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扩张床吸附技术研究进展 摘要：扩张床吸附层析技术兼有流化床和填充床层析的优点 ,不需预先除去料液中的颗粒而可以直接从料液中吸附目标产物。它是一种具有集成化优势的分离纯化技术 ,在生物工程产品的下游处理过程中有十分广阔的应用前景。开发出性能良好的吸附剂基质 ,是该项技术得以广泛应用的关键。本文通过文献的查阅及总结，从吸附剂基质及技术的应用两个方面综述了扩张床吸附技术的研究进展。关键词：扩张床吸附技术、进展、吸附剂基质、应用一般而言 ,生物工程产品下游处理过程可分为目标产物捕获、中期纯化和精制三个阶段 ,其中产物1捕获阶段最为关键 ,一般由细胞富集、产物释放、澄清、浓缩、初步纯化等操作步骤组成 。目前 ,除去原料液中的固体颗粒最常用的方法是离心和微滤。但当处理含有微细固体颗粒的高粘度料液时 ,离心的效率会大大降低;而细胞和细胞碎片在膜表面的积累又会使微滤过程的膜通量急剧下降 ，如果对料液进行稀释 ,随后的浓缩过程将增加额外的能耗。从发展趋势来看, 生化分离技术研究的目的是要缩短整个下游过程的流程和提高单项操作的效率,以前的那种零敲碎打的做法，研究要有一个质的转变, 国内外许多专家和研究者认同了这种转变,并认为可以从两个方面着手,其一, 继续研究和完善一些适用于生化工程的新型分离技术;其二,进行各种分离技术的高效集成化。目前出现的一些新型单元分离技术,如亲和法、双水相分配技术、逆胶束法、液膜法、各类高效层析法等,就是方向一的研究结果,作为方向二的高效集成化,最引人注目的是扩张床吸附技术，近10年来研究的热点之一。与流化床相比，它返混程度很小，因而分离效果较好；与固定床相比，它能处理含菌体的悬浮液，可省却困难的过滤操作。扩张床吸附（Expanded Bed Adsorption , EBA） 技术是上世纪九十年代发展起来的一种新型蛋白质分离纯化技术 ,能直接从发酵液或细胞匀浆中捕获目标产物。扩张床是吸附剂处于稳定状态的流化床2-4 。与串通的填充床层析不同的是在扩张床吸附操作中吸附剂（或层析剂）层在原料液的流动下可产生适当程度的膨胀,其膨胀度取决于吸附剂的密度、流体速度。当吸附剂的沉降速度流体向上的流速相等时，扩张床达到平衡。由于吸附剂的扩张,吸附剂之间的空隙率增大,可以使原料液中的细胞、细胞碎片等固体颗粒顺利通过扩张床而被排除, 同时原料液中的目标物质则被吸附在吸附剂上,这样就实现了直接从含菌体、细胞碎片或组织萃取物的发酵液中直接分离目标蛋白质的目标。扩张床的操作可分为平衡、吸附、冲洗、洗脱和复性清洗等五个步骤,它将料液的澄清、浓缩和初步纯化集成于一个单元操作中,减少了操作步骤 ,降低了分离过程的复杂程度,提高了分离效率和产品的收率,例如：假设下游工艺每步回收率为90%，十步后总回收率只有35%；利用EBA技术将前三步整合为一步，增加了产品的回收率，产率可增加23%，还减少了离心机、过滤等设备的投资。近年来，EBA技术已引起人们的广泛兴趣，国外有关扩张床吸附基质的研究以及其应用的报道从 1993 年以来层出不穷,国内关于扩张床的报道几乎为空白。一：吸附剂基质的研究进展吸附剂的基质材料历来是层析过程的关键 ,直接影响着过程的传质和分离效率。扩张床吸附也属于层析过程 ,其操作特性介于流化床和固定床之间 ,吸附剂依靠流速在床层中悬浮起来 ,但流动接近于平推流 ,与固定床相似5 。这其中基质起了十分重要的作用 ,设计出一种流动和吸附性能良好的扩张床基质 ,是保证高效地实现这一过程的关键 ,因此 ,必须对基质进行新的设计。通过大量文献的查阅，下面就近十年来扩张床吸附剂基质的研究状况进行了总结。1.1 扩张床吸附剂要求6Chase和Draegerhs根据大量的实验研究，总结出用于扩张床操作的吸附剂应满足的六项基本要求:(1)吸附剂的尺寸和密度应保证其终端流速与料液中需除去的固形颗粒间有明显的差异;(2)吸附剂必须有一定的粒径和密度分布，在膨胀床内会形成稳定的分级，从而减小固液相间的返混;(3)吸附剂应具有良好的孔道结构，不易被料液中的脂类、核酸和杂蛋白等生物物质污染;(4)吸附剂应具有活性基团，可以修饰具有特异性吸附的配基，使吸附剂对目标产物具有较高的吸附容量:(5) 吸附剂应具有高化学稳定性和良好机械强度，其中高的化学稳定性可以保证吸附剂可以承受较苛刻的洗脱条件，而良好的机械强度可延长吸附剂的使用寿命;(6)吸附剂应具有良好的传质性能，在较高的流速下，可以保持较高的吸附量。1.2 吸附剂基质材料理论上一些用于固定床的传统吸附剂也可以用于扩张床吸附，但是由于其尺寸小和密度低不能保证其在较高流速下操作，因而体现不出扩张床吸附技术在生物分离中集成化的优势7。根据Stoke公式，颗粒的终端流速与颗粒的直径、固相与液相间的密度差成正比，与液相粘度成反比。膨胀介质的粒径过小，在实际操作时为避免膨胀率过高，所用的流速较低:粒径过大，目标产物的扩散路径较长，造成吸附量的下降，分离效率降低;膨胀介质的密度越高，终端流速也就越高，操作时流速有较宽的选择范围。研究表明，具有一定粒径和密度分布的膨胀介质，在流体作用下，在床内可以形成稳定的分级，大粒径和高密度介质分布于床层底部附近，而小粒径和低密度介质集中在床层的顶部，从而保证膨胀床内的混合程度较低。近年来，研究人员己经开发了多种用于膨胀床吸附操作的高效新型膨胀介质8,如Silica gels, Cellulose matrix, Agarose kiese1guhr, Controlled poreglass fit,氧化错型吸附剂以及亲水性的全氟聚合物等。这些膨胀床介质的密度在1.1-3.0 g.mL-1，之间，粒径为50-400微米。但上述的吸附剂或对蛋白质的吸附容量过低，或受清洗条件的限制，用其生产的产品很难满足生物制药的相关规定。Amersham Pharmacia Biotech公司开发的Streamline系列复合型吸附剂，在交联的琼脂糖凝胶内包埋晶体石英或金属颗粒以提高吸附剂的密度，克服了以上的问题因而受到广泛的应用。最近人们又开发了薄壳型的吸附剂，这种吸附剂具有较大的吸附面积和较短的传质路径，同时通过选取适当的内核，可以保证其具有较高的密度和用来满足不同的操作目的，因此这类吸附剂的开发倍受人们的关注。目前 ,尚没有聚合物高分子微球作为扩张床基质的报导,主要是因为共聚单体的亲油性,与增重无机亲水微粒的相容性较差,聚合过程中会出现相分离,致使得到的微球中增重颗粒含量不一致，或包埋太少,增重效果不明显。1.3 扩张床基质制备方法关于扩张床基质的制备方法,目前只有很少的文献予以具体的报导 ,商业化扩张床基质的制备细节 ,更是无从得知。这也从另外一个角度说明 ,开发具有我们自身知识产权的扩张床基质是很有必要的。总结已报导的制备方法6 ,大致可以分为如下几种: （1）共混包埋法共混包埋法是将增重微粒均匀分散在天然亲水性高分子溶液中,通过溶解、结晶、再生等手段得到多孔基质。琼脂糖和纤维素都存在明显的链聚集结晶区域 ,结晶再生时能形成稳定的多孔网络结构 ,并能将增重材料包埋其中。例如 ,将纤维素的黄原胶溶液与含微米级 TiO 颗粒的水溶液共混 ,升温溶解 ,然后在甲醇溶液中再生 ,即能得到混合型的基质 ,但由于机械强度不够 ,需要进行后交联反应增加基质9的强度 。由于基质是经过研磨后筛分而得 ,形状并不一致 ,这会影响扩张时的流体力学特性。另外 ,TiO 微粒随机分散在纤维素骨架的网络结构中 ,也会影响蛋白质分子的传质效果。经典的纤维素层析基质的制备采用“反相悬浮再生法”,即将纤维素的黄原胶溶液反相悬浮在油相中 ,然后再生出多孔珠体10 。如果采用这种方法包埋较大粒径的增重颗粒 ,制备出核壳型的纤维素基质 ,可能会改善上述存在的问题。（2）反相悬浮交联法大部分扩张床基质采用这种方法制备。由于增重内核或微粒 ,如不锈钢、二氧化钛、二氧化锆等 ,为亲水性的物质 ,使用反相悬浮法可以将它们包埋在亲水性的天然高分子骨架中。例如 ,使用石蜡油作分散相、Span85 作乳化剂 ,将不锈钢微珠分散在琼脂糖的水溶液里 ,控制搅拌速度以获得不同的琼脂糖层11厚度因而密度不同 ,逐步降温冷却即可获得高密度核壳型基质。如果在水相中加入交联剂 如环氧氯丙烷 ,则可实现反相悬浮交联 ,基质的强度可以进一步提高 ,而孔隙率并不受到明显的影响 ,商业化的 Streamline 基质即是如此。反相悬浮法能使大多数增重颗粒被包埋 ,粒径分布较广 ,能够满足扩张床基质的要求 ,缺点是基质的密度不易控制。 (3) 表面改性法可以分为化学改性和共聚物改性两种。氟化二氧化锆（FmZr） 系直接在多孔（ZrO）表面化学改性而得 ,由于氟化物为强Lewis 碱 ,而 ZrO 表面具有Lewis 酸位点 ,改性极易完成 。聚丙烯酰胺/ ZrO水凝胶则经共聚物改性而来:将含有功能基化的单体、交联剂和引发剂的溶液直接与多孔 ZrO 接触 ,然后引发共聚而得 。实际上 ,改性并不能使所有的非特异性作用位点得到屏蔽。此外 ,多孔 ZrO 的获得也有不同的方法。Voute 使用的多孔 ZrO 系用0.12 m的粉末悬浮液 ,经抽干、蒸发、脱水、聚集 ,然后在600800 高温烧结而得 ,所得到的基质形状不规则。Griffith 则采用油包水型的乳液方式得到多孔 ZrO :以花生油和油醇作油相 ,以 Triton X2100 作乳化剂 ,加入 ZrO 悬浮液搅拌得到乳化液 ,85 脱水固化 ,收集颗粒 ,高温烧结后得到多孔基质。所制备的基质颗粒形状较规则 ,但制备工艺复杂 ,步骤繁琐。扩张床基质的制备 ,可以参照磁性基质的研制方法 ,大量文献报导了磁性微粒亲油化处理之后被高分子共聚微球包埋的情况;另外 ,作为增重剂之一的二氧化钛的亲油化处理工艺 ,在研究上和工业应用中都十分成熟。可以相信 ,这方面的尝试将是有益的。二：EBA技术应用进展扩张床现已成功地用于大肠杆菌匀浆、包涵体, 大肠杆菌培养液, 酵母细胞匀浆, 酵母培养液,杂交瘤细胞培养液以及动物组织产物的提取, 也可将扩张床用作生物反应器。其规模也正从中试向工业化方向发展。近些年来，随着新型吸附剂和膨胀装置的开发和设计，扩张床吸附技术在生物加工过程中得到越来越广泛的应用12，如蛋白质提纯、抗体纯化、细胞分离、DNA纯化、细胞破碎和ELISA分析等方面。尽管目前许多应用还仅限于实验室规模，但已经有一些中试或具有生产规模的应用实例。例如，美国Genentech公司的单克隆抗体的提取。扩张床吸附技术实际应用的例子很多，根据文献报道总结了近年来扩张床吸附技术在生物分离领域的几个应用成功的实例:（1）重组人白介素 8 的提纯:Barnfield13用 300mL阳离子交换剂STREAML NESP在 STREAML NE 50 扩张床上, 从16L 大肠杆菌破碎液里直接提取复性后的重组人白介素8,一步得率为97%, 纯化倍数为4. 35 倍。扩张床连续进行了52 次纯化操作, 其扩张率基本保持不变。（2）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的纯化:hang14-15分别用含阴离子配基DEAE 和染料配基Procion Red H-E 7B的吸附剂分离葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。由于染料对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶有亲和效应, 它的纯化倍数比DEAE的要高8. 6 倍。 (3) 单细胞外毒素的提纯:Johansson16等 用 STREAML NE DEAE从大肠杆菌周质中提取重组铜绿单细胞外毒素,与使用澄清料液的传统层析(DEAE Sepharose F F) 相比, 中试规模处理45 kg 细胞 （180 L含细胞的料液 ）只需 25 h, 只是传统分离过程中用离心澄清料液所需时间的一半。分离得到的外毒素 A的比活0.06mg 毒素/mg蛋白, 回收率为79%, 而传统的填充床层析处理相同量的细胞则需810 h,是扩张床的3 倍。(4) 重组人白介素1 受体拮抗体的提取: Maurizi17等 用两种方法从枯草芽孢杆菌发酵液中提取重组人白介素 1 受体拮抗体 。第一种方法包括离心、过滤、阳离子交换层(S Sepharose) 析和阴离子交换层析(Mono Q) 2个步骤。前一种方法得到的产物纯度为98%, 回收率为74%, 而后一种方法得到的产物纯度为90%92%, 回收率为85%。以上结果表明, 用扩张床层析一步操作可以替代离心、过滤和初步纯化三步操作。(5 )单克隆抗体的提取: 美国Genentech公18司用扩张床从CHO细胞培养液中大规模提取单克隆抗体。根据在 STREAML NE25 柱（直径1200 mm)上，一次可处理7324L未澄清的培养液, 用扩张床可全部除去细胞, 抗体浓缩了5 倍, 回收率达99%。由此可看出,扩张床的工程放大比较简单,在放大时,保持床层高、吸附剂粒径和流体流速不变即可。（6 ）重组人血清蛋白的提取:Noda19等用扩张床从毕赤酵母（P.pastroris）培养液中大规模提取重组人血清白,扩张床柱内径为1000mm ,内装 150 L STREAML NESP,一次可处理 2000L酵母培养液,总收率 87.1%与中试时得到的结果一致, 采用热处理和扩张床吸附,可以替代传统的5 步操作,不仅减少了操作时间,而且产率提高了30%。已实际应用的情况还很多12, 其它的一些分离应用事例如下表所示： 目标产物产物来源积累方式层析类型浓缩倍数得率%鼠重组IgG2a抗体重组融合蛋白ZZ-M5重组人胎盘钙结合蛋白V重组抗HIV抗原结合片段重组抑肽酶变体乙醇脱氢酶重组人神经生长因子重组人IgG4抗体重组鼠IgG1抗体重组人C蛋白溶菌酶杂交瘤细胞大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌汉逊酵母酿酒酵母CHO细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞转基因猪奶马奶胞外胞外胞内胞内胞外胞内胞外胞外胞外-亲和阴离子阴离子阳离子阳离子疏水作用阳离子亲和亲和阴离子阴离子3514.92.29.87-301521-959395100769510011190.69488.9 从表中所列实例可知, 尽管扩张床发展的历史还很短, 但是由于它特有的性能, 已引起生物技术研究人员, 特别是工业界的重视。这些足以说明, 在目前生化分离技术发展尚不完善时, 把该项技术用于生物物质的分离是值得考虑和推广的。三：展望综上所述,扩张床吸附技术是一种具有集成化优势的分离纯化技术,它在生物工程产品的下游处理过程中有十分广阔的应用前景;开发出性能良好的吸附剂基质,是该项技术得以广泛应用的关键。开发出性能良好的吸附剂基质,是该项技术得以广泛应用的关键。扩张床吸附技术之所以能够成功的从含有悬浮微粒的料液直接分离目标产物，关键在于吸附剂和杂质微粒之间存在着足够的物理性质上的差异 (粒径，密度等)，使进料液的流速可满足一定的关系，以达到吸附剂在床内截留而杂质微粒被带出的目的，从而实现分离。但在实际分离中，往往会遇到高粘度的料液，或者杂质微粒的尺寸与吸附剂大小相当，甚至大于吸附剂，因此开发高密度、粒径适合、高吸附容量和性能稳定的膨胀介质已经成为扩张床吸附技术应用研究中新热点20。扩张床技术对基质的密度和粒径及其它们的分布提出了新的要求。文献中报导的扩张床基质呈现出密度愈来愈高、粒径越来越小的趋势 ,考虑到扩张床吸附过程的操作流速一般比固定床层析要高许多和蛋白质层析过程中的传质阻力主要为基质颗粒内扩散步骤 ,高密度、小粒径、薄壳层的核壳型基质和高密度、大孔径、高比表面的混合型金属氧化物基质都具有很大的应用优势。大孔聚合物基质在蛋白质的分离与纯化中已经得到了广泛的应用 ,但目前尚没有应用于扩张床吸附的报导。随着大比重的共聚单体的开发成功和基质制备工艺的改进 ,这类基质在扩张床中的应用将会出现。当前 ,扩张床吸附基质已经完成了第二代产品的开发 ,开发出开发选择性高, 适用范围广, 价格低廉的吸附剂是扩张床吸附技术发展的另一个方向。伴随着更多性能优异的廉价基质的开发成功 ,将进一步拓宽扩张床吸附技术的应用范围。目前，国内外不少基因工程药物，特别是抗体药物的生产规模已达到上数千至万升发酵罐。通过全面合理的过程设计以及吸附介质的优化选择，扩张床吸附技术已可以越来越有效的捕获目标生物分子。凭借扩张床技术在处理含固体颗粒料液方面具有独特的优势，相信EBA技术将会更多地被应用到生物制品中的下游生产中，其应用前景十分广阔。但是到目前为止对膨胀床的机理21仍不是很清楚 ,但相信在不远的将来 ,不但可以清楚的知道其机理 ,而且将会有一些能精确描述其特性的数学模型 ,从而使膨胀床吸附技术能更广泛地应用于生产。参考文献：1 胡洪波. 扩张床吸附过程的研究- 安通溶栓酶的分离与纯化D. 博士学位论文, 杭州: 浙江大学, 1999.2 HA Chase. Tibtech, 1994 , 12 8 : 296.3 R Hjorth, S Kaempe , M Carlsson. Bioseparation, 1995 ,5 : 217.4 B C Batt , V M Yabannavar, V Singh. Bioseparation,1995 , 5 : 41. 5 刘坐镇, 陈士安, 邬行彦. 扩张床吸附技术J. 离子交换与吸附, 1999,153 :279-288.6 雷引林,姚善泾,刘坐镇,朱自强. 扩张床吸附基质研究进展J. 功能高分子学报, 2002,6:219-224.7 Gilchrist GR, BurnsMT,Lyddiatt A. Solidphasesfor protein adsorption in liquidfluidized bed: comparisonof commercial and custom2assembled particlesM. Separationsfor Biotechnology 3, Pyle DL ed, Royal Societyof Chemistry, London, 1994. 186 - 192.8 Lihme A, Zafirakos E, Hansen M, et al. Simplified and more robust EBA processes by elution in expanded bed modeJ. Bioseparation, 1999 ,8:93-97.9 Chase H A, Draeger N M. Affinitypurificationof proteins using expanded bedsJ. J Chromatogr , 1992 ,597:129-145.10 Kuga S. New cellulose ge