[王镜岩生物化学第三版笔记]第十五章 蛋白质的合成.pdf

第十五章 蛋白质的合成第十五章 蛋白质的合成 第一节第一节 MRNA 一 原核生物MRNA的结构 二 真核生物MRNA的结构 第二节第二节 遗传密码遗传密码 一 遗传密码的破译 二 遗传密码的特点 第三节第三节 核糖体核糖体 一 核糖体的结构与组成 二 RRNA与核糖体蛋白的结构与功能 一 rRNA的结构与功能 二 核糖体蛋白的结构与功能 第四节第四节 蛋白质合成的机理蛋白质合成的机理 一 氨酰TRNA合成酶 氨基酸的活化和 氨酰TRNA的合成 一 活化 二 连接 二 蛋白质合成的一般过程 一 翻译起始 二 延伸 三 终止 四 翻译后加工 三 原核生物的蛋白质合成 一 翻译起始 二 延伸 1 新氨酰tRNA入位 2 肽键形成 转肽 3 核糖体移位 三 终止 四 原核生物的翻译后加工 1 切除加工 2 糖基化 3 甲基化 4 磷酸化 五 原核生物的翻译调控 四 真核生物的蛋白质合成 一 翻译起始 二 延伸 1 入位 2 肽键形成 转肽 3 移位 三 终止 四 真核生物的翻译后加工 1 切除加工 2 糖基化 3 羟基化 4 磷酸化 5 亲脂修饰 6 甲基化 7 二硫键形成 五 真核生物的翻译调控 1 mRNA向细胞质的运输 2 mRNA的稳定性 3 翻译的负调控 4 起始因子磷酸化 5 translational frameshifting 五 蛋白质合成后的定向转运 一 信号肽 翻译转运同步机制 二 翻译后转运机制 posttranslational translocation 六 蛋白质的折叠 第十五章蛋白质的合成2 0B 对于终产物为 RNA 的基因 只要进行转录及转录后的处理 就完成了基因表达的全过程 而对于终产物是蛋白质的基因 还必须将 mRNA 翻译成蛋白质 因此 蛋白质是基因表达的最终产物 基因表达的最终产物还包括 tRNA rRNA 及其他 RNA 蛋白质的生物合成过程实质上也是基因表达的一个过程 它包括转录和翻译 从化学 的角度讲 蛋白质的合成就是 20 种基酸按照特定地顺序聚合成多肽并按照一定的折叠机制折 叠成最终的活性构象状态 那么 我们要问 在生物体内是谁直接决定着蛋白质合成的氨基 酸顺序从而最终主宰了它的高级结构和功能的呢 mRNA 根据中心法则 DNA 特定的碱基次序 A T G C 就象一串密码 称为遗传密码 首 先经过转录作用 DNA 的 A T G C 碱基序列严格按照碱基配对原则被复制成 mRNA 的 A U G C 序列 于是 mRNA 就直接充当了蛋白质合成的模板 mRNA 的 A U G C 序列被转变成蛋白质的氨基酸序列 这种转变是一个质的飞跃 称为翻译 就好象把一种语 言 碱基序列 翻译成另一种语言 氨基酸序列 那么在翻译过程中就有两个关键性地问题 1 遗传密码 碱基序列 到底是怎样决定 氨基酸序列的呢 也就是说什么样的碱基序列决定什么样的氨基酸序列呢 2 通过什么样 的方式或机制实现碱基序列到氨基酸序列的转变 因为氨基酸不能与碱基配对 因此一个碱 基序列显然不能象转录一样简单地直接转换成氨基酸序列 而必须通过一种中间分子 又称 接头分子 的媒介作用来实现 而且这种接头分子要能同时识别碱基序列和它所决定的氨基 酸序列 这种接头就是 tRNA 分子 需要指出的是蛋白质的合成是一个复杂的过程 包括翻译 翻译后加工和定向输送以及 正确折叠 而且到现在为止 其中的许多重要方面仍在研究之中 真核生物蛋白质的合成 需要 300 多种生物大分子协同工作 核糖体 RNA 及结合蛋白 各种酶 各种 tRNA 加工修饰酶等 蛋白质合成的场所 标记各种 a a 注入大鼠体内 在不同时间取出肝脏 匀浆 离心分 离各种亚细胞器 分析放射性蛋白的分布 证实蛋白质的合成是在核糖体上进行的 首先认识一下 mRNA 遗传密码 和核糖体 然后再深入学习蛋白质合成的细节过程 第一节 第一节 mRNA mRNA 的概念首先是由 F Jacob 和 J Monod1965 年提出来的 因为当时已经知道编码蛋 白质的遗传信息载体 是在细胞核中 而蛋白质的合成是在细胞质中 于是就推测 应 该有一种中间信使在细胞核中合成后携带上遗传信息进入细胞质中指导蛋白质的合成 后来 经过众多科学家的实验 发现了除 rRNA 和 tRNA 之外的第三种 RNA 它起着这种遗传信息传 送的功能 称为信使 RNA mRNA mRNA 的半衰期很短 很不稳定 一旦完成其使命后很快就 第十五章蛋白质的合成3 0B 被水解掉 原核生物和真核生物 mRNA 的结构差异教大 尤其是在 5 端 一 原核生物一 原核生物mRNA的结构的结构 1 5 端 SD 序列 P404 P405 在起始密码子 AUG 上游 9 13 个核苷酸处 有一段可与核糖体 16S rRNA 配对结合的 富含嘌呤的 3 9 个核苷酸的共同序列 一般为 AGGA 此序列称 SD 序列 它与核糖体小亚 基内 16S rRNA 的 3 端一段富含嘧啶的序列 GAUCACCUCCUUA OH 暂称反 SD 序列 互 补 形成氢键 使得结合于 30S 亚基上的起始 tRNA 能正确地定位于 mRNA 的起始密码子 AUG 2 原核 mRNA 分子 许多是多顺反子 转译时 各个基因都有自己的 SD 序列 起始密码子 终止密码子 分别控制其合成的 起始与终止 也就是说 每个基因的翻译都是相对独立的 如 E coli 一个 7000b 的 mRNA 编码 5 种与 Trp 合成有关的酶 二 真核生物二 真核生物mRNA的结构的结构 1 真核生物 mRNA5 端均具有 m7GpppN 帽子结构 无 SD 序列 帽子结构具有增强翻译效率的作用 若起始 AUG 与帽子结构间的距离太近 小于 12 个 核苷酸 就不能有效利用这个 AUG 会从下游适当的 AUG 起始翻译 当距离在 17 80 个核 苷酸之间时 离体翻译效率与距离成正比 2 真核生物 mRNA 通常是单顺反子 真核 mRNA 具有 第一 AUG 规律 即当 5 端具有数个 AUG 时 其中只有一个 AUG 为主要开放阅读框架的翻译起点 起始 AUG 具有二个特点 1 AUG 上游的 3 经常是嘌呤 尤其是 A 2 紧跟 AUG 的 4 常常是 G 起始 AUG 邻近序列中 以 ANNAUGGN 的频率最高 若 3 不是 A 则 4 必须是 G 无 此规律的 AUG 则无起始功能 有关 mRNA 发现及其证实的细节看书 P391 第十五章蛋白质的合成4 0B 第二节 遗传密码第二节 遗传密码 我们已经知道 多肽上氨基酸的排列次序最终是由 DNA 上核苷酸的排列次序决定的 而 直接决定多肽上氨基酸次序的是 mRNA 上的核苷酸的排列次序 不论是 DNA 还是 mRNA 都 是由 4 种核苷酸构成 而组成多肽的氨基酸有 20 种 显然 必须是几个核苷酸的组合编码一个 氨基酸才能应付局面 用数学方法很容易算出 如果每 2 个核苷酸编码 1 个氨基酸 那么 4 种核 苷酸只有 16 中编码方式 显然不行 如果每 3 个核苷酸编码 1 个氨基酸 则有 64 种编码方式 很理想 如果 4 对 1 则有 256 种 太没必要也太复杂了 时刻记住生物体是一个最理想的体系 而 且科学家们用生物化学实验已经证实是 3 个碱基编码 1 个氨基酸 称为三联体密码或密码子 那么让我们看一下遗传密码是如何破译的 一 遗传密码的破译一 遗传密码的破译 在遗传密码的破译中 美国科学家 M W Nirenberg 等人做出了重要贡献 并于 1968 年获得 了诺贝尔生理医学奖 早在 1961 年 M W Nirenberg 等人在大肠杆菌的无细胞体系中外加 poly U 模板 20 种 标记的氨基酸 经保温后得到了多聚 phe phe phe 于是推测 UUU 编码 phe 利用同样的方法 得到 CCC 编码 pro GGG 编码 gly AAA 编码 lys 如果利用 poly UC 则得到多聚 Ser Leu Ser Leu 推测 UCU 编码 Ser CUC 编码 Leu 因为 poly UC 有两种读码方式 UCU CUC 和 CUC UCU 采用这种方式 到 1965 年就全部破译了 64 组密码子 见表 P394 二 遗传密码的特点二 遗传密码的特点 在 64 个密码子中有 61 个编码氨基酸 3 个不编码任何氨基酸而起肽链合成的终止作用 称为终止密码子 它们是 UAG UAA UGA 密码子 AUG 编码 Met 又称起始密码子 密码子 mRNA 上由三个相邻的核苷酸组成一个密码子 代表肽链合成中的某种氨基酸 或合成的起始与终止信号 1 方向性 从 mRNA 的 5 到 3 2 连读性 编码一个肽链的所有密码子是一个接着一个地线形排列 密码子之间既不重叠也不间隔 从起始密码子到终止密码子构成一个完整的读码框架 不包括终止子 又称开放阅读框架 ORF 那么如果在阅读框中插入或删除一个碱基就会使其后的读码发生移位性错误 称为 移码 第十五章蛋白质的合成5 0B 需要指出的是 两个基因之间或两个 ORF 之间可能会互相部分重叠 共用部分序列 3 简并性 几种密码子编码一种氨基酸的现象称为密码子的简并性 如 GGN GGA GGU GGG GGC 都编码 Gly 那么这 4 种密码子就称为 Gly 的简并密码 只有 Met 和 Trp 没有简并密 码 一般情况下密码子的简并性只涉及第三位碱基 问题 简并性的生物学意义 A 可以降低由于遗传密码突变造成的灾难性后果 试想 如果每种氨基酸只有一个密码子 那么剩下的 44 个密码子都了终止子 如果一旦 哪个氨基酸的密码子发生了单碱基的点突变 那么极有可能造成肽链合成的过早终止 如 GUU 编码 Ala 由于简并性的存在 不论第三位的 U 变成什么 都仍然编码 Ala B 可以使 DNA 上的碱基组成有较达的变化余地 而仍然保持多肽上氨基酸序列不变 意思基本同上 4 摇摆性 密码子中第三位碱基与反密码子第一位碱基的配对有时不一定完全遵循 A U G C 的原则 也就是说密码子的碱基配对只有第一 二位是严谨的 第三位严谨度低 Crick 把这 种情况称为摇摆性 有人也称摆动配对或不稳定配对 显然 密码子的第三位和反密码子的 第一位是摇摆位点 具体说来 反密码子第一位的 G 可以与密码子第三位的 C U 配对 U 可以与 A G 配 对 另外反密码子中还经常出现罕见的 I 可以和密码子的 U C A 配对 这使得该类反密 码子的阅读能力更强 见表 P396 问题 细胞内有几种 tRNA 当遗传密码破译后 由于有 61 个密码子编码氨基酸 于是人们预测细胞内有 61 种 但 事实上绝大多数细胞内只有 50 种左右 Crick 也正是在这种情况下提出了摇摆假说并合理解 释了这种情况 根据摇摆性和 61 个密码子 经过仔细计算 要翻译 61 个密码子至少需要 31 种 tRNA 外加 1 个起始 tRNA 共需 32 种 但是 在叶绿体和线粒体内 由于基因组很小用到的密码 子少 那么 叶绿体内就有 30 种左右 tRNAs 线粒体只有 24 种 5 通用性 密码子在不同物种间几乎是完全通用的 目前只发现线粒体和叶绿体内有列外情况 这也是如火如荼的转基因的前提 但要注意 的是不同生物往往偏爱某一种密码子 第十五章蛋白质的合成6 0B 第三节 核糖体第三节 核糖体 核糖体又称核蛋白体 它是蛋白质合成的场所 标记各种 a a 注入大鼠体内 在不同时 间取出肝脏 匀浆 离心分离各种亚细胞器 分析放射性蛋白的分布 证实蛋白质的合成是 在核糖体上进行的 对于真核细胞来说 核糖体按其在细胞质中的位置分为游离核糖体 合 成细胞质蛋白 和内质网核糖体 合成分泌蛋白和细胞器蛋白 不论原核细胞还是真核细胞 一条 mRNA 可以被同时几个核糖体阅读 把同时结合并翻 译同一条 mRNA 的多个核糖体称为多核糖体 一 核糖体的结构与组成一 核糖体的结构与组成 核糖体是由核糖核酸 称为核糖体核酸 rRNA 和几十种蛋白质分子 核糖体蛋白 组 成的一个巨大的复合体 不同类型生物中核糖体的结构高度保守 尽管其 rRNA 和核糖体蛋 白的一级结构有所不同 但其三级结构却惊人的相似 核糖体的大亚基上有两个重要的位点 P 位点是结合肽酰 tRNA 的肽酰基的位点 A 位 点是结合氨酰 tRNA 的氨酰基的位点 每个核糖体是由大小两个亚基组成 每个亚基都有自己不同的 rRNA 和蛋白质分子 表 P307 二 二 rRNA与核糖体蛋白的结构与功能与核糖体蛋白的结构与功能 一一 rRNA的结构与功能的结构与功能 结构结构 有大量的茎环 发夹 结构 结构复杂 可能是核糖体的钢筋骨架 功能 功能 1 蛋白质合成的施工平台 骨架 2 催化肽键形成的转移酶活性存在于 23SrRNA 上 有人小心的去掉细菌核糖体的蛋白质组分 保持 rRNA 的相对完整性 发现蛋白质的合 成仍可进行 3 参与 tRNA 与 mRNA 的结合 可能的情况是 mRNA 先识别 rRNA 的特定序列并结合固定下来 然后 tRNA 再识别并固 定到 rRNA 特定的部位 其反密码子才与 mRNA 密码子配对 已经知道 16SrRNA 上有一段 序列与原核 mRNA 上的 SD 序列相结合 4 在大小亚基的聚合中起重要作用 第十五章蛋白质的合成7 0B 5 在翻译的校正和翻译的调控方面有重要功能 如可结合调控因子 总的来说 总的来说 RNA 分子似乎是整个核糖体的活跃的活性中心 分子似乎是整个核糖体的活跃的活性中心 二二 核糖体蛋白的结构与功能核糖体蛋白的结构与功能 结构 结构 大多数核糖体蛋白呈纤维状 可能起骨架作用 少数呈球状 可能起生物功能 功能 功能 1 维持核糖体的结构 2 新发现 一些核糖体蛋白具有 DNA 结 Heilix turn Heilix 模块 还有些真核核糖 体蛋白具有 DNA 修复功能 问题 既然蛋白质是在核糖体中合成的 那么第一个核糖体中的蛋白组分又是怎样合成的 第 一个核糖体又是怎样出现的 先有 DNA 还是先有蛋白质 大多数科学家越来越支持 RNA 起源论 既然核糖体中既有蛋白质又有 RNA 那么彻底 搞清楚核糖体的结构与功能及其起源也许会弄清生命的起源和演化 RNA 起源论 第一个生活细胞里出现的是 RNA 分子 他同时具有信息储藏和生物演化的双重特性 也 就是说既可以在一定程度上复制自己 又可以催化一些最初的生化反应 后来 随着活细胞 的进化 DNA 逐渐出现并成为更为稳定的遗传信息储存分子 第四节 蛋白质合成的机理第四节 蛋白质合成的机理 真核生物和原核生物在蛋白质合成方面有许多共同之处 因此 我们先学习蛋白质合成 的一般过程 然后分别看一下原核和真核蛋白质合成的具体过程 游离氨基酸在掺入肽链以前必须活化以获得额外的能量 每一种游离氨基酸首须在专一 的氨酰 tRNA 合成酶的帮助下与专一的 tRNA 相连 有人称装载 LOAD 然后由 tRNA 负 责将它带到核糖体上的特定位点 A 位点上 并添加到正在合成的肽链 C 末端 这种从游离 氨基酸到形成氨酰 tRNA 的过程既是氨基酸的活化过程 也是肽链每合成一步或延伸一步的 必经准备阶段 下边我们先看一下这个过程是怎样完成的 一 氨酰一 氨酰tRNA合成酶 氨基酸的活化和氨酰合成酶 氨基酸的活化和氨酰tRNA的合成的合成 基酸的活化和氨酰 tRNA 的合成是蛋白质生物合成的第一步 由氨酰 tRNA 合成酶催化 氨酰 tRNA 合成酶既能识别氨基酸 又能识别 tRNA 第十五章蛋白质的合成8 0B 一一 活化活化 在 Mg2 的存在下 氨酰 tRNA 合成酶首先识别并结合专一的配体氨基酸 然后氨基酸的 羧基与细胞环境中的 ATP 发生反应形成一个酸酐型的高能复合物 氨酰 AMP 中间复合物 该中间复合物暂时结合在酶上 氨基酸 ATP 氨酰 AMP 酶 PPI 酶 二二 连接连接 由于氨酰 tRNA 合成酶上还存在专一的 tRNA 识别位点 因此特定的游离 tRNA 就会识 别并结合到氨酰 AMP 酶复合物的活性部位 此时氨基酸就会被转移到 tRNA 的 3 端 其羧基 与 tRNA 3 端的自由 OH 形成氨酰酯键 从而形成氨酰 tRNA 这也是一个高能化合物 其能 量足以形成肽键 由于氨酰 tRNA 能量低于氨酰 AMP 所以这一过程是可以自发的 氨酰 AMP 酶 氨酰 tRNA AMP 酶 氨基酸一旦与 tRNA 形成氨酰 tRNA 后进一步的去向就由 tRNA 来决定了 tRNA 凭借自 身的反密码子与 mRNA 上的密码子相识别 从而把所携带的氨基酸送到肽链的 一定位置上 每一个密码子对应的肽链位置上都能掺入正确的氨基酸 结论 1 氨基酸的活化和氨酰 tRNA 的合成是蛋白质生物合成的第一步 每一种氨基酸在被 掺入肽链之前都首先被活化和连接在专一 tRNA 上 活化和连接都发生在氨基酸的羧基上 2 载体 tRNA 凭借自身的反密码子与 mRNA 上的密码子相识别而把所携带的氨基酸 送到肽链的一定位置上 3 遗传信息是通过 mRNA 上的密码子与 tRNA 上的反密码子间碱基配对作用翻译出 来的 氨酰 tRNA 合成酶 每一种氨基酸都有至少一种专一的氨酰 tRNA 合成酶 它即能识别氨基酸 又能识别 tRNA 从而把特定的氨基酸连到对应的 tRNA 上 有人也把氨酰 tRNA 合成酶的双向识别功 能称为第二遗传密码 不同的氨酰 tRNA 合成酶在分子量 氨基酸序列 亚基组成上差异较大 它是如何识别 氨基酸的呢 仍不甚清楚 一些氨基酸由于结构上的显著特征容易识别如大小不同 Trp 与 Gly 带正负电荷 lys asp 而一些氨基酸结构极其相似 如 Ile 与 Val 仅差一个甲基 尽 管如此 tRNAIle合成酶也能正确识别 但有时也能错误的形成 Val tRNAIle 但是每一种氨酰 tRNA 第十五章蛋白质的合成9 0B tRNA 合成酶都有一个校正位点 由于大小原因 只有 Val tRNAIle才能结合到校正位点 然 后合成酶将 Val 又从 tRNAIle上将其水解下来 氨酰 tRNA 合成酶还能正确的识别和结合 tRNA 对于一些酶来说 tRNA 上的反密码子 是其识别特征 此外 tRNA 上的受体茎环 acceptor stem 也是识别特征 tRNA 分子的突变与校正基因 可以说 tRNA 是一个万能接头 1 对氨酰 tRNA 合成酶的识别位点 接头合成酶 2 3 端 CCA 上的氨基酸运载位点 接头氨基酸 装载 3 对核糖体的识别位点 将氨基酸运送到目的地 4 反密码子位点 接头 MRNA 验货并卸载 同复突变 突变型生物有时重所获得其原有的性状 这是通过突变型遗传物质的化学变 化而发生的 这种变化使遗传物质恢复到有功能的状态 重所获得原有的表型 这种过程称 为回复 被回复的生物称为回复子 回复突变的原因很多 其中有一种回复突变是由其在基因上发生一个突变引起的 这称 为基因校正突变 大多数较正突变发生在 tRNA 基因上 举例 基因间校正突变 图 当有某种 tRNA 突变分子出现时 必定还有可以识别正常密码子的该种 tRNA 存在 二 蛋白质合成的一般过程二 蛋白质合成的一般过程 蛋白质合成的一般过程如图图 18 3 可以分为三个阶段 起始 延伸 终止 分别由不同的起始因子 延伸因子和终止因子 释放因子 参与 一一 翻译起始翻译起始 1 小亚基与 mRNA 结合 2 起始氨酰 tRNA 进入 P 位点 它的反密码子与 mRNA 上的起始密码子 AUG 碱基配 对 3 大亚基与小亚基结合形成起始复合物 二二 延伸延伸 方向 mRNA 5 3 新生肽 N C 第十五章蛋白质的合成10 0B 1 就位 第二个氨酰 tRNA 通过密码子 反密码子的配对作用进入核糖体的 A 位点 氨 基位点 2 转肽 在大亚基上肽酰转移酶 peptidyl transferase 的作用下 A 位点氨基酸的 A 氨基亲核攻击 P 位点氨基酸的羧基基团并形成肽键 结果两个氨基酸均连到了 A 位点的 tRNA 上 该过程称为转肽作用 transpeptidation 此时 P 位点上卸载的 tRNA 从核糖体上 离开 3 移位 translocation 也可称转位 核糖体沿着 mRNA 移动 1 个密码子位置 携带 肽链的 tRNA 转位到 P 位点 A 位点空出以便接纳下一个氨基酸 三三 终止终止 由于终止密码子不能结合任何氨酰 tRNA 于是肽链合成的终止因子 又称释放因子 识 别并结合到终止密码子上 接着肽转移酶的酯化酶功能转变成水解功能 将肽链从 P 位点 tRNA 上水解掉 核糖体释放掉 mRNA 并解体成大小亚基 翻译结束 在翻译过程中除了核糖体大小亚基 mRNA 和氨酰 tRNA 外 还需要 GTP 和许多蛋白 辅助因子 这些辅助因子有的起催化作用 有的起改变和稳定构象作用 四四 翻译后加工翻译后加工 不论原核生物还是真核生物 翻译完成后 一些肽链能直接折叠成最终的活性形式 不 需要加工修饰 然而经常的情况是新生肽链需要加工修饰 称为翻译后加工或修饰 包括 1 切除部分肽段 蛋白酶 2 在特定氨基酸残基的侧链上添加一些基团 共价修饰 3 插入辅因子 还有些单肽要聚合成多亚基蛋白 翻译后加工有两方面目的 1 功能需要 2 定向转运的需要 这在真核生物中尤为复杂 合成的蛋白要定向运输到细胞质 质 膜 各种细胞器如叶绿体 线粒体 溶酶体 过氧化物酶体等 尽管原核生物与真核生物在蛋白质合成方面有许多相似之处 但也存在差异 这些差异 正是一些抗生素治疗和研究应用的基础 见表 18 2 表 18 2 蛋白质合成的选择性抗生素抑制剂 抗生素 作用 氯霉素 与 50S 亚基结合 抑制原核肽转移酶 cycloheximide 抑制真核肽转移酶活性 第十五章蛋白质的合成11 0B Erythromycin 抑制原核肽链延伸 链霉素 卡那霉素结合到原核 30S 亚基上引起读妈错误 导致合成的多肽连一级 结构改变 Tetracycline 与 30S 亚基结合 干扰氨酰 tRNA 的结合 三 原核生物的蛋白质合成三 原核生物的蛋白质合成 原核生物 大肠杆菌 每秒钟可翻译 20 个氨基酸 比真核生物快得多 而真核生物每分 钟才大约 50 个氨基酸 一一 翻译起始翻译起始 图 18 5 翻译是从形成起始复合物开始的 在原核生物中该过程需要三个起始因子参与 IF1 IF2 和 IF3 IF1的功能尚不清楚 1 IF3首先结合在 30S 亚基上 防止它过早地与 50S 亚基结合 2 mRNA 结合到 30S 亚基上 原核 mRNA 上在距起始密码子上游约 10bp 处有一段很短的 约 10bp 富含嘌呤的区域 称为 SD 序列 它能与 30S 亚基上的 16S rRNA 3 端的一段互补序列 不妨称反 SD 序列 配 对结合 mRNA 正是通过其 SD 序列与 16S rRNA 的配对结合而使它处于核糖体上的恰当的 位置 并使起始密码子 AUG 处于 P 位点 SD 序列与 16S rRNA 的配对还为识别起始密码子 和 Met 密码子提供了一种机制 原核多顺反子 mRNA 上的每一个基因都有自己的 SD 序列 起始密码子和终止密码子 每一个基因的翻译都是相对独立的 3 IF2 fMet tRNAfmet结合到 30S 亚基上 IF2是一个 GTP 结合蛋白 它先与 30S 亚基结合并促使起始氨酰 tRNA 的密码子与 mRNA 上的 AUG 结合 P 位点 原核生物的起始氨酰 tRNA 是 N 甲酰甲硫氨酰 tRNA fMet tRNAfmet 4 50S 大亚基结合到 30S 小亚基上 形成起始复合物 GTP 水解成 GDP 释放的能量引起 30S 亚基构象变化 50S 亚基结合到 30S 亚基上 同时 IF2 和 IF3 释放 因此 原核生物肽链合成的起始复合体由 mRNA 70S 核糖体 fMet tRNAfMet组成 二二 延伸延伸 肽链延伸分三步进行 1 新的氨酰 tRNA 进入核糖体的 A 位点 2 肽键形成 转肽 第十五章蛋白质的合成12 0B 3 核糖体移位 转位 这三步构成了肽链延伸的一个循环 1 新氨酰新氨酰tRNA入位入位 图 18 6 首先 在进入 A 位点之前 新氨酰 tRNA 必须与延伸因子 EF TU GTP 结合 延伸因 子 EF TU 是一个 GTP 结合蛋白 参与氨酰 RNA 的就位 氨酰 RNA 就位后 EF TU GTP 水解 EF TU GDP 从核糖体上释放下来 在第二个延伸因子 EF Ts 帮助下 EF Tu GDP 释放掉 GDP 并重新结合一分子 GTP 再生成 EF Tu GTP 2 肽键形成 转肽 肽键形成 转肽 肽键是在肽酰转移酶催化下形成的 现在认为肽酰转移酶活性存在于 50S 亚基 23S rRNA 上 驱动肽键形成的能量由 P 位点上的氨基酸与它的 tRNA 的高能肽酰酯键提供 新肽键形 成后 P 位点卸载的 tRNA 就离开核糖体 3 核糖体移位 核糖体移位 移位需要另一个 GTP 结合蛋白 EF G 延伸因子 又叫移位酶 的参与 现在认为 GTP 水解成 GDP 时释放出的能量促使核糖体构象发生变化 驱动肽酰 tRNA 从 位点移动到 位点 空下的 位点等待接纳下一个氨酰 tRNA EF Tu 机动蛋白 motor protein 多亚基的复合体 如核糖体 就象一个生化机器 它由几个相互作用的工作部件组成 机械性的工作是力与距离的产物 每一个生化机器的设计都能非常准确地保证所施用的力的 量 所产生运动的量与方向 最后完成一项特定的工作 其中的力通常由核苷酸结合蛋白提 供 称为 NTPae 实质上是机动蛋白 motor protein 或称机械化学转换器 mechanochemical transducers 因为 NTP ATP 和 GTP 的水解所造成的它自身构象的变化 驱动了相连分子的构象向所需的方向转变 这种 NTP 水解驱动的构象变化主要定位于一个固 定化的结构单元 称为开关 EF Tu 就是一个广泛研究的 GTP 结合机动蛋白 EF Tu 有三个结构域 domain 域 含有一个 GTP 结合位点和二个开关区 域 通 过一个柔软的肽段与域 相连 在结合 GTP 的活性状态下 EF Tu GTP EF TU 有一个 aa tRNA 结合位点 aa tRNA 与 EF Tu GTP 结合后的整个结构称为三元复合体 EF Tu 的三个域都参与 tRNA 的结合 域 的几个氨基酸残基与 tRNA 的 T C 环相互作 用 aa tRN 的反密码子从三元复合物上突出来 以便与 mRNA 的密码子相互作用 在蛋白质合成时 EF Tu GDP 非活性状态 与 EF Ts 相互作用释放出 GDP 随后域 的 GTP 结合位点结合一分子 GTP 并改变域 的两个开关区的构象 结果使域 与域 靠近 形成 个 aa tRNA 结合缝 binding cleft 一旦一个 aa tRNA 结合到该裂缝中 三元复合物 就进入核糖体 aa tRNA 的反密码子与 位点上 mRNA D 的密码子可逆结合 核糖体构象 第十五章蛋白质的合成13 0B 的变化触发 EF Tu 的 GTP 结合位点的构象变化 随后 GTP 水解使域 与域 分开 aa tRNA 被释放下来 EF TU GDP 离开核糖体 三三 终止终止 当终止密码子 UAA UAG UGA 进入 位点时肽链合成就进入终止期 原核生物有三 个释放因子 RF 1 RF 2 RF 3 参与终止 RF1识别 UAA 和 UAG RF2识别 UAA 与 UGA RF3作用尚不清楚 可能促进 RF1与 RF2 结合 这种识别过程需要 GTP 并改变了核糖体的构象 肽酰转移酶的功能发生瞬时变化 转 变成酯酶功能 将连接肽链与 P 位点 tRNA 的肽酰酯键水解开 肽链从核糖体上释放 mRNA 与 tRNA 解离 核糖体解体 原核生物蛋白质合成中的能量计算 合成一个二肽 ATPA GTP 高能键 甲酰 甲硫氨酰 tRNA 合成 ATP AMP 2 起始 IF 2 GTP GDP 1 第二个 a a tRNA 合成 ATP AMP 2 第二个 a a tRNA 进入核糖体 EF TU GTP GDP 1 核糖体移位 EF G GTP GDP 1 终止 GTP GDP 1 合成二肽 形成一个肽链 需 8 个高能键 其后每加一个 a a 需 4 个高能键 例 合成 200 个 a a 残基的多肽 8 198 4 800 4n 4 200 800 真核 起始多 1 个 ATP 和 1 个 GTP 四四 原核生物的翻译后加工原核生物的翻译后加工 一些新生肽链从核糖体上释放下来后就直接折叠成最终的三维结构 但多数情况下是新 生肽要经过一系列的加工修饰 才具有功能 有关翻译后加工修饰的许多信息都来自真核生 物中的研究 但是原核细胞中的多肽也要经过几种类型的共价修饰 1 切除加工切除加工 包括去掉 N 端的甲酰甲硫氨酸和信号肽序列 信号肽 Signal peptide 也叫引导肽 leader peptide 是决定多肽最终去向的一段序列 通常较短 典型情况下位于 N 端 在细菌中的 一个例子就是多肽要插入细胞质膜必须借助信号肽序列 第十五章蛋白质的合成14 0B 2 糖基化糖基化 尽管在原核生物中 绝大多数的复合糖是糖酯 但是 也有少量的糖蛋白的报道 例如 Halobacterium 细胞表面的糖蛋白 有关原核生物糖基化的机制及其功能都还不知道 3 甲基化甲基化 甲基转移酶利用硫酰苷甲硫氨酸对特定蛋白进行甲基化修饰 在大肠杆菌和有关细菌中发现的一种甲基转移酶能甲基化膜结合的化学受体蛋白的谷氨 酸残基 这种甲基转移酶和另外一种甲基酯酶催化的甲基化 去甲基化过程在细菌趋化性的信 号转导中起重要作用 4 磷酸化磷酸化 近年来 已经发现由蛋白激酶和蛋白磷酸化酶催化的蛋白质磷酸化 去磷酸化在原核生物 中十分普遍 磷酸化 去磷酸化的意义还不太清楚 目前只知在细菌趋化性和氮代谢调空中有 瞬间的磷酸化作用 五五 原核生物的翻译调控原核生物的翻译调控 蛋白质的合成是一个非常耗能的过程 每形成一个肽键要消耗 4 个高能磷酸键 tRNA 装 载 2 个 aa tRNA 入位 1 个 移位 1 个 在大肠杆菌中 用于合成的能量 90 都给了蛋白质 合成 因此 其合成必然要受到严格的调控 在原核生物中 蛋白质合成的调控多在转录的水平上 操纵子模型 有如下几个原因 1 转录与翻译直接偶联 转录后不久就开始翻译 图 18 7 2 原核生物 mRNA 的半衰期很短 大约 1 3 分钟 随着环境条件的改变 细胞内产 生的 mRNA 种类会迅速改变 大多数 mRNA 被两种核酸外切酶降解 RNAaseII 和多核苷酸 磷酸化酶 除了转录调控机制外 mRNA 翻译速率也是调控位点 这种翻译速率的调控大多是由于 SD 序列的差异造成翻译起始效率的不同 因为 SD 帮助识别 AUG 和启动翻译的起始 因此 SD 序列的变化能影响翻译的起始效率从而调控了 mRNA 的翻译速率 乳糖操纵子的基因产 物有 3 个 半乳糖苷酶 半乳糖透过酶 半乳糖苷转甲基酶 各个顺反子 即基因之间 常有一段非编码的间隔区 不同间隔区的长度变化 可以在 1 100 个之间 甚至可以重叠 但是它们的翻译量是不等的 硫代半乳糖苷转甲基酶的量只有 半乳糖苷酶的 1 5 硫代半乳 糖苷酶的功能不清楚 乳糖发酵通常都是在不能产生它的突变细胞中进行的 乳糖将纵子 产物 第十五章蛋白质的合成15 0B Z 基因产物 半乳糖苷酶 1 Y 基因产物 半乳糖透性粉 0 5 A 基因产物 半乳糖乙酰化酶 0 2 除了 SD 序列的差异外 原核生物还有一种调控机制 相对过剩的蛋白质翻译产物对自 身多顺贩子 mRNA 翻译的负调控 也就是说 多顺贩子 mRNA 的其中一个产物相对过剩时 能抑制整个多顺贩子 mRNA 的翻译 图 18 8 原核核糖体的 55 种蛋白质由 20 个操纵子编码 细菌的良好生长要求这些蛋白质的合成 之间及其与 rRNA 的合成之间协调起来 例如 PL11 操纵子编码核糖体蛋白 L1 和 L11 如果 L1 相对过剩就会占用了可利用的 23SrRNA 结果抑制 PL11mRNA 的翻译 在 23SrRNA 缺乏 的情况下 L1 蛋白也会结合在 PL11mRNA 的 5 端抑制自身操纵子的翻译 结论 1 原核生物蛋白质的合成相对较快 它需要起始因子 IF 1 IF 2 I 3 延伸因子 EF TU EF TS EF G 释放因子 RF 1 RF 2 RF 3 的参与 2 尽管原核生物基因的表达多在转录水平上进行调控 但翻译水平上的调控也时有发 生 包括 SD 序列对翻译起始的调控和相对过剩的翻译产物对自身多顺反子 mRNA 翻译的负 调控 四 真核生物的蛋白质合成四 真核生物的蛋白质合成 蛋白质合成的研究最早是在哺乳动物细胞内进行的 入氨酰 tRNA 合成酶和 tRNA 的发 现 但到 60 年代后注意力却集中到了细菌 原因很简单 细菌细胞易于培养 细菌基因的 表达较简单也易于操作 进入 70 年代后 真核细胞的蛋白质合成又变成了研究的热点 真核细胞的蛋白质翻译需要大量的蛋白因子 翻译后加工和定向输送比原核复杂得多 一一 翻译起始翻译起始 真核的翻译起始比原核尤为复杂 原因如下 1 真核 mRNA 的二级结构更为多样和复杂 2 真核 mRNA 是经过多重加工的 它被转录后首先要经过各种加工才能从细胞核进 入细胞质中 并形成各种各样的二级结构 一些 mRNA 与几种类型的蛋白质结合在一起形成 一种复杂的颗粒状 有时称核糖核蛋白粒 ribonucleoprotein particle 在翻译之前 它的二级 结构必须改变 其中的蛋白质必须被去掉 3 核糖体需要扫描 mRNA 以寻找翻译起始位点 真核 mRNA 没有 SD 序列来帮助识别翻译起点 因此核糖体要扫描每一个 mRNA 核糖 第十五章蛋白质的合成16 0B 体结合到 mRNA 的 5 端的帽子结构并向 3 端移动一寻找起始位点 这种扫描过程很复杂 知之甚少 真核的翻译起始用到的起始因子 eIF 至少有 9 种 多数的功能仍需进步研究 翻译起始物的形成过程如下 图 18 9 1 40S 小亚基 eIF 3 结合到 eIF 2 GTP Met tRNAi复合物上形成 40S 前起始复合物 40S preinitiation complex 这里 eIF 2 GTP 介导了起始 tRNA 与 40S 小亚基的结合 然后 eIF 2 GDP 通过 eIF 2B 鸟苷酸释放蛋白 再生 此时 由于 eIF 3 和 40S 小亚基相结合 eIF 6 和 60S 大亚基相结合 所以小亚基暂时还 不能与大亚基相结合 2 mRNA 结合到 40S 前起始复合物上形成 40S 起始复合物 该过程需要 ATP 另外还需要一些起始因子 eIF 4A eIF 4B eIF 4F eIF 1 eIF 4F 结合在 mRNA5 端的帽子结构上 eIF 4A 一种 ATPase 和 eIF 4B 一种 helicase 改变 mRNA 的二级结构 对真核起始因子的鉴定发现一些起始因子是更大因子的组成亚基 如 eIF 4E 也称 cap 结合蛋白或 CBP 就是由几个 eIF 4F 亚基组成 eIF 4F 常称为 CBP 3 40S 起始复合物扫描 mRNA 寻找适当的起始密码子 通常是 5 端附近的 AUG 4 40S 复合物与 60S 大亚基结合形成 80S 起始复合物 该过程另需 1 个 GTP 此时 60S 大亚基上的 eIF 6 已经被释放 在形成复合物过程中 在 eIF 5 参与下 eIF 2 GTP 水解成 eIF 2 GDP eIF 2 eIF 3 eIF 4A eIF 4B eIF 4F eIF 1 从起始复合物上释放 因此 真核生物肽链合成起始复合物由 mRNA 80S 核糖体和 Met tRNAiMet组成 与原 核相比 真核起始多消耗了 1 个 ATP 形成 40S 起始复合物 1 个 GTP 形成 80S 起始复合 物 二二 延伸延伸 图 18 10 与原核类似 也可分为 aa tRNA 的入位 转肽 移位三步反应 1 入位入位 50kD 的延伸因子 eEF 1 GTP 与 aa tRNA 结合 引导 aa tRNA 进入 A 位点 aa tRNA 的 第十五章蛋白质的合成17 0B 反密码子如果与 mRNA 的密码子正确配对后 eEF 1 GTP 水解掉一个 P 随后 eEF 1 GDP 离开核糖体 留下 aa tRNA 在 eEF 1 eEF 1 的帮助下 eEF 1 GDP 再生为 eEF 1 GTP 在真菌 如酵母 中 需要另一个延伸因子 eEF 3 与 eEF 1 共同引导 aa tRNA 的入位 2 肽键形成 转肽 肽键形成 转肽 核糖体大亚基的肽酰转移酶活性催化 A 位点 氨基亲核攻击 P 位点的 aa 的羧基 在 A 位点形成一个新的肽键 P 位点上卸载的 tRNA 从核糖体上离开 3 移位移位 移位需要一个 100kD 的延伸因子 eEF 2 GTP eEF 2 GTP 结合在核糖体未知的位置上 GTP 水解成释放的能量使核糖体沿 mRNA 移动一个密码子的位置 然后 eEF 2 GDP 离开核 糖体 三三 终止终止 真核细胞中有两个释放因子 eRF 1 和 eRF 3 GTP 结合蛋白 介导终止 当 GTP 结合到 eRF 3 后它的 GTPase 活性就被激活 eRF 1 和 eRF 3 GTP 形成一个复合物 当 UAG UGA UAA 进入 A 位点时 该复合物就结合到 A 位点上 接着 GTP 水解促使释放因子离开核糖体 mRNA 被释放 核糖体解体成大小亚基 新生肽在肽酰转移酶催化下被释放 真核生物蛋白质合成中的能量计算 合成一个二肽 ATPA GTP 高能键 甲硫氨酰 tRNA 合成 ATP AMP 2 起始 IF 2 2GTP GDP ATP ADP 3 第二个 a a tRNA 合成 ATP AMP 2 第二个 a a tRNA 进入核糖体 eEF 1 GTP GTP GDP 1 核糖体移位 eEF 2 GTP GTP GDP 1 终止 eRF 3 GTP GTP GDP 1 合成二肽 形成一个肽链 需 10 个高能键 其后每加一个 a a 需 4 个高能键 例 合成 200 个 a a 残基的多肽 10 198 4 802 4n 2 4 200 2 802 四四 真核生物的翻译后加工真核生物的翻译后加工 许多新生肽要经过一种或几种共价键修饰 这种修饰可以在正延伸着的肽链中进行 一 般情况下 翻译后修饰一是为了功能上的需要 另一种情况是折叠成天然构象的需要 包括 1 切除加工切除加工 典型的情况包括切除 N 端甲硫氨酸 信号肽序列和切除部分肽段将无活性的前体转变成 第十五章蛋白质的合成18 0B 活性形式 我们知道 一些酶的前体 称为前体酶 proenzyme 或酶原 zymegen 只有切除特定的肽 段后才能从无活性形式转变成活性形式 无活性的多肽前体称为前体蛋白 proprotein 图 18 11 是胰岛素的翻译后加工 包含信号肽的胰岛素前体称为前胰岛素原 pre proinsulin 去掉信号肽的胰岛素的前体 称为胰岛素原 proinsulin 进一步切除称为 C 链的肽段后才能形成活性形式的胰岛素 insulin 蛋白质内含子 90 年代初 发现了两类新的内含子 一类是蛋白质内含子 其 DNA 序列与外显子一起转录和翻译 产生一条多肽链 然后 从肽链中切除与内含子对应的 a a 序列 再把与外显子对应的氨基酸序列连接起来 成为有功 能的蛋白质 另一类是翻译内含子 mRNA 中存在与内含子对应的核苷酸序列 在翻译过程中这一序 列被 跳跃 过去 因此产生的多肽链不含有内含子对应的氨基酸序列 2 糖基化糖基化 真核生物中糖基化修饰很普遍 但是糖基基团的功能还不是十分清楚 通常情况下 分 泌蛋白的寡糖链较复杂 而内质网膜蛋白含有较高的甘露糖 图 18 12 是 N 糖苷键型核心寡糖链的合成 它是在磷酸多萜醇上组装成的 多萜醇存在于 所有细胞的细胞膜上 磷酸化多萜醇主要存在于内质网膜 3 羟基化羟基化 在结缔组织的胶原蛋白和弹性蛋白中 pro 和 lys 是经过羟基化的 此外 在乙酰胆碱酯酶 降解神经递质乙酰胆碱 和补体系统 参与免疫反应的一系列血清蛋白 都发现有 4 羟辅 氨酸 位于粗糙内质网 RER 上的三种氧化酶 脯氨酰 4 羟化酶 prolyl 4 hydroxylase 脯 氨酰 3 羟化酶和赖氨酰羟化酶 lysylhydroxylase 负责特定脯氨酸和赖氨酸残基的羟化 脯 氨酰 4 羟化酶只羟化 Gly x pro 脯氨酰 3 羟化酶羟化 Gly pro 4 Hyp Hyp hydroxyproline 赖氨酸羟化酶只作用于 Gly X lys 胶原蛋的脯氨酸残基和赖氨酸残基羟化需要 Vc 饮食中 Vc 不足时就易患坏血症 血管脆弱 伤口难愈 原因就是胶原纤维的结构不力 weak collagen fiber structure 4 磷酸化磷酸化 蛋白磷酸化参与代谢调控和信号转导以及蛋白与蛋白之间的相互作用 例如 PDGF 受 体的酪氨酸残基经过自身磷酸化后才与细胞质定位蛋白质结合 5 亲脂修饰亲脂修饰 蛋白质亲脂修饰后可以改变膜结合能力和特定的蛋白与蛋白之间的相互作用 最常见的 第十五章蛋白质的合成19 0B 亲脂修饰是酰化和异戊二烯化 尽管豆蔻酸在真核细胞中很罕见 但是豆蔻酰化却是最常见 的酰化形式之一 N 豆蔻酰化 豆蔻酸以酰酰氨键形式共价连在肽链 N 端的残基上 能增加 特定 G 蛋白的 亚基对膜结合的 亚基的亲和力 6 甲基化甲基化 通过甲基转移酶进行 天冬氨酸的甲基化能促进已破坏蛋白的修复或降解 在 2 3 二磷 酸核酮糖羧化酶 rihilose 2 3 biosphosphate carboxylase 钙调蛋白 calmodulin 组氨酸 histone 某些核糖体蛋白和细胞色素 C 中都有甲基化的赖氨酸残基 其它可甲基化的氨基 酸残基还有 His 如组蛋白 视紫红质 eEF 2 Arg 如休克蛋白 核糖体蛋白 7 二硫键形成二硫键形成 二硫键通常只发现于分泌蛋白 如胰岛素 和某些膜蛋白中 在细胞质中由于有各种还 原性物质 如谷胱甘肽 glutathione 和硫氧还蛋白 thioredoxin 所以细胞质蛋白没有二硫键 因为内质网腔是一个非还原性环境 所以粗糙内质网上的新生肽只暂时形成二硫键 当新生 肽进入内质网腔时 一些肽链可能会按氨基酸次序依次暂时形成二硫键 但最终会通过交换 二硫键位置的形式形成正确的结构 内质网中可能还有一种二硫键异构酶 disulfide isomerase 催化该过程 五五 真核生物的翻译调控