抗冻基因cbf2表达载体构建及转化紫花蓿.doc

抗冻基因CBF2表达载体构建及转化紫花蓿摘要: 以拟南芥基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-T Easy Vector载体上构建成克隆载体T-CBF2。用BamH和Sac分别对克隆载体T-CBF2和植物表达载体PBI121进行双酶切,获得目的片段和线性质粒。在T4DNA连接酶的作用下进行定向连接,构建成植物表达载体P-T-CBF2。采用直接转化法将重组子导入根癌农杆菌EHA105。关键词: 抗冻基因CBF2;载体构建;农杆菌;紫花苜蓿;转化正 文： CBFs(冷诱导基因)由一个小的基因家族编码,包含3个成员CBF1、CBF2和CBF3,3个基因都聚集在拟南芥的4号染色体短臂上,紧密连锁在一起,均可在冷胁迫下迅速诱导表达。CBF这一冷驯化关键调节基因的发现,对植物逆境胁迫生理和抗逆植物基因工程研究产生了一定影响。CBF在植物中是相当保守的,即使是对冻害敏感的番茄(Lycopersicon esculentum),也存在具功能的CBF基因。另外,过量表达CBF除了提高拟南芥(Arabidopsis thaliana)抗冻能力外,也增强了拟南芥对干旱和盐的抗性,因此CBF可作为农作物抗逆基因工程的重要基因。苜蓿，为温带地区重要的牧草,是重要的饲料农作物,低温是制约其生长的限制因子之一,因此抗冻基因导入苜蓿是具有重大的生态效益和经济效益的。期待通过CBF2单基因的导入显著提高苜蓿对低温的适应能力,使优良苜蓿在高寒气候区的种植成为现实,也为今后转化其他经济作物,利用CBF2基因综合改良这些作物的抗逆性奠定基础。1材料与方法1.1供试材料：和田苜蓿(Medicago sativacv. Hetian)；大肠杆菌(Escherichia coli)DH5、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105、PBI121载体; 质粒pGEM-T Easy Vector限制性内切酶、 T4DNA连接酶及高保真DNA聚合酶。1.2.CBF2基因组DNA的提取用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法8,略加修改。取培养15 d的拟南芥无菌苗。（1) 称取200 mg叶片,在液氮处理下,在研钵中研磨成粉末状。（2) 2 mL离心管中加入800L 65预热的CTAB提取缓冲液、80L无水乙醇,颠倒离心管,使叶片粉末与提取缓冲液充分混合均匀,置于65恒温水浴中30 min,每隔5 min颠倒离心管数次。（3) 30 min后取出离心管自然冷却至室温,412 000 r/min离10 min。（4) 吸取上层清液于另一离心管,加入等体积的氯仿,颠倒混匀,在室温下12 000 r/min离心10 min。(5) 转移上层清液至另一新的离心管中,加入2倍体积冰预冷的无水乙醇,轻轻混匀。于-20下放置30min,使DNA充分缠绕成团。（6) 将上述有絮状沉淀的DNA离心,412 000 r/min,离心10 min,倒掉上清液。（7) 挑取絮状沉淀,加入70%乙醇清洗2次。风干,最后加入100L TE(10 mmol/L, pH 8.0 Tris-HCl,1 mmol/L EDTA)缓冲液充分溶解DNA沉淀。（8) -20下贮存备用。1.3PCR(polymerase chain reactoin,聚合酶链式反应)根据Gene Bank的CBF2cDNA已知序列,设计合成1对引物9,10,并根据构建植物表达载体的需要在引物5端分别引入了BamH和Sac的酶切位点。正向:5-GC GGATCC ATGAACTCAT TTTCTGCCTTTTCTG-3,反向:5-GC GAGCTC TTAATAGCTC CATAAGGACA CGTCA-3,以CBF2基因组DNA为模板。反应程序:943 min(9430 s5730 s721 min)30(此步骤为30个循环)7210 min。热启动法加酶。所用酶为Taq Plus DNA Polymerase(Taq+Pfu) PCR仪为Mini CyclerTM(基因扩增仪)。1.4目的片段的纯化回收对PCR产物开展琼脂糖凝胶电泳,用DNA快速纯化回收试剂盒回收目的片段具体操作按产品说明书进行。1.5克隆载体的构建所用载体为PGEM-T Easy Vector(T载体系统),该载体专为PCR产物的克隆而设计,具有氨苄青霉素抗性标记,可以进行蓝白筛选,便于进行酶切鉴定和测序。连接反应体系: 3L纯化后的PCR产物+2L 10Ligation Buffer(连接缓冲液)+1L(50 mg/L) PGEM-T Easy Vector+1L T4DNA Ligase(连接酶)。在16条件下连接过夜。1.6感受态细菌的制备及转化感受态细菌的制备:（1) 在LB(培养基)平板上挑取新活化的大肠杆菌DH5接种于5 mL LB液体培养基中,37280 r/min震荡培养过夜(14-16 h)。（2) 取500L上述菌液转移到50 mL LB三角瓶中(占1%左右),震荡培养3 h(OD620=0.30.4)。吸取1mL菌液于2 mL离心管中,冰浴10 min。（3) 4,4 000 r/min离心10 min,去上清。(4) 加入500L 0.1 mol/L冰冷的氯化钙,重悬沉淀,冰浴40min。 （5) 4,4 000 r/min离心10 min,去上清。（6) 加入100L 0.1 mol/L冰冷的氯化钙,重悬沉淀。（7) 4存放24 h,-20保存备用。转化:(1) 取5L连接产物,加入100L感受态细胞,混匀(用枪轻轻吸打几次),冰浴40min。(2) 42热击90 s。(勿动)(3) 迅速将离心管转移至冰上,冰浴5 min。(勿动)(4) 加入400L LB液体培养基,混匀,37,200 r/min震荡培养1 h。(5) 取100L菌液,用无菌涂布器涂布于含X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)、IPTG(异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷)、AMP(氨苄)的LB固体培养基上。(6) 将平板置于室温直至液体被完全吸收后倒置培养皿,37培养过夜(20 h)。1.7重组质粒的鉴定在直径9 cm的培养皿上共生成约70个白色菌落,随机挑取2个白色菌落,分别接种于2 mL LB液体培养基中,在37,280 r/min条件下震荡培养过夜,转接于8 mL LB中震荡培养。按碱裂解法小量提取质粒16。以质粒DNA为底物用BamH和Sac进行双酶切鉴定。双酶切反应体系为质粒DNA 15L+10Buffer 2L+ BamH1L+ Sac1L,37, 4 h 。1.8植物表达载体的构建植物表达载体PBI121(工程质粒)是从结瘤农杆菌双元质粒衍生而来,系一组成性表达载体,大小14 kb,多克隆位点上游带有CaMV 35S(花椰菜病毒启动子)启动子,下游带有GUS(-葡萄糖苷酸酶基因)报告基因;在NOS(胭脂碱合酶基因启动子)启动子下游带有NPT(KAN抗性基因)基因,可进行Kanamycin(Kan,卡那霉素)抗性筛选。CBF2植物表达载体的构建过程见图1(图中:Ori V:是在营养时期,即游离在细胞质中独立复制时的复制起点;ColE1 ori:大肠杆菌质粒复制起始点;NOS:胭脂碱合酶基因启动子;npt-:KAN抗性基因;NOS-ter:胭脂碱合酶基因终止子;CaMV35S:花椰菜病毒启动子)。分别对重组质粒T-CBF2、PBI121进行BamH和Sac双酶切,纯化回收。回收的线性PBI121和CBF2基因片段经电泳定量后,在T4DNA Ligase(连接酶)作用下进行定向连接,连接反应体系为CBF2DNA 5L+PBI121 2L+10Buffer 5L+T4DNA Ligase 1L,16连接22 h17,18。连接后对感受态细菌进行转化,在转化过程的培养基中添加Kan 100 mg/L1.9植物表达载体的鉴定在添加Kan 100 mg/L的筛选培养基上随机挑取转化菌落,提取重组质粒的DNA,分别进行PCR鉴定、BamH和Sac双酶切鉴定。1.10农杆菌的转化根癌农杆菌感受态细胞的制备。（1) 将农杆菌EHA105(农杆菌菌株)接种于YEB (基本培养基)固体培养基上,YEB+50 mg/L Str(链霉素)+25 mg/L Rif(利福平),YEP为50 mL,50 mg/L Str为100L,10 mg/L Rif为25L。28培养2436 h。（2) 挑取新活化的农杆菌单菌落接种于5 mL YEB液体培养基上(YEB+Str+Rif),28,200 r/min震荡培养2436 h。（3) 吸取1 mL农杆菌培养液(150或1100)接种于50 mL(YEB+Str+Rif)中,28,200 r/min震荡培养68 h,测OD600=0.30.5。（4) 吸取上述菌液转入2 mL离心管中,常温5 000 r/min,5 min去上清,收集菌体。(5) 将菌体垂悬于2 mL 0.02 mol/L CaCl2中常温5 000 r/min,5 min去上清,收集菌体( 重复2次)用200L20 mmol/L CaCl2溶液垂悬。（6) 液氮速冻1 min。（7) - 70冰箱保存。液氮冻融法直接转化农杆菌（1）新鲜制备的农杆菌感受态细胞或-70保存的2管农杆菌感受态细胞置于室温下融化。（2）2管200L的农杆菌菌液中,其中一管加入1g(510L)质粒DNA,另一管加入510L无菌水作对照,轻弹混匀,冰浴30 min。（3 )置于液氮中速冻1 min,迅速取出,37水浴保温35 min融化细胞。（4 )溶解完全后加入800L YEB液体培养基,28,200 r/min培养6 h。（5) 4,5 000 r/min离心3 min,弃上清,仅留下约50L的菌液。（6) 将菌液均匀涂布于(YEB+50 mg/L Str +25 mg/L Rif+50 mg/L Kana)平板上,28,培养23 d。在平板上可以看到转化了质粒的农杆菌单菌落,等菌落长至一定大小,4保存。1.11转化菌的鉴定挑取转化农杆菌的单菌落接于2 mL YEP培养液(含Str 50 mg/L,Rif 25 mg/L ,Kan 100 mg/L),28,200r/min震荡培养18 h,转接于10 mL YEB(抗生素同上)中培养。以碱裂解法提取质粒。PCR鉴定转化菌:以转化菌的质粒DNA 1L为模板,反应体系25L 。1.12苜蓿遗传转化设置Kan浓度梯度(mg/L):30,40,50,60,70,80,90,100;延迟选择天数梯度(d):0,5,10,15,20。进行完全区组试验。苜蓿种子用无菌水浸泡,酒精和升汞消毒后在含3%蔗糖的MS固体培养基上无菌培养。切下7 d龄子叶,在愈伤培养基MS1MS+2 mg/L 2,4-D+0.3 mg/L KT(激动素)上预培养3 d, 在活化的农杆菌EHA105(P-T-AFP+EHA105)菌液中浸染10 min, 在MS1培养基上和黑暗条件下共培养3 d, 然后转入筛选培养基MS2MS1+60 mg/L Kan+400 mg/L Carb(羧苄青霉素)中筛选抗性愈伤组织,且每2周更换1次培养基。选取生长状态良好,结构紧凑,长有绿色芽点的愈伤组织进行PCR鉴定。参考文献：1傅荣昭,孙勇如,贾士荣.植物遗传转化技术手册M.北京:中国科学技术出版社, 1994: 133-134.2王志勇,袁学军,刘建秀,等.狗牙根SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选J.草业学报, 2008, 17(3): 79-85.3翟中会,陈希南,王娟.利用PrimerPremier 5. 0进行引物设计J.西北医学教育, 2008, 16(4): 695-698.4朱青,宋波涛,柳俊,等.拟南芥低温诱导cor15a基因的启动子克隆及在转基因马铃薯中的表达J.农业生物技术学报,2004, 12(5): 500-504.5胡清泉,王奇峰,李昆志,等.烟草柠檬酸合成酶基因的克隆及其光诱导型植物表达载体的构建J.草业学报, 2009,18(4): 161-167.6张金文,熊春蓉,李静雯,等.臭鼻杆菌腈水解酶基因(bxn)的克隆及其在原核生物中的表达J.草业学报, 2006, 15(6):87-92.7 段红英,丁笑生.拟南芥DREB2A基因的克隆及植物荧光表达载体的构建J.华北农学报, 2008, 23(3): 20-22.8萨姆布鲁