蛋白质分离纯化技术

第二章蛋白质的分离与纯化 1 第二章蛋白质的分离与纯化 一 蛋白质的测定技术紫外分光光度法比色法二 蛋白质的分离提取蛋白质材料的处理蛋白质的粗分离蛋白质的纯化三 蛋白质的结构解析 2 一 蛋白质的测定技术 3 定义 蛋白质浓度或含量的测定方法 凯氏定氮法紫外分光光度法比色法双缩尿法 Biuret法 Folin 酚试剂法 Lowry法 考马斯亮蓝法 Bradford法 BCA法 4 测定蛋白质含量的是我们研究蛋白质功能等方面的基础 这种技术也广泛应用于食品质量检测方面等 在选择方法时应考虑 实验对测定所要求的灵敏度和精确度 蛋白质的性质 溶液中存在的干扰物质 测定所要花费的时间 5 一 凯氏定氮法 KieldahlMethod 测定蛋白质含量的经典方法 目前测定蛋白质含量的标准方法 测定试样中总有机氮最准确和重现性最好的方法之一 原理 蛋白质的含氮量约16 含氮量因构成蛋白质的氨基酸残基的不同有所差别 在14 19 之间 测定蛋白质样品的含氮量 乘以6 25即为蛋白质的含量 以蛋白质平均含氮量16 计算 6 测定分两步 用沸浓硫酸消化 并以硫酸铜为催化剂 使碳 氢分别以二氧化碳及水蒸汽形态逸去 而氮转为铵盐 此过程需时较长 可达数小时 加碱 并将氨自碱液中蒸至标准酸液中 测定中和氨所消耗的酸量 计算出样品中含氮量 再乘以6 25 经验平均值 则得蛋白质含量 7 反应 以甘氨酸为例CH2COOH 3H2SO4 2CO2 3SO2 4H2O NH3 1 NH22NH3 H2SO4 NH4 2SO4 2 NH4 2SO4 2NaOH 2H2O Na2SO4 2NH3 3 硫酸铜为催化剂 促进有机含氮化合物分解完全 K2SO4以提高溶液的沸点 290oC提高到400oC 收集氨可用硼酸溶液 滴定则用强酸 8 特点 时间较长 蛋白质中含氮量通常并不确定 因为不同蛋白质含氮量不相同 使得计算所得蛋白质量只是具有相当误差的近似值 若欲得精确值 需预先将蛋白质分离 可以以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质 当有其他含氮化合物时有干扰 凯氏法有常量法 半微量法及微量法 可测样品含氮量为0 10mg以下 9 二 紫外分光光度法 紫外 或可见 分光光度法 以溶液中物质的分子或离子对紫外 或可见 光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法 朗伯 比耳定律 A lg 1 T KbcA为吸光度 T为透射比 是透过光强度比上入射光强度 c为吸光物质的浓度 b为吸收层厚度 物理意义 当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时 其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比 10 紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理1 蛋白质分子中 酪氨酸和色氨酸残基含有共轭双键 使蛋白质具有吸收近紫外光的性质 吸收高峰在280nm处 其吸光度 即光密度值 与蛋白质含量成正比 2 蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比 利用一定波长下 蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系 可以进行蛋白质含量的测定 11 紫外分光光度法 标准曲线 以标准蛋白的吸光度A为纵坐标 其浓度c为横坐标的标准曲线 测出被试液的吸光度 就可以由标准曲线查得对应的浓度值 即未知样的含量 分光光度法测量图 12 常用的方法 四种 A280法因蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收 且各种蛋白质的这两种氨基酸的含量差别不大 因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法 测定时 将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中 用配制蛋白质溶液的溶剂 水或缓冲液 作空白对照 在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280 蛋白质浓度可控制在0 1 1 0mg ml左右 通常用1cm光径的标准石英比色皿 盛有浓度为1mg ml的蛋白质溶液时 A280约为1 0左右 由此可立即计算出蛋白质的大致浓度 许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值有文献数据可查 A238法 肽键测定法 蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱 与肽键的多少成正比 因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50 500mg ml已知浓度的5 0ml蛋白质溶液 测定238nm的光吸收值A238 以A238为纵座标 蛋白质含量为横座标 绘制出标准曲线 未知样品的浓度即可由标准曲线求得 13 A280与A260吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收 在280nm和260nm处都有吸收 其吸收高峰在260nm附近 含有核酸的蛋白质溶液 可分别测定其A280和A260 由此吸收差值 用下面的经验公式 即可算出蛋白质的浓度 蛋白质浓度 1 45 A280 0 74 A260 mg ml A215与A235吸收差法215nm和235nm光吸收差值在一定范围与蛋白质浓度成正比 用215nm和235nm光吸收差值与单一波长测定相比 可减少非蛋白质成分引起的误差 对稀溶液中蛋白质浓度测定 可选用215nm和235nm光吸收差法 干扰物质的影响较多 14 优点 紫外吸收法简便 灵敏 快速 不消耗样品 测定后仍能回收使用 缺点 1 测定蛋白质含量的准确度较差 干扰物质多 在用标准曲线法测定蛋白质含量时 对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质 有一定的误差 故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质 2 若样品中含有嘌呤 嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质 会出现较大的干扰 核酸的干扰可以通过查校正表 再进行计算的方法 加以适当的校正 3 蛋白质的最大吸收波长因pH的改变而有变化 15 三 比色法 colorimetry 定义 以生成有色化合物的显色反应为基础 通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法 比色分析对显色反应的基本要求 1 反应应具有较高灵敏度和选择性 2 反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定 3 反应生成的有色化合物和显色剂的颜色差别较大等 理论基础 朗伯 比尔定律 A Kbc 16 一 双缩脲法 Biuret法 原理 双缩脲 NH2CONHCONH2 是两个分子脲经180 左右加热 放出一个分子氨后得到的产物 在强碱性溶液中 双缩脲与CuSO4形成紫色络合物 540nm 称为双缩脲反应 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键 或能通过一个中间碳原子相连的肽键 这类化合物都有双缩脲反应 17 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比 而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关 故可用来测定蛋白质含量 测定范围为1 10mg mL蛋白质 干扰物质 硫酸铵 Tris缓冲液和某些氨基酸等 18 双缩脲法 Biuret法 过程 标准曲线的测定 取12支试管分两组 分别加入0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0毫升的标准蛋白质溶液 用水补足到1毫升 然后加入4毫升双缩脲试剂 充分摇匀后 在室温 20 25 下放置30分钟 于540nm处进行比色测定 用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液 取两组测定的平均值 以蛋白质的含量为横座标 光吸收值为纵座标绘制标准曲线 样品的测定 取2 3个试管 用上述同样的方法 测定未知样品的蛋白质浓度 注意样品浓度不要超过10mg ml 19 双缩脲法 Biuret法 特点 较快速 不同的蛋白质产生颜色的深浅相近 以及干扰物质少 主要的缺点是灵敏度差 因此双缩脲法常用于需要快速 但并不需要十分精确的蛋白质测定 20 二 Folin 酚试剂法 Lowry法 实验原理 蛋白质中的肽键在碱性条件下与Cu2 反应 生产紫红色蛋白质 Cu2 复合物 这一复合物中的氨基酸残基 主要是酪氨酸 色氨酸 半胱氨酸 还原Folin 酚试剂中的磷钼酸盐 磷钨酸盐 产生钼兰和钨兰复合物的深兰色 745 750nm 颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比 此法中由于加入Folin 酚试剂强化了双缩脲反应 增加显色量 灵敏度为双缩脲法的100倍 Folin 酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤 以后在生物化学领域得到广泛的应用 21 Folin 酚试剂法 Lowry法 优点 灵敏度高 比双缩脲法灵敏得多 缺点 1 费时间较长 要精确控制操作时间 显色随时间不断加深 2 标准曲线也不是严格的直线形式 干扰物质较多 由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸 色氨酸和半胱氨酸 显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化 因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度 相对于标准蛋白质 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定 此法可检测的最低蛋白质量达5 g 通常测定范围是20 250 g 22 Folin 酚试剂法 Lowry法 注意 对双缩脲反应发生干扰的离子 同样容易干扰Lowry反应 而且对后者的影响还要大得多 如酚类 柠檬酸 硫酸铵 Tris缓冲液 甘氨酸 糖类 甘油等均有干扰作用 浓度较低的尿素 硫酸纳 硝酸纳 三氯乙酸 乙醇 乙醚 丙酮等溶液对显色无影响 但这些物质浓度高时 必须作校正曲线 测定时 加Folin 酚试剂时要特别小心 因为该试剂仅在酸性条件下稳定 上述还原反应只在pH 10的情况下发生 故当Folin 酚试剂加到碱性的铜 蛋白质溶液中时 须立即混匀 以便在磷钼酸 磷钨酸试剂被破坏之前 还原反应即能发生 23 三 考马斯亮蓝法 Bradford法 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法 Bradford法 是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的 这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点 因而正在得到广泛的应用 24 实验原理 考马斯亮兰G 250染料 在酸性溶液中与蛋白质结合 使染料的最大吸收峰的位置 max 由465nm变为595nm 溶液的颜色也由棕黑色变为兰色 经研究认为 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 特别是精氨酸和赖氨酸 和芳香族氨基酸残基相结合 在595nm下测定的吸光度值A595 与蛋白质浓度成正比 25 考马斯亮兰G 250 考马斯亮蓝法 Bradford法 优点 1 灵敏度高 比Lowry法约高四倍 其最低蛋白质检测量可达1 g 这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大 光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多 2 测定快速 简便 只需加一种试剂 完成一个样品的测定 只需要5分钟左右 由于染料与蛋白质结合的过程 大约2分钟即可完成 其颜色可以在1小时内保持稳定 3 干扰物质少 如干扰Lowry法的K Na Mg2 离子 Tris缓冲液 糖和蔗糖 甘油 巯基乙醇等均不干扰此测定法 26 考马斯亮蓝法 Bradford法 缺点 1 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同 因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差 2 仍有一些物质干扰此法的测定 如 去污剂 TritonX 100 十二烷基硫酸钠 SDS 等 注意 不可使用石英比色皿 因不易洗去染色 校正 0 05mg mlBSA溶液的A595约为0 29 27 四 二奎琳甲酸法BCA bicinchoninicacid 法 原理 Bicinchoninicacid BCA 法是近来广为应用的蛋白定量方法 其原理与Lowery法蛋白定量相似 即在碱性环境下蛋白质与Cu2 络合并将Cu2 还原成Cu1 BCA与Cu1 结合形成稳定的紫蓝色复合物 在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比 据此可测定蛋白质浓度 28 BCA 与Lowery法相比 BCA蛋白测定方法灵敏度高 操作简单 试剂及其形成的颜色复合