基本要求1 发酵罐应具有适宜的径高比 径高比越悬殊 氧的利用率较高 发酵效率越高 2 因用到高压蒸汽灭菌 发酵罐应有一定的耐压能力 3 合理的通风设计 保证发酵液必须的溶解氧 4 发酵罐应具有足够的冷却面积 保证制冷效果 5 发酵罐内应尽量减少死角 保证灭菌能彻底 6 搅拌器的轴封应严密 防止泄漏 避免染菌 搅拌器 搅拌器的主要作用是混合和传质 即使通入的空气分散成气泡并与发酵液充分混合 气泡细碎以增大气 液界面 获得所需要的溶氧速率 并使生物细胞悬浮分散于发酵体系中 以维持适当的气 液 固 细胞 三相的混合与质量传递 同时强化传热过程 搅拌器的设计应使发酵液有足够的径向流动和适度的轴向运动 搅拌叶轮大多采用蜗轮式搅拌器优点 结构简单 传递能量高 溶氧速率高等不足 轴向混合较差 且其搅拌强度随着叶轮与搅拌轴距离增大而减弱故当培养液较黏稠时则搅拌与混合效果大大下降 常用的有平叶式圆盘蜗轮搅拌器 弯叶式圆盘蜗轮搅拌器和箭叶式圆盘蜗轮搅拌器 叶片数量一般为6个 从搅拌程度来说 以平叶涡轮最为激烈 功率消耗也最大 弯叶次之 箭叶最小 为了强化轴向混合 可采用蜗轮式和推进式叶轮共用的搅拌系统 推进式搅拌器 也称螺旋桨式搅拌器 将罐内液体向前或向后推进 使流体形成螺旋状运动的圆柱流 混合效果较好 对液体的切剪作用较小 广泛应用于液 液混合 液 固混合的设备中 推进式搅拌器 推进式搅拌器搅拌流型 轴向流型搅拌器 Lightnin式搅拌器 能使全罐达到良好的循环状态 克服了径向型涡轮搅拌器两个区域间混合不均匀的缺点 轴向流型搅拌器 发酵罐搅拌液体流型 三 固体发酵罐固体发酵罐分为转筒式 转轴式以及立式多层固体发酵罐 采用优质不锈钢罐体 无死角 容易清洗 耐腐蚀 使用寿命长 搅拌方式独特 机械传动效率高 功率消耗少 其主要特点为 1 占地面积小 物料能在罐内蒸煮 灭菌 降温 罐内接种 罐内喷淋加湿 自动翻料等 可进行通气操作 2 广泛应用于菌体蛋白 散曲 纤维素酶 淀粉酶 生物肥料以及生物饲料等许多方面 3 能进行固体发酵以及固体与液体混合的发酵 动植物细胞培养装置 随着生物工程技术的发展 动植物细胞的培养逐渐从实验室规模过渡到生产规模的生物反应器中进行 动植物细胞培养 是指动物或植物细胞在体外条件下进行培养繁殖 此时细胞虽然生长和增多 但不再形成组织 动物细胞培养特点 1 无细胞壁 须附着生长 故须 贴壁培养 2 对培养基要求高 通常为含血清培养 成本高3 细胞对温度 pH 溶氧浓度等敏感 要求控制严格 4 对剪切力敏感 强烈的机械搅拌和通气鼓泡可损伤细胞 5 动物细胞生长缓慢 且在高密度下才能得到一定浓度的产物 6 培养周期长 易染菌 动物细胞大规模培养技术 指人工条件下 高密度大量培养有用动物细胞生产珍贵药品的技术 培养技术 1 细胞悬浮培养法细胞在培养液中呈悬浮状态生长繁殖的培养方法 2 固定化培养方法 将细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术称为细胞固定化培养法 3 微载体培养法将细胞吸附于微载体表面 在培养液中进行悬浮培养 使细胞在微载体表面长成单层的培养方法称为微载体培养法或微珠培养法 动物细胞工程的应用 一 动物细胞工程工业具有特殊功能的蛋白质类物质免疫球蛋白 口蹄疫苗 及 干扰素 二 动物细胞与畜牧业人工采集精卵 人工授精 体外受精 胚胎移植与保存 性别鉴定与控制 以及细胞杂交 三 动物细胞工程的其它应用计划生育 细胞工程 植物细胞培养 植物细胞工程 根据生物学原理及工程学原理 定向改变细胞遗传性 利用植物细胞为人类生产名贵药品及提供服务的技术 植物细胞培养特点 1 植物细胞较微生物细胞大得多 有纤维素细胞壁 细胞耐拉不耐扭 抵抗剪切力差2 培养过程生长缓慢 易受微生物污染 需用抗生素 3 细胞生长的中期及对数生长期 易凝聚为团块 悬浮培养困难 4 培养时需供氧 培养液粘度大 不能耐受强力通风搅拌5 培养细胞产物滞留于细胞内 且产量较低 植物细胞工程的应用 一 植物细胞工程工业1 植物细胞生长植物细胞工业规模的培养首先是细胞生长量的增长 细胞即为重要产品之一人参细胞2 初级及次级代谢产物色素 维生素 植物杀虫剂 生长激素 3 生物转化利用植物培养细胞为酶原使某种前体化合物生成相应产物的技术称为生物转化 二 植物细胞工程与中草药许多名贵药材 如天麻 人参 罂粟及大麻等均采用人工栽培 灭菌sterilization灭菌 采用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中一切有生命机体的过程 如果发酵过程中受到杂菌污染 会产生各种不良后果 具体包括 1杂菌将会和生产菌竞争营养物质 造成原料的损失和产量的下降 2杂菌产生的代谢产物会增加产物的种类 增加分离的难度 降低得率或使产品质量下降 3杂菌的大量繁殖往往会改变发酵液的性质 如pH等发酵参数 从而抑制生产菌的生长和产物的形成 4有的杂菌生长繁殖不消耗基质 而是直接利用目的产物 使发酵生产不能正常进行 5若发生噬菌体污染 生产菌细胞受到破坏 严重的会使培养过程彻底失败导致 倒罐 浪费大量原材料 造成严重的经济损失 而且会扰乱生产秩序 破坏生产计划 一 化学灭菌化学灭菌是用化学药品直接作用于微生物而将其杀死的方法 1 酒精溶液2 甲醛3 漂白粉4 高锰酸钾5 过氧乙酸6 新洁尔灭7 抗生素 二 射线灭菌射线灭菌是利用紫外线 高能电磁波或放射性物质产生的 射线进行灭菌的方法 三 干热灭菌最简单的干热灭菌方法是将金属或其它耐热材料在火焰上灼烧 称为灼烧灭菌法 灭菌迅速彻底 但使用范围有限 多在接种操作时使用 只能用于接种针 接种环等少数对象的灭菌 实验室常用的干热灭菌方法是干热空气灭菌法 采用电热干燥箱作为干热灭菌器 主要用于玻璃器皿 金属器材和其它耐高温物品的灭菌 四 湿热灭菌常用于培养基 发酵设备 附属设备 管道和实验器材的灭菌 湿热灭菌是利用饱和蒸汽进行灭菌 蒸汽冷凝时释放大量潜热 并具有强大的穿透力 在高温和水存在时 微生物细胞中的蛋白质 酶和核酸分子内部的化学键和氢键受到破坏 致使微生物在短时间内死亡 五 过滤除菌 利用过滤的方法阻留微生物 达到除菌的目的 本方法只适用于澄清流体的除菌 工业上利用过滤方法大量制备无菌空气 在产品提取过程中 也可以利用无菌过滤的方法处理料液 以获得无菌产品 几种灭菌方法的特点及适用范围 培养基与发酵设备的灭菌 一 培养基的灭菌方法工业化生产中培养基的灭菌采用湿热灭菌的方式 主要有两种方法 分批灭菌和连续灭菌 1 分批灭菌分批灭菌又称为间歇灭菌 就是将配制好的培养基全部输入到发酵罐内或其它装置中 通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间 再冷却到接种温度 这一工艺过程也称为实罐灭菌 分批灭菌过程包括升温 保温和冷却等3个阶段 培养基分批灭菌过程中温度变化情况 分批灭菌的进汽排汽及冷却水管路系统 2 连续灭菌图连续灭菌时 培养基可在短时间内加热到保温温度 并且能很快地被冷却 保温时间很短 有利于减少培养基中营养物质的破坏 连续灭菌是将培养基通过专门设计的灭菌器 进行连续流动灭菌后 进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式 也称之为连消 培养基连续灭菌的基本流程 间歇灭菌与连续灭菌的比较连续灭菌 优点 灭菌温度高 可减少培养基中营养物质的损失 操作条件恒定 灭菌质量稳定 易于实现管道化和自控操作 避免反复的加热和冷却 提高了热的利用率 发酵设备利用率高 缺点 对设备的要求高 需另外设置加热 冷却装置 操作较复杂 染菌的机会较多 不适合于含大量固体物料的灭菌 对蒸汽的要求较高 间歇灭菌 优点 设备要求较低 不需另外设置加热 冷却装置 操作要求低 适于手动操作 适合于小批量生产规模 适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌 缺点 培养基的营养物质损失较多 灭菌后培养基的质量下降 需进行反复的加热和冷却 能耗较高 不适合于大规模生产过程的灭菌 发酵罐的利用率较低 影响培养基灭菌的因素 1 培养基成分2 培养基成分的颗粒度3 培养基的pH4 微生物细胞含水量5 微生物性质与数量6 冷空气排除情况7 泡沫8 搅拌 1 培养基成分培养基中的油脂 糖类和蛋白质会增加微生物的耐热性 使微生物的受热死亡速率变慢 这主要是因为有机物质会在微生物细胞外形成一层薄膜 影响热的传递 所以灭菌温度就应提高或延长灭菌时间 例如 大肠杆菌在水中加热至60 65 便死亡 在10 糖液中 需70 加热4 6min 在30 糖液中 需70 加热30min 但灭菌时 对灭菌效果和营养成分的保持都应兼顾 既要使培养基彻底灭菌又要尽可能减少对培养基营养成分的破坏 相反培养基中高浓度的盐类 色素会减弱微生物细胞的耐热性 一般较易灭菌 2 培养基成分的颗粒度培养基成分的颗粒越大 灭菌时蒸汽穿透所需的时间越长 灭菌难 颗粒小 灭菌容易 一般对小于1mm颗粒的培养基 可不必考虑颗粒对灭菌的影响 但对于含有少量大颗粒及粗纤维的培养基 特别是存在凝结成团的胶体时 则应适当提高灭菌温度或过滤除去 3 培养基的pHpH值对微生物的耐热性影响很大 微生物一般在pH值6 0 8 0时最耐热 pH值 6 0 氢离子易渗入微生物细胞内 从而改变细胞的生理反应促使其死亡 培养基pH值愈低 灭菌所需的时间愈短 4 微生物细胞含水量微生物含水量越少 蛋白质不易变性 所需灭菌时间越长 孢子 芽孢的含水量少 代谢缓慢 要很长时间的高温才能杀死 但如果是含水量很高的物品 高温蒸汽的穿透效果会降低 所以也要延长灭菌时间 5 微生物性质与数量各种微生物对热的抵抗力相差较大 细菌的营养体 酵母 霉菌的菌丝体对热较为敏感 而放线菌 酵母 霉菌孢子对热的抵抗力较强 处于不同生长阶段的微生物 所需灭菌的温度与时间也不相同 繁殖期的微生物对高温的抵抗力要比衰老时期抵抗力小得多 这与衰老时期微生物细胞中蛋白质的含水量低有关 芽孢的耐热性比繁殖期的微生物更强 在同一温度下 微生物的数量越多 则所需的灭菌时间越长 因为微生物在数量比较多的时候 其中耐热个体出现的机会也越多 天然原料尤其是麸皮等植物性原料配成的培养基 一般含菌量较高 而用纯粹化学试剂配制成的组合培养基 含菌量较低 6 冷空气排除情况高压蒸汽灭菌的关键问题是为热的传导提供良好条件 而其中最重要的是使冷空气从灭菌器中顺利排出 因为冷空气导热性差 阻碍蒸汽接触欲灭菌物品 并且还可减低蒸汽分压使之不能达到应有的温度 如果灭菌器内冷空气排除不彻底 压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽的压力 还有空气的分压 罐内的实际温度低于压力表所对应的温度 造成灭菌温度不够 7 泡沫在培养基灭菌过程中 培养基中产生的泡沫对灭菌很不利 因为泡沫中的空气形成隔热层 使热量难以渗透进去 不易杀死其中潜伏的微生物 因而无论是分批灭菌还是连续灭菌 对易起泡沫的培养基均需加消泡剂 以防止或消除泡沫 8 搅拌在灭菌的过程中进行搅拌是为了使培养基充分混匀 不至于造成局部过热或灭菌死角 在保证不过多的破坏营养物质的前提下达到彻底灭菌的目的 发酵设备的灭菌发酵设备的灭菌包括发酵罐 管道和阀门 空气过滤器 补料系统 消沫剂系统等的灭菌 通常选择0 15 0 2MPa的饱和蒸汽 这样既可以较快使设备和管路达到所要求的灭菌温度 又使操作安全 空气净化的方法 一 热杀菌空气加热杀菌属于干热杀菌 是基于加热后微生物体内的蛋白质 酶 氧化变性而致死亡 培养基灭菌则是湿热灭菌 是利用蛋白质 酶 的凝固作用而致使菌体死亡 二 辐射杀菌辐射杀菌技术是指利用电磁射线 加速电子照射被杀菌的对象从而杀死微生物的一种杀菌技术 三 静电除菌静电除菌的特点是能量消耗少 但是设备庞大静电除菌原理是使空气中的灰尘成为载电体 然后将其捕集在电极上 通过这种静电引力吸附带电粒子而达到除菌除尘的目的 静电除菌一般除菌效率在85 99 除菌效率达不到无菌要求 只能作为初步除菌 至今工业上的空气除菌几乎都是采用过滤除菌 四 过滤除菌 过滤除菌法是让含菌空气通过过滤介质以阻截空气中所含微生物 而取得无菌空气的方法 介质过滤除菌的原理 1 惯性撞击截留作用 2 拦截截留作用3 布朗扩散截留作用4 重力沉降作用5 静电吸引作用 空气除菌设备流程图1 粗过滤器 2 压缩机 3 贮罐 4 6 冷却器 5 旋风分离器 7 丝网除沫器 8 加热器 9 空气过滤器 无菌空气的检查 一 光学检查法利用微粒对光线的散射作用来测量空气中粒子的大小和数量 不是活菌数 二 肉汤培养基检查法取无菌空气 见图 连续取气数小时或十几小时 卸下橡皮管 用无菌纸包扎好管的末端 置于37 培养箱培养16h 若出现混浊 表明空气中有杂菌 检查无菌空气的装置示意图 过滤除菌的介质材料 1 棉花棉花是最早使用的过滤介质 棉花随品种的不同 过滤性能有较大的差别 一般选用细长纤维且疏松的新棉花为过滤介质 同时是未脱脂的棉花 脱脂棉花易于吸水而使体积变小 压缩后仍有弹性 2 玻璃纤维作为散装充填过滤器的玻璃纤维 玻璃纤维的过滤效率随填充密度和填充厚度增大而提高 玻璃纤维充填的最大缺点是 更换过滤介质时易造成碎末飞扬 使皮肤发痒 甚至出现过敏现象 3 活性炭活性炭具有非常大的表面积 通过吸附作用捕集微生物 要求活性炭质地坚硬 不易被压碎 颗粒均匀 目前常与棉花联合使用 即在二层棉花中夹一层活性炭 以降低滤层阻力 活性炭的好坏还决定于它的强度和表面积 表面积小 则吸附性能差 过滤效率低 强度不足 则很容易破碎 堵塞孔隙 增大气流阻力 它的用量约为整个过滤层的1 3 1 2 4 超细玻璃纤维纸纤维特别细小 不宜散装充填 而采用造纸的方法做成0 25 1mm厚的纤维纸 它所形成的网格空隙为0 5 5 m 比棉花小10 15倍 故具有较高的过滤效率 酶反应器 酶的基本特点 1 酶作为催化剂的共性 降低反应的活化能加快反应速率不能改变反应的平衡常数 只能加快反应达到平衡的速度 酶的生物催化特性 1 酶有很强的专一性2 较高的催化效率 酶促反应的特性 优点 1 酶促反应是在常温 常压 中性范围内 个别除外 条件下进行的 与一些化学反应相比 省能且效率较高 2 由于酶促反应的专一性 没有或少有副产物生成 有利于提取操作 反应体系较简单 反应过程的最适条件易于控制 缺点 酶促反应多限于一步或几步较简单的生化反应过程 但经济上有时并不理想 虽然酶促反应条件比较温和 但一般周期较长 因此 增加了染菌的可能 固定化酶技术 将水溶性的酶分子通过一定的方式 如静电吸附 共价键等与载体 如离子交换树脂等材料结合 制成固定酶的技术 固定化后酶的性质发生变化主要表现在 1 底物专一性发生改变2 稳定性增强3 最适pH值和温度的变化4 动力学常数的变化 固定化酶在酶促反应过程中具有如下优点 1 极其容易和反应产物分开 因而可加以回收2 在一定程度上可以改善酶的操作性能的稳定性3 可以多次反复使用和有利于采用连续操作工艺 使得酶的使用率提高 降低生产成本4 酶不混入产物 可精简产物分离工序 反应器简介 机械搅拌通风发酵罐 一 发酵罐参数设计1 小型机械搅拌通风发酵罐小型机械搅拌通风发酵罐主要是供实验室小试 中试使用和用作种子罐 其容积为1 20000L 2 大型机械搅拌通风发酵罐工业生产用的发酵罐日趋大型化 大型发酵罐提高了吨罐容的生产量 减少了能源消耗 节约生产成本 便于自动化控制 国外的大发酵罐容积已经在600m3以上 二 塔式发酵罐塔型发酵罐又称柱式发酵罐 鼓泡塔或空气搅拌高位发酵罐等 它是一种由气流来进行搅拌的发酵装置 与机械搅拌发酵罐相比 它具有结构简单 能耗低 维修简便 清洗方便 不易染菌以及适用于大规模生产等优点 机械搅拌自吸式发酵罐的设计要点 1 发酵罐的高径比由于自吸式发酵罐是靠转子转动形成的负压而吸气通风的 吸气装置是沉浸于液相的 所以为保证较高的吸风量 发酵罐的高径比H D不宜取大 且罐容增大时 H D应适当减少 以保证搅拌吸气转子与液面的距离为2 3m 2 转子的确定三棱叶转子的特点是转子直径较大 一般等于发酵罐直径的0 35倍 在较低转速时可获得较大的吸气量 当罐压在一定范围内变化时 其吸气量也比较稳定 吸程 即液面与吸气转子距离 也较大 但所需的搅拌功率也较高 通风固相发酵设备 固体发酵罐采用优质不锈钢罐体 无死角 容易清洗 耐腐蚀 使用寿命长 搅拌方式独特 机械传动效率高 功率消耗少 其主要特点为 1 占地面积小 物料能在罐内蒸煮 灭菌 降温 罐内接种 罐内喷淋加湿 自动翻料等 可进行通气操作 2 广泛应用于菌体蛋白 散曲 纤维素酶 淀粉酶 生物肥料以及生物饲料等许多方面 3 能进行固体发酵以及固体与液体混合的发酵 厌氧发酵设备 一 酒精发酵罐 一 发酵罐的结构1 基本结构 酒精发酵罐筒体为圆柱形 底盖和顶盖均为碟形或锥形的立式金属容器 罐顶装有废汽回收管 进料管 按种管 压力表 各种测量仪表接口管及供观察清洗和检修罐体内部的人孔等 罐底装有排料口和排污口对于大型发酵罐 为了便于维修和清洗 往往在近罐底也装有人孔 罐身上下部装有取样口和温度计接口 2 发酵罐制作材料用于制作酒精发酵罐的材料从木材 水泥 碳钢钢板发展到目前的不锈钢钢板 3 发酵罐容积酒精发酵罐的容积从1m3起 渐次升为2m3 5m3 10m3 20m3 40m3 60m3 75m3 120m3 160m3 200m3 240m3 430m3 500m3 650m3 700m3 1500m3 2000m3 2800m3 3000m3 3800m3 4200m3 随着对发酵罐功能的深入理解和工艺生产实践经验的增加 现在大型酒精发酵罐都已经到酒精厂现场制作 制作的质量也不断提高 不仅罐容已突破4200m3 发酵罐布局的合理性也容易做到 4 发酵罐形状酒精发酵罐的几何形状有 碟形封头圆柱形发酵罐 锥形发酵罐 圆柱形斜底发酵罐 圆柱形卧式发酵罐 目前常见的600m3以下发酵罐多设计为锥形发酵罐 超过600m3容积的发酵罐多设计为圆柱形斜底发酵罐 目前美国最大的圆柱形斜底酒精发酵罐 容积已达4200m3 发酵罐的形状从通用碟形发酵罐发展到锥形 底 发酵罐和斜底大容积发酵罐碟形发酵罐是早期发酵罐的基本形状 由于醪液排出不如锥形发酵罐顺畅 加之制作大容积碟形发酵罐封头比锥形罐锥体难度大 所以现在大型发酵罐已很少有碟形发酵罐设计 锥形罐由于对支撑地基强度要求高 所以目前还很难做到超过800m3的锥形发酵罐 斜底发酵罐由于地基基础容易处理 只要把斜底角度处理适当 美国斜底发酵罐罐底斜面角度设计较大 为15 20 我国华润酒精公司1500m3斜底发酵罐罐底斜面角度设计仅3 角度偏小 发酵罐罐底处理平坦光滑 也相当于变形的锥形发酵罐 三种不同形状的发酵罐 单位mm a 斜底发酵罐b 锥形发酵罐c 碟形发酵罐 发酵罐容积由小变大 已由厂房内小发酵罐发展为露天大发酵罐 小型发酵罐的降温设施是靠罐内蛇管或列管 由于蛇管和列管管线长清洗困难易染杂菌 降温效果随罐体变大而变差 特别是列管在罐内离不开高温灭菌环节 费时 消耗蒸气能源 美国大型斜底 15 左右 发酵罐 3000m3以上 结构示意图 发酵罐结构尺寸与级数的确定 1 发酵罐全容积的计算式中 V 发酵罐的全容积 米3 V0 发酵罐中的装液量 米3 装液系数 一般取0 85 0 90 带有锥形底 盖的圆柱形发酵罐全容积为 式中D 罐的直径 米 H 罐的圆柱部分高度 米 h1 罐底高度 米 h2 盖高度 米 斜底发酵罐全容积为 D 罐的直径 米 H 罐的圆柱部分高度 米 h 斜底高度 米 二 发酵罐灭菌大型发酵罐由于容积很大 500 4200m3 用高压蒸气灭菌已不可能 化学灭菌已很好地代替了高压蒸气灭菌且化学灭菌成本低 操作工时短 这一技术应该说是源于啤酒发酵的灭菌方法 灭菌要点是按顺序先用清水冲洗发酵罐罐壁 然后用低浓度碱水 NaHCO3 NaOH等 冲洗 接着用低浓度HCl溶液 柠檬酸等冲洗 最后用清水冲洗 这一灭菌方法的效果在于发酵罐罐壁是否平整和光滑 高压喷射器喷枪压力 角度和喷射距离及冲洗是否均匀彻底 因为发酵罐容积巨大 需多喷头自控伸缩喷射管系统才行 这一化学灭菌方式称为CIP自动冲洗系统 其中碱液 酸液都设计为回收重复使用 既节约又环保 只需要定期检查碱液和酸液的浓度并及时调整即可 实施这种化学灭菌后辅以高效紫外灭菌系统效果将更好 三 发酵罐降温大型发酵罐由于罐容大 产生CO2数量多 发酵罐已由开口变为封闭 这样既便于回收CO2及被CO2夹带的酒精蒸气 又可减轻因排不出CO2和伴随CO2逸出带走酒精对发酵过程的负面影响 对提高产酒率 减少染菌都有好处 设计优良的大型发酵罐外壁已有降温用水夹层 夹层降温不仅降温效果优于罐内蛇管 而且还可以完全避免因设蛇管造成杂菌的积存和扩繁 新型薄板换热器和螺旋板换热器的配备既可及时配合发酵罐夹层快速降温 又可起到均质均菌 酵母菌 的作用 对于提高发酵水平 起到不可缺少的辅助作用 换热器已成为大型发酵系统必不可少的降温设备 因为在大型连续发酵过程中已不存在升温的问题了 新型换热器在大型发酵罐的成功应用很容易使酵母菌在最适的温度下增殖和产生酒精 可以说没有换热器就不可能实现大罐连续发酵 换热器亦称热交换器