乳腺癌her2检测PPT课件.ppt

1 乳腺癌HER2的标准化检测 2 HER2 又名HER2 neu c erbB 2 表皮生长因子受体 EGFR 家族成员 原癌基因 位于17q21 编码相对分子量185KD的跨膜糖蛋白 跨膜酪氨酸激酶受体 表皮生长因子样分子 在细胞表面表达 通过参与信号传道通路的一系列活动影响细胞的增殖与分化 HER2基因 3 HER2受体跨膜二聚体的信号传导途径 4 1 基因拷贝数2 mRNA转录3 细胞表面受体蛋白表达4 细胞外受体功能域释放 A HER2DNAB HER2mRNAC HER2receptorprotein 正常 扩增 过度表达 细胞核 细胞质 细胞膜 1 2 3 4 C B A HER2过度表达 正常状态的10 100倍 5 HER2癌基因的致瘤机制 抑制凋亡 促进增殖 增加肿瘤细胞的侵袭力 促进肿瘤血管新生和淋巴管新生 研究表明 30 以上的人类肿瘤中存在HER2基因的扩增 过度表达 如乳腺癌 卵巢癌 子宫内膜癌 输卵管癌 胃癌和前列腺癌等 20 30 的原发性浸润性乳腺癌有HER2基因的扩增 过度表达 6 HER2阳性患者的生存期比阴性者缩短一半以上 转移性乳腺癌患者的中位生存期 HER2阳性8 10个月HER2阴性17 22个月 SlamonDJetal Science1987 235 177 82 7 2004年发现淋巴结阴性患者预后与HER2状态密切相关 p 0 0001Cumulativediseaserecurrencecurves SunJM Cancer2004 101 2516 22 0 30 20 10 020406080100 月 HER2阳性患者平均风险曲线 HER2阴性患者平均风险曲线 基础风险曲线 HER2表达在原发肿瘤和转移灶呈高度一致 Mainlydistantmetastases Liverandlungmetastases Lymphnodemetastaseswereanalysedinallcases exceptinthestudiesbyVincent Salomonetal 2002 andGancbergetal 2002 wheredistantmetastaseswereanalysed StudyMasood Bui 2000 Shimizuetal 2000 Simonetal 2001 Tanneretal 2001 Gancbergetal 2002 Vincent Salomonetal 2002 Tsutsuietal 2002 Carlssonetal 2004 Primarytumours32 38 25 28 29 25 25 55 Metastases32 38 22 28 27 20 25 55 PercentageIHCoverexpression 9 2005年St Gallen国际治疗指南乳腺癌危险度分级 10 2005StGallen指南 乳腺癌初诊时需明确HER2HER2阳性即做为高风险因子加以考虑 Goldhirschetal2005 CMF cyclophosphamide methotrexate 5 fluorouracil 预后评估预后差 疗效预测从赫赛汀 的治疗中最大获益芳香化酶抑制剂的疗效优于三苯氧胺蒽环类和紫杉类的疗效优于CMF 11 随着肿瘤的靶向性治疗的发展 以单抗为主的分子靶点药物的不断研制应用 已成为肿瘤靶向治疗的新武器Herceptin即为一种针对HER2受体的高纯度重组DNA衍生物的人源化单克隆抗体 是乳腺癌治疗领域的第一个分子靶向性药物 12 Heceptin 一种针对Her 2 neu受体的高纯度重组DNA衍生物的人源化单克隆抗体 是乳腺癌治疗领域的第一个分子靶向性药物 具有高效 低毒 选择性强的特点 癌细胞表面存在着CerbB 2蛋白 受刺激后促进癌细胞的增殖 20 30 的癌细胞 Her 2 neu基因的蛋白CerbB 2 与CerbB 2结合阻断和抑制细胞的增殖 转移性乳腺癌病人的治疗效果 检测癌细胞表面cerbB 2存在程度决定使用 13 意义 靶向药物Heceptin仅对HER2扩增的乳腺癌有效 准确的检测HER2有无扩增是临床应用Heceptin的绝对必要条件 也是成功进行靶向治疗的前题和关键HER 2扩增的乳腺癌往往提示其恶性程度高 进展迅速 化疗缓解期短 对CMF方案化疗反应降低 乳腺癌化疗药物环磷酰胺 阿酶素 5 氟尿嘧啶等的主要参考指标 14 HER 2扩增的乳腺癌对蒽环类药物和紫杉醇类药物化疗敏感性高 HER2和拓扑异构酶II a基因同时扩增的乳腺癌患者 可以从蒽环类药物为基础的方案中受益 故同时检测HER2和拓扑异构酶II a可以筛选出以蒽环类化疗药为基础的化疗方案候选患者HER 2扩增的乳腺癌对三苯氧胺易产生耐药性 制定内分泌治疗方案的有力依据HER 2扩增的乳腺癌无病生存率和总生存率低 并且与淋巴结阳性 癌的高级别 阴性受体状态及高增殖活性有关 预后判断的参考指标 意义 15 ST GALLEN2007HER2 乳腺癌危险因素的新定义 低 中 高 G1T 2ER PR 年龄2 淋巴结1 3和HER2 ER PR 或淋巴结 4 淋巴结 HER2 ER PR 或LVI侵润淋巴结1 3且HER2 ER PR 淋巴结 HER2 LVI无 RISK RISK 16 2007NCCN治疗指南 HER2检测的原则 17 ASCO CAP HER2检测指南 HER2阳性 IHCHER23 完整的 强的膜阳性 30 或FISHHER2基因扩增 HER2 CEP17 2 2或HER2基因拷贝数 6信号 核 无内对照的探针 HER2阴性 IHCHER20 1 或FISHHER2基因扩增 HER2 CEP17 1 8或HER2基因拷贝数 4信号 核 无内对照的探针 不能确定 IHCHER22 或FISHHER2基因扩增 HER2 CEP171 8 2 2或HER2基因拷贝数4 6信号 核 无内对照的探针 18 HER2测定流程图 19 HER2的检测方法 免疫组织化学 IHC HER2蛋白的表达荧光原位杂交 FISH HER2基因的扩增显色原位杂交 CISH HER2基因的扩增酶联免疫分析 EIA 酶联免疫吸附分析 ELISA 聚合酶链反应 PCR 20 HER2阳性定义 IHC3 CISH FISH 或 或 21 一抗结合于Her 2受体 二抗结合并激活底物反应显色 免疫组织化学法原理Immunohistochemistry IHC 22 IHC 检测HER2表达初筛最常使用的方法 判断HER2蛋白过表达最重要的是染色方法的标准化和结果的判断 建议使用美国食品和药品管理局 FDA 批准的试剂盒 应使用EnVision法和高质量的DAB显色液以避免内源性生物素的影响 应有严格的 包括内部和外部的质量控制 须设阳性对照 阴性对照和空白对照 23 IHC结果判断 先在10 物镜下进行判读注意细胞膜完全着色的癌细胞比例及着色强度胞质着色应忽略不计导管内癌 DCIS 的着色应忽略不计 只评定浸润癌的着色情况正常乳腺上皮不应着色应使用美国FDA批准的HercepTest评分系统 24 25 26 ASCO CAP C erbB2IHC的评分 0 阴性 无染色 或10 的细胞膜微弱的或不完整的膜染色2 弱阳性 10 细胞弱到中等膜染色3 强阳性 10 中等到强的完整的膜染色 30 27 0 1 28 2 3 29 C erbB2 2008 12 12 30 31 HER 2检测 IHC 抗原修复有 无 组织固定方法 抗体选择 评分标准 变异性 32 福尔马林固定 石蜡包埋组织 HER基因扩增2 5倍 SouthernHybridization Slamonetal Science244 712 1989 HER2 阴性 是由于组织固定后抗原被遮蔽需要行抗原修复来纠正 CourtesyMichaelPress 33 34 FISH 是一种分子细胞遗传学技术 通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交 在荧光显微镜下 于细胞和 或 组织原位观察并分析细胞核内杂交于DNA靶序列的多种彩色探针信号 以获得细胞内多条染色体 或染色体片段 或多种基因状态的信息 金标准 35 HER2gene HER2gene HER2gene 双链靶基因 变性的单链DNA 与荧光标记探针复性 产生荧光信号 荧光原位杂交法原理FluorescenceinsituHybridisation FISH 36 HER2探针 绝大部分是同时含有HER2基因 标记为橘红色荧光 和该基因所在的17号染色体着丝粒 标记为绿色荧光 序列的混合探针经美国FDA批准的进口探针VS国产探针 37 38 评价17号染色体数目和意义 HER2基因位于17号染色体上 大约有47 的乳腺癌存在17号染色体非整体性 即17号染色体不是正常的二体 而是单体或多体 绿色探针可以将17号染色体的非整体性和单纯的HER2基因扩增 尤其是低水平的扩增区分开 当HER2基因与17号染色体数目比值大于2时 即为HER2基因扩增 加入了这个内对照 就排除了单色探针 探针中仅有HER2基因 可能造成的假阴性 17号染色体单体 或假阳性 17号染色体多体 临床研究显示 具有这类遗传学特征的患者对治疗的反应和预后与单纯的基因扩增明显不同 39 质量控制 内对照 杂交的组织 细胞中有75 的细胞核显示出双色信号时 视为实验成功 并且红 绿信号互为对照 癌与非癌细胞互为对照 外对照 应选择FISH阳性和阴性的标本片 40 结果判读 杂交信号计数应选择细胞核大小一致 核的边界完整 二脒基苯基吲哚 DAPI 染色均一 细胞核孤立无重叠 绿色着丝粒信号清晰的细胞 随机计数20 30个癌细胞核中的双色信号 判读标准红色信号的总数与绿色信号的总数比值 2 2时 即为HER2基因扩增若红 绿两信号的比值 20或众多信号连接成簇时可不计算 即视为基因扩增 若比值介于1 8 2 2之间 则需要再计数20个细胞核中的信号或由另外一个分析者重新计数 如仍为临界值 则应在FISH检测报告中注明 若HER2基因扩增在不同癌细胞中存在异质性时 应在另一癌区域再计算20 30个癌细胞核中的红 绿信号值 报告其最大值 并加以注释 注意避免G2期细胞内的基因拷贝数目特征 4个拷贝 可能导致的计数误差 41 HER2probe CEP17probe 42 HER2FISHPatterns FISHAmplified FISHNotamplified AneusomyNotamplified CourtesyKenBloom 43 FISH PathVysionTM 无扩增 扩增 比值 2 2提示Her 2无扩增 比值 2 2提示Her 2有扩增 44 比