半胱氨酰白三烯受体对水孔蛋白4介导脑水肿的调节(to students).doc

半胱氨酰白三烯受体对水孔蛋白4介导脑水肿的调节Modulating roles of cysteinyl leukotriene receptors in aquaporin 4-mediated brain edema（国家自然科学基金面上项目）摘要：半胱氨酰白三烯及水孔蛋白4（AQP4）是脑水肿重要调节因素，但尚不清楚半胱氨酰白三烯受体（CysLT1和CysLT2）是否通过调节AQP4而影响脑水肿。本项目拟阐明CysLT1和CysLT2受体是否能调节脑肿瘤及脑缺血后的AQP4介导的脑水肿。在脑肿瘤病人的脑样本，观察CysLT1、CysLT2受体和AQP4表达；在原代培养的人脑肿瘤细胞，观察CysLT1和CysLT2受体对AQP4表达及功能的调节。在大鼠局灶性脑缺血，观察缺血后脑水肿与CysLT1、CysLT2受体和AQP4表达的关系；在原代培养大鼠星形胶质细胞，观察CysLT1和CysLT2受体对AQP4表达及功能的调节。在原代星形胶质细胞及AQP4转染的C6胶质瘤细胞，初步确认CysLT1和CysLT2受体对AQP4调节过程的信号转导特点。本项目将评价CysLT受体激动剂或拮抗剂对脑水肿的治疗价值。（一）立项依据与研究内容1项目的立项依据1脑水肿基本特点脑水肿是多种病因引起的脑病理变化，基本变化是脑组织水分增加，导致脑组织肿胀，其后果是颅内压增高，损害神经功能，严重者造成脑疝等而危及生命。脑水肿有3种基本类型：血管性、细胞性和渗透压性脑水肿。血管性脑水肿（vasogenic brain edema）是由于血脑屏障通透性增高，导致血浆蛋白渗漏到细胞间隙，造成细胞间隙胶体渗透压增高而导致脑组织肿胀；细胞性脑水肿（cytotoxic brain edema）是由于细胞能量代谢障碍，导致离子泵（如Na+-K+-ATP酶、Na+-K+-2Cl-同向转运体等）转运功能失调，离子蓄积在细胞内而导致细胞肿胀；渗透压性脑水肿（osmotic brain edema）是由于血浆渗透压低于脑组织渗透压，而造成脑组织肿胀1。虽然引起脑水肿的原因不一样，但是组织间或细胞内外水的转运是构成脑水肿的基本改变，而这种水的转运涉及到细胞的水孔蛋白（又称水通道, aquaporins, AQPs）2。2水孔蛋白（AQPs）及其与脑水肿的关系（1）AQPs的一般特点水孔蛋白是一组转运水的膜蛋白，而水是所有生物体细胞中必需的小分子。1988年，从人的红细胞中第一次确定出分子量28 kDa的膜蛋白，并在非洲爪蟾卵母细胞中表达，这个蛋白被称为水孔蛋白1（AQP1）。迄今为止，在哺乳动物中发现AQPs有 13种亚型：AQP0AQP12，按功能分成两类：第一类选择性通透水分子，包括AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP8；第二类可通透水分子及甘油等溶质，包括AQP3、AQP7、AQP9、AQP10；此外，AQP0、AQP11和AQP12的通透特性尚不清楚3。AQPs约有270个左右的氨基酸组成，分子量约为30 kDa，有通透水分子的特殊构型。例如，AQP1的N-和C-末端均在细胞内，由6个跨膜区和5个袢（AE）组成，B和E袢有天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（NPA）结构，该两个袢在细胞膜形成水孔道，形状类似于“砂漏（hourglass）”；四个AQP1分子组成四聚体结构，其中一个AQP1分子的细胞外部分有一个长的多糖链。AQP4的分子结构与AQP1相似。脑内有AQP1、3、4、5、8、9六种亚型表达，对AQP1、4、9的表达和功能已有一定的了解。AQP4是目前认为脑内最主要的AQP亚型，人类AQP4基因定位于18号染色体上，编码的31 kDa蛋白和带N-末端序列的34 kDa蛋白，这两种异构体在脑中都有表达。AQP4主要分布在脑内星形胶质细胞及其突起，也表达在室管膜细胞以及脑血管内皮细胞，是调节脑内水平衡的一种主要机制。脑内AQP4的突出特点，是密集表达在包绕脑微血管或蛛网膜的星形胶质细胞足突（end feet）膜上，而在非足突地胞体表面表达较少，与其水平衡调节功能一致4, 5。其他两种脑内的AQPs中，AQP1主要表达于脉胳丛的绒毛顶端，能调节脑脊液生成4；AQP9（主要表达在肝脏）在脑内主要表达在三类细胞：胶质细胞（如星形胶质细胞、室管膜细胞等）、血管内皮细胞及神经元，其功能较复杂，处理了水分子外，还能转运甘油和单羟基化合物（如乳酸），可能在脑内能量代谢中发挥作用，将乳酸从胶质细胞转运到神经元6。（2）APQP4与脑水肿已经有大量证据表明，脑内AQP4与脑水肿发生有密切关系，其中最典型的是脑肿瘤及脑缺血伴随的脑水肿。A脑肿瘤 脑水肿是脑肿瘤主要变化之一，其发生主要是因为肿瘤破坏血脑屏障完整性，使血浆样液体进入细胞间隙，引起血管性水肿7, 8。近年来发现，AQP4对脑肿瘤水肿起主要调节作用，参与脑内水分经胶质屏障回到血管或脑室的消除过程，可限制肿瘤细胞中的液体流向细胞间隙7, 8。在人恶性胶质细胞瘤及其瘤周星形胶质细胞，AQP4表达增加10-11。并且，发现AQP4高表达于高恶性度星形胶质细胞瘤，而很少表达在低恶性度的肿瘤9；在恶性胶质细胞瘤中心及其周围高表达AQP4，但在肺癌的脑转移病灶，AQP4仅表达于肿瘤周围而不表达于肿瘤中心10。在AQP4基因敲除小鼠，脑肿瘤时的颅内压增高及神经症状也更明显7, 8, 12。B脑缺血 脑水肿也是脑缺血后主要变化之一，其发生主要原因是脑能量代谢障碍引起细胞功能损害及离子转运失调（细胞内离子蓄积），而造成细胞内水分蓄积而形成细胞性水肿；其次，也损害血脑屏障功能，因而血管性水肿也参与脑缺血后的水肿。胶质细胞的AQP4可促进水分从细胞间隙流向细胞内，造成胶质细胞水肿，这是构成缺血后脑水肿的主要因素；但同时也促进血管性水肿的消除12。在缺血性脑梗死病人的脑样本中，AQP4在梗死灶周围的星形胶质细胞足突及室管膜旁区表达增高13。在大鼠局灶性脑缺血后，AQP4表达增加，并且与细胞性水肿相关，与血管性水肿并不相关14。以磁共振检测的幼年大鼠低氧性脑缺血诱导的脑水肿，与AQP4表达增加密切相关15。在小鼠星形胶质细胞转染内皮素-1（ET-1）基因，使之表达增强后，可增强局灶性脑缺血引起的脑水肿16。在AQP4基因敲除小鼠，脑缺血引起的脑水肿减轻，存活率增加，改善神经功能，其超微结构变化表明血管周围星形胶质细胞足突肿胀明显减轻，表明可AQP4缺损可增加对细胞性脑水肿的耐受力9, 12。此外，在易发脑卒中的自发性高血压大鼠，脑微血管周围星形胶质细胞的AQP4表达增加，与其血脑屏障脆弱密切相关17。C其他病因引起的脑水肿 除了以上两类常见的脑水肿外，脑外伤可引起AQP4增加10, 18；在多发性硬化、HIV脑炎、多灶性白质脑病等病人的脑样本中，AQP4在炎症病灶星形胶质细胞的表达增加19；在AQP4基因敲除小鼠，葡萄球菌性脑膜炎伴随的局部水肿加重20。这些结果证实，AQP4参与多种病因的脑水肿的发生。（3）AQP4介导脑水肿的调节因素目前，关于AQP4调节的研究很少。但已有以下报道，谷氨酸可诱导大鼠星形胶质细胞肿胀，并伴有AQP4表达增加，其中皮层和海马分离的星形胶质细胞比小脑分离的细胞更加敏感21；脑内注射LPS激活小胶质细胞后，可促进AQP4表达22；在卵巢切除大鼠给予雌二醇可预防LPS诱导的血脑屏障破坏及AQP4表达增加23；在大鼠脑外伤后1、6、24、48 h皮下注射孕酮16 mg/kg，可抑制脑外伤后72 h脑内AQP4表达18；脱水剂甘露醇可促进大鼠星形胶质细胞合成AQP424等。脑肿瘤和脑缺血后均伴有炎症变化，与脑水肿形成有密切关系，并且也在多种脑炎症中发现AQP4相关的脑水肿19, 20。但是，炎症过程如何调节AQP4而影响脑水肿形成，尚无具体研究。由于膜磷脂来源的花生四烯酸产物是一类重要的炎症介质，这些介质与AQP4介导的脑水肿很可能存在某种调节关系。花生四烯酸有环氧酶（cyclooxygenase, COX）和脂氧酶（lipoxygenase, LOX）两条主要代谢途径，其中了解得较清楚的LOX是5-LOX，5-LOX产物有白三烯B4（leukotriene B4, LTB4）和半胱氨酰白三烯类（cysteinyl leukotrienes, CysLTs, 包括LTC4、LTD4和LTE4）。CysLTs在炎症中的作用非常重要，其作用通过半胱氨酰白三烯（CysLT）受体，因此，CysLTs及CysLT受体是否参与调节AQP4介导的脑水肿形成值得关注。3半胱氨酰白三烯及其受体与脑水肿的关系（1）半胱氨酰白三烯受体一般特点CysLTs受体有CysLT1和CysLT2两种亚型，均为Gaq蛋白偶联的7次跨膜受体，人CysLT1和CysLT2受体的氨基酸相同性为37.3%。CysLT1受体有较多的选择性拮抗剂如Pranlukast、Montelukat、Zafirlukast等，因此，CysLT1受体功能研究得比较系统。目前为止，还缺乏CysLT2受体选择性拮抗剂，仅有CysLT1/CysLT2受体非选择性拮抗剂FPL-55712和Bay u9773，故CysLT2受体功能了解得相对较少25-26。在外周组织，CysLT受体主要介导以下四类效应26：血管及平滑肌效应，CysLT1 受体介导微血管通透性增高及支气管平滑肌收缩，CysLT2受体介导内皮细胞激活，介导微血管通透性增高和血压降低效应27；免疫效应，CysLT1 受体介导树突状细胞的成熟和迁移；炎症效应，CysLT1 受体介导巨噬细胞激活、造血祖细胞募集、嗜酸性粒细胞分泌IL-4、肥大细胞分泌IL-5、TNF-a、MIP-1b，CysLT2受体介导巨噬细胞激活、肥大细胞分泌IL-8；组织修复效应，CysLT1 受体介导平滑肌细胞增殖，抑制博莱霉素诱导的肺纤维化28；CysLT2受体介导纤维化反应，促进博莱霉素诱导的肺纤维化29。关于CysLT受体的信号转导特点，已有Ras-ERK及p38 MAPK两条通路被证实。其一，在单核细胞前体细胞株U937细胞，CysLT1受体与配体结合后，与Gaq/11或Gai相互作用，激活PLC产生第二信使物质IP3，进而增高细胞内Ca2+，然后激活Ras-ERK信号途径30；在星形胶质细胞也证明，CysLT1受体通过ERK1/2磷酸化，促进细胞增殖31。其二，LTC4通过激活p38 MAPK介导气道上皮细胞产生TGFb132，LTD4通过激活p38 MAPK介导肾小球系膜细胞增殖33。此外，拮抗剂实验还证明，CysLT1受体可通过激活转录调节因子NF-kB促进VEGF表达，促进细胞增殖34。但是，CysLT2受体的信号转导特点，以及两类受体在神经元的信号转导特点尚不清楚。（2）脑内半胱氨酰白三烯受体以往，CysLT受体在脑内分布的研究报道很少，仅有Northern blot结果。我们首次在人脑组织样本证明，CysLT1受体主要表达在血管内皮细胞，而CysLT2受体主要表达在血管平滑肌细胞，在脑外伤和脑肿瘤病人，两种受体均可诱导表达在神经元和胶质细胞35, 36。我们在大鼠局灶性脑缺血模型还证明，缺血中心区CysLT1受体表达增加，在缺血后36小时和714天有两个峰，而在缺血周边区仅在714天增加；缺血中心区CysLT1受体在缺血24小时表达于神经元，14天后表达在小胶质细胞，而缺血周边区则在14天后表达于增生的星形胶质细胞；结果提示，CysLT1受体与脑缺血急性期的神经元损失以及后期的胶质细胞增生有关37。另据报道，CysLT1受体还表达在体外培养的星形胶质细胞，调节细胞增殖反应31。此外，我们首次证实CysLT1受体拮抗剂Pranlukast（ONO-1078）对大鼠、小鼠局灶性及全脑缺血有保护作用，可减小梗死体积、增加存活神经元数量、降低血脑屏障通透性、减轻脑水肿38-41；还进一步证实，另一CysLT1受体拮抗剂Montelukast对小鼠局灶性脑缺血的保护作用42；Pranlukast还可减轻小鼠局灶性脑缺血后的慢性损伤，抑制星形胶质细胞疤痕形成43。我们还测定了局灶性脑缺血后CysLTs含量，证实损伤与CysLTs增高相关联（待发表资料）。这些结果均说明CysLT1受体介导脑缺血性损伤。（3）半胱氨酰白三烯受体与脑水肿的关系A脑肿瘤 已经有较多证据表明，CysLTs通过其受体介导恶性脑肿瘤周围的水肿。例如，在脑转移瘤、恶性神经上皮瘤等恶性脑肿瘤病人，其瘤周水肿指数高于脑膜瘤及蛛网膜下腔出血病人（作为对照），并且，水肿指数与瘤周LTC4合成量呈正比44, 45。在脑肿瘤病人还发现，CysLT合成酶（5-脂氧酶）表达与瘤周水肿密切相关46。我们最近发现，人脑肿瘤时，瘤周神经元及胶质样细胞有CysLT1和CysLT2受体诱导表达现象，进一步表明该类受体与脑肿瘤及其诱导的脑水肿之间的关系35, 36。B脑缺血 早年的研究已经表明，CysLTs是一类调节血脑屏障的经典炎症介质，例如，脑缺血时CysLTs增高并与缺血后脑水肿密切相关47，5-脂氧酶抑制剂AA-861可降低脑缺血后LTC4合成，同时减轻脑水肿程度48，在PLA2基因敲除小鼠，也减少脑内LTC4合成及减轻脑水肿等损伤症状49。近年来，在人脑微血管内皮细胞培养中，发现LTC4可增加细胞对荧光素的清除，表明CysLT受体参与血脑屏障通透性的提高50。我们最近的研究表明，人及大鼠脑微血管内皮细胞表达CysLT1受体35, 37，这一特点与CysLT1受体拮抗剂减轻脑缺血后血脑屏障通透性增高，减轻脑水肿的作用38-40相符。我们最近还发现，小鼠皮层注射LTD4可诱导脑水肿，并上调星形胶质细胞AQP4表达；在原代细胞培养中也证实，LTD4诱导星形胶质细胞增生及AQP4 表达，并且CysLT1/CysLT2受体非选择性拮抗剂Bay u9773有明显的抑制作用，而CysLT1受体选择性拮抗剂无明显作用（待发表资料）。这一结果反映脑缺血时释放的CysLTs可通过诱导AQP4表达而调节脑水肿形成，并且可能CysLT2受体介导这种调节。4需要解决的问题（1）CysLT受体是否通过AQP4调节脑水肿目前，虽有一些关于AQP4调节的研究，但很不充分且很零散，特别是还缺乏对于与脑水肿密切相关的炎症介质，是否及如何调节AQP4而影响脑水肿的研究。据目前的认识，CysLTs通过CysLT受体调节血脑屏障通透性，但是，其最终结果或其中一种可能是否通过调节AQP4而促进水转运？目前，尚无研究报道。我们基于以下理由推测可能存在这种调节关系。其一，两类分子均为脑水肿的重要调节因素，很可能存在这种调节关系。其二，两类分子的信号转导有共同之处，甘露醇通过激活p38 MAPK途径诱导大鼠星形胶质细胞表达AQP424；而LTC4通过激活p38 MAPK介导气道上皮细胞产生TGFb132，LTD4通过激活p38 MAPK介导肾小球系膜细胞增殖33。其三，我们已经在大鼠皮层注射及原代培养星形胶质细胞实验中，发现LTD4可增大细胞体积并上调AQP4表达，且可能与CysLT2受体有关，因此，已经具备进一步深入研究的可行性。（2）CysLT受体亚型对两类典型的脑水肿调节作用的异同点及其意义同样，虽有证据表明CysLTs可能通过CysLT受体调节脑水肿形成，这些证据主要是应用受体激动剂、拮抗剂或CysLTs合成酶（5-脂氧酶等）抑制剂等；但是，还缺乏连接CysLT受体与脑水肿关系的直接证据，如受体分子在脑水肿形成过程中的变化及其两者的相关性。此外，也不清楚是CysLT1还是CysLT2受体参与调节。越来越多外周组织的证据表明，CysLT1和CysLT2亚型在功能上的差异，这将对今后选择性拮抗剂研究及应用提供基础。但是，在诱导脑水肿方面有无差异，目前尚无报道。同时，CysLTs如能调节AQP4表达及功能，又是哪种亚型介导该作用？不同受体亚型是否在脑缺血或是脑肿瘤诱导脑水肿方面存在差异？这些均有待阐明。（3）脑水肿治疗的药理学意义治疗脑水肿具有非常重要的临床意义，目前常用脱水剂、白蛋白、利尿剂、糖皮质激素、抗自由基等药物，存在疗效有限、容易加重脑水肿、不良反应多等问题，需要在阐明脑水肿机制的基础上，进一步探索更有效、安全的新治疗途径。根据现有AQP4的认识，对脑肿瘤伴发的血管性水肿，需要通过促进AQP4表达及其功能来减轻脑水肿；对脑缺血伴发的细胞性水肿为主的状况，需要通过抑制AQP4 表达及其功能来减轻脑水肿。本项目如能阐明CysLT1和CysLT2受体在这两类脑水肿的不同调节作用，并且说明其调节作用的信号转导特点，就能深化CysLT受体中枢作用及脑水肿发生机制的认识，并有可能研制针对不同类型脑水肿的治疗药物。（4）本项目拟定目标鉴于以上存在问题及研究意义，本项目拟在人脑肿瘤细胞及大鼠局灶性脑缺血模型上，阐明三个问题：半胱氨酰白三烯是否参与调节不同类型（脑肿瘤和脑缺血）的AQP4表达以及水肿形成；CysLT1和CysLT2受体在这种调节中的不同特点；CysLT1和CysLT2受体调节AQP4表达的信号通路。本项目的最终目的在于：为CysLT受体激动剂或拮抗剂在脑水肿治疗中的价值作出评价。主要参考文献1 Unterberga AW, et al. 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Acta Neurochir Suppl 2000; 76:29-34.2项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题研究目标（1）阐明半胱氨酰白三烯是否参与调节不同类型脑水肿（脑肿瘤和脑缺血）的AQP4表达以及水肿形成。（2）阐明CysLT1和CysLT2受体在这种调节中的不同特点。（3）初步说明CysLT1和CysLT2受体调节AQP4表达的信号通路。最终为CysLT受体激动剂或拮抗剂在脑水肿治疗中的价值作出评价。研究内容本项目拟在人脑肿瘤及原代肿瘤细胞观察CysLT1和CysLT2受体调节AQP4表达的作用，与脑水肿及水通透特点的关系；在大鼠（或小鼠）局灶性脑缺血观察CysLT1和CysLT2受体调节AQP4表达的作用，与脑水肿及水通透特点的关系，以及相关的信号转导特点。最终阐明CysLT受体亚型调节不同类型脑水肿的特点以及治疗学意义。研究的基本内容见以下流程图。1脑肿瘤获取伴有脑水肿（MRI或CT影像证实）的脑肿瘤病人的脑样本，作以下观察：（1）分析CysLT1/CysLT2受体与AQP4在神经元或胶质细胞分布上的相互关系A脑样本分为三种类型：恶性胶质细胞瘤，本身可表达AQP4；来自外周器官的脑转移瘤，本身不表达AQP4，但在肿瘤周围可表达AQP4；对照样本，取自良性脑膜瘤周围组织、脑出血手术等非恶性肿瘤组织，AQP4表达少，并且无脑水肿或选择脑水肿轻微者。每份脑样本均有完整的临床资料及影像学资料，并对肿瘤有明确的病情严重程度分级；其临床诊断以出院时的最后诊断为准，病理诊断由病理医师做出。B以免疫组化双重荧光染色方法，检测肿瘤中心及周边区域CysLT1和CysLT2受体与AQP4共表达，并且，鉴定免疫染色阳性细胞是星形胶质细胞还是神经元。C分析不同类型样本的CysLT1/CysLT2受体及AQP4表达特点，结合影像学资料分析这些分子与脑水肿的关系；结合临床分级分析这些分子与病情严重程度的关系。（2）脑肿瘤细胞原代培养及CysLT受体与AQP4的关系A选择部分恶性胶质细胞瘤及脑转移瘤病人，在手术切除后，即刻将肿瘤组织酶解后作原代培养。来自外周器官的脑转移瘤细胞用作缺乏AQP4的对照细胞。B在肿瘤细胞原代培养35代后，采用免疫组化和Western blot方法用于分析CysLT1和CysLT2受体及AQP4表达特点。以免疫组化双重荧光染色方法，确定受体分子与APQ4共表达特点；并结合病人的影像学资料，分析这些分子与脑水肿的关系；结合临床分级，分析这些分子与病情严重程度的关系。C观察CysLT受体激动剂LTD4、CysLT1受体拮抗剂Pranlukast（ONO-1078）或Mentelukast、CysLT1/CysLT2受体非选择性拮抗剂Bayu9773、CysLT1和CysLT2受体siRNA对肿瘤细胞AQP4表达的作用，确定CysLT受体对肿瘤细胞AQP4表达的调节。D观察肿瘤细胞对水通透特性，并观察CysLT受体激动剂/拮抗剂的作用，以评价CysLT受体对肿瘤细胞AQP4功能的调节。2脑缺血（1）局灶性脑缺血后CysLT受体与AQP4的关系A大鼠（或小鼠）以大脑中动脉阻塞（MCAO）后6、12、24、72 h，以水份含量测定、病理切片、免疫组化、Western blot或RT-PCR方法，观察脑水肿改变、CysLT1和CysLT2受体以及AQP4的表达的时间过程，以免疫组化双重荧光染色方法，确定受体分子与APQ4共表达特点、在神经元或胶质细胞的定位。B脑缺血后腹腔注射CysLT1受体拮抗剂Pranlukast，在最佳观察时间点，观察以上变化，评价是否由CysLT1 受体调节AQP4表达。由于缺乏CysLT2受体选择性拮抗剂，整体脑缺血实验仅观察CysLT1受体拮抗剂的作用。C观察小鼠皮层局部注射LTD4诱导AQP4表达及脑水肿变化，并观察CysLT1受体拮抗剂Pranlukast的作用。（2）大鼠原代培养星形胶质细胞OGD后CysLT受体与AQP4的关系脑内AQP4主要表达在星形胶质细胞，为此，在原代培养的星形胶质细胞，以缺氧缺糖（oxygen glucose deprivation, OGD）模拟缺血改变，观察OGD处理后两类分子的变化。AOGD 112 h后再恢复正常条件培养24 h，以免疫组化、Western blot或RT-PCR方法观察AQP4表达变化，同时观察细胞数量、形态变化。B观察CysLT受体激动剂LTD4、CysLT1受体拮抗剂Pranlukast（ONO-1078）或Mentelukast、CysLT1/CysLT2受体非选择性拮抗剂Bayu9773、CysLT1和CysLT2受体siRNA对正常培养或OGD处理后AQP4表达的作用，确定CysLT受体对星形胶质细胞AQP4表达的调节。C观察OGD对星形胶质细胞水通透特性，并观察CysLT受体激动剂/拮抗剂的作用，以评价CysLT受体对星形胶质细胞AQP4功能的调节。3细胞信号转导（1）原代培养星形胶质细胞的信号转导在原代培养星形胶质细胞，观察OGD或LTD4诱导p38 MAPK及ERK1/2通路对AQP4表达及功能的影响。A在OGD或LTD4作用后，以Western blot方法，同时观察磷酸化/非磷酸化p38 MAPK及ERK1/2