耐热芽孢杆菌HS08高温中性蛋白酶及其特性研究.doc

ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2005版) 第3页同行评议组别生物化工项目编号Y405083浙江省自然科学基金申 请 书申报类别:一般项目项目名称:耐热芽孢杆菌HS08高温中性蛋白酶及其特性研究申 请 者:蒋家新电 话托单位:浙江科技学院通信地址:杭州市小和山路1号邮政编码:310023E-mail :申报日期:2005-5-24浙江省自然科学基金委员会二OO五年制基本信息申请者信息姓 名蒋家新性别男出生日期1957年03月03日最终学位学士获学位年份1982职称教授主要研究领域食品生物化学农产品精深加工E-电 人网页 依托单位浙江科技学院证件类型身份证证件号码330106570303005申请者是否近三年调入在浙单位工作否调入时间 申请者曾主持的浙江省自然科学基金资助项目编号: 申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限:无项目基本信息项目名称耐热芽孢杆菌HS08高温中性蛋白酶及其特性研究申报类别一般项目研究属性前瞻性应用基础研究同行评议组别材料与化学科学/生物化工依托基地名称 预计研究年限2006年01月2007年12月总经费预算7.0万元申请经费7.0万元项目研究目标、内容和意义简介(限400字)高温蛋白酶是用于洗涤剂、皮革、食品等行业的重要生物活性材料。本课题拟从耐热芽孢杆菌中分离到耐高温中性蛋白酶，并对其生化特性与水解蛋白方式进行基础研究，以探明芽孢杆菌高温中性蛋白酶工业化应用的前景。关键词（不超过4个）高温中性蛋白酶;芽孢杆菌;分离纯化同行评议分组说明生化分离技术 重点资助方向特种与功能高分子材料申请书版本号：27345278 项目组主要成员编号姓名出生日期性别职称学位单位名称电话项目分工每年工作时间（月）（(月)1蒋家新1957年03月03日男教授学士浙江科技学责人42活泼1962.11.01女研究员博士浙江科技学生物43黄光荣1974.05.22男讲师硕士浙江科技学离纯化、机理64戴德慧1977.04.20男助教硕士浙江科技学化特性65夏勇1968.01.21男副主任医师学士浙江省疾控中生物26付剑云1963.05.28男主任医师硕士浙江省疾控中生物27李娟1981.11.23女助教硕士浙江科技学化特性6总人数高级中级初级博士后博士生硕士生参加单位数74120002说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写；2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成；3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005版） 第11页个人介绍：蒋家新：蒋家新，男，1957年生，教授，学士。研究方向：食品生物化学、农产品精深加工。1982年毕业于无锡轻工学院发酵工程专业，同年到浙江工商大学食品系任教，2000年调到浙江科技学院生物与化学工程学系任教。近五年来主持并完成浙江省科技计划项目1项、浙江省教育厅科研项目1项，正在主持承担浙江省科技计划项目1项、杭州市科技计划项目1项，获浙江省高校科研成果二等奖1项、三等奖1项，编著2本，发表论文20余篇。活泼：活泼，女，1962年生，研究员，博士。研究方向：食品生物技术。1999年7月毕业于无锡轻工大学，获博士学位。2001年12月到浙江科技学院生物与化学工程学系任教。近五年来，主持并完成国家教育部重点实验室研究项目1项、杭州市科技计划项目1项，正在主持承担浙江省科技计划项目1项、浙江省自然科学基金项目1项，在核心期刊上发表论文10篇。黄光荣：黄光荣，男，1974年生，讲师，硕士（博士在读）。研究方向：食品生物化学。1999年毕业于浙江工商大学食品系，获硕士学位，同年到浙江科技学院生物与化学工程学系任教，主讲生物化学、食品科学与工艺学原理等课程。近五年来，主持并完成浙江省教育厅科研项目1项、浙江省高校青年教师资助项目1项，参加并完成中澳国际合作攻关项目1项、浙江省科技计划项目2项，正在参与的科研项目有浙江省科技计划重点项目1项、浙江省科技计划一般项目1项，参加的项目获浙江省科技进步二等奖（排名第三）、浙江省高校科研成果一等奖（排名第三），在核心刊物上发表论文11篇。 申请经费预算 7.0 万元 计划开支项目名称计算根据及理由金额（万元）1信息费资料印刷费0.62专题学术活动费参加学术会议2次论文版面费等1.03仪器和设备购置费现有仪器改装与配件购置费1.04能源材料费化学试剂层析凝胶与离子交换分离材料层析柱标准品等3.75计划管理费学校计划管理费5%0.356人员费人员劳务费5%0.35注：开支范围和标准参见浙江省省级科技项目经费管理暂行办法（浙财教字200220号）。 申请者承诺：我保证： （1）申请书内容是真实的；（2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则；（3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作；（4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限；（5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 日期：项目依托单位承诺:已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。依托单位公章 日期 .耐热芽孢杆菌HS08高温中性蛋白酶及其特性研究1、项目研究意义蛋白酶是一种重要的工业化应用的酶制剂，其生产几乎占酶制剂市场的65%以上1，已大量应用于食品、洗涤、纺织、皮革、医药、化工等行业，而细菌来源的蛋白酶又是蛋白酶的重要来源之一，如在洗涤待业中细菌蛋白酶占到总微生物蛋白酶生产量的35%2。蛋白酶按其作用的pH分为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。近年来对酸性蛋白酶、碱性蛋白酶, 特别是一些高产菌株产碱性蛋白酶的研究已十分广泛2-5,也最早被工业化应用，尤其是在洗涤行业中。由于通常条件下微生物产生的蛋白酶不耐热，因而限制了其应用于高温行业，但在许多应用中均需要高温条件如高温洗涤、高温纺织加工、食品高温蒸煮、高温发酵以防杂菌污染等，因此研究高温蛋白酶很有必要。近年来发现来自于耐高温的微生物所产生的蛋白酶具有较高的耐热性与热稳定性而引起了众多研究者的关注，其中研究最多的是耐高温碱性蛋白酶。中性蛋白酶由于其作用条件温和,虽也被应用于食品、洗涤、毛纺、丝纺、制药、化妆品、皮革加工等行业,但是由于大部分中性蛋白酶的热稳定性相对较差,生产与使用条件复杂,因而限制了其应用范围，同时国内虽有部分报道6-8对高温中性蛋白酶的研究，但也仅限于对某些来源的产高温中性蛋白酶微生物的分离与酶的初步特性进行了少量研究，而对其结构特点、作用机理等没有深入，因此限制了其应用。本研究拟从嗜高温微生物（嗜热芽孢杆菌，Thermophilic Bacillus）中分离得到产耐高温中性蛋白酶菌株，并主要对其生化特性与水解机理进行系统研究，期望为耐高温中性蛋白酶的应用提供理论基础。 浙江省是经济强省,食品、纺织、皮革等行业发展很快，在这些行业蛋白酶用量很大，因此研究开发高适应性能的高温蛋白酶将在这些行业有广泛的应用前景，预计能为浙江省的经剂发展作出较大贡献。2、项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系；通过该项目的研究，期望分离纯化得到高温中性蛋白酶，研究得出该酶的最适作用条件，并对其分子结构与水解机理进行探讨，长期目标是在对该酶理论研究基础上，生产应用该酶于食品、洗涤、皮革、制药等待行业，提高这些行业的蛋白酶应用效率。项目主持人及成员曾承担并完成了浙江省科技计划项目、杭州市科技计划项目、浙江省教育厅科研项目及横向科研项目等十余项，主持或参加的科研项目曾获浙江省科技进步二等奖、浙江省高校科研成果一等和二等奖等多项奖励，在专业期刊上发表论文七十余篇。项目组由微生物、生化分离等专业方面的成员组成，主持和参加过微生物蛋白酶分离纯化与生化特性方面的研究，长期以来从事新来源的蛋白酶研究，对高温蛋白酶的分离纯化、特性及其作用机理、蛋白酶的规模生产与应用等研究是项目组成员一直努力的方向。3、项目研究内容，研究方案和进度安排； 研究内容：首先从优化培养的高温菌株中分离得到耐高温蛋白酶，然后研究高温蛋白酶的分离纯化方法，得到经过高效液相色谱、电泳等鉴定的纯高温蛋白酶，再对该蛋白酶包括分子量、最适作用条件、氨基酸组成与一级结构、不同底物米氏方程等在内的生化特性进行研究以确定该酶特性，最后探讨该酶的水解蛋白质方式与作用机理。研究方案：（1）产高温中性蛋白酶菌株的培养：利用项目组实验室已分离得到的产高温中性蛋白酶的耐热芽孢杆菌，通过斜面培养（培养基组成主要为牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂等）、发酵培养（培养基组成主要为玉米粉、豆粕粉、葡萄糖、磷酸氢二钠、碳酸钠、硫酸镁、氯化钙等）于60下1236h后得含高温中性蛋白酶的发酵液。（2）高温蛋白酶的分离纯化：将经高温培养的菌液冷冻离心去菌体，硫酸铵分级沉淀后透析脱盐得粗酶液，粗酶液经DEAE离子交换NaCl梯度洗脱得有酶活性组分，此组分再经Sepharose、Sephadex、Sephacryl S等不同型号的凝胶过滤进一步纯化，得到电泳单一色带的蛋白酶。（3）高温蛋白酶生化特性研究：将该酶在不同温度、pH等条件下反应测定酶促反应速率以确定最适温度与pH，同时试验不同类型抑制剂条件下酶促反应速率以确定该蛋白酶的类别；经SDS-PAGE电泳与凝胶过滤测定蛋白酶的分子量，经盐酸水解后高效液相色谱测定其氨基酸组成；经等电聚焦测定该酶的等电点；采用蛋白序列分析方法确定该酶的氨基末端序列并同现有的蛋白酶氨基末端序列进行同源性比较；通过不同肽或蛋白为底物的酶促反应测定该酶的米氏方程常数。（4）高温蛋白酶水解机理研究：已知序列的人工合成肽（如pro-BPN I、 Amylins等）经该蛋白酶水解0.54h后，产物用HPLC/MS联用仪测定小肽混合物的分子量分布，从分子量分布情况推断该酶水解原肽的氨基酸位点，经多个不同肽反复试验来了解该酶水解蛋白质的作用位点与作用机理。进度安排：2006.012006.10 微生物培养、酶的分离纯化工艺优化2006.112007.05 酶的生化特性研究2007.062007.11 酶的作用机理研究2007.12 材料总结、项目结题4、项目创新之处；蛋白酶因应用广泛而研究者较多，近年来因从耐高温菌中分离得到耐高温蛋白酶能应用于高温条件而在国际上倍受关注，国内也开始研究。但由于洗涤行业应用蛋白酶占酶制剂应用一大部分，故绝大部分研究都集中于耐高温的碱性蛋白酶的分离纯化与特性研究上，而对中性条件下有高活性的高温蛋白酶却研究不多，国内仅有的几篇报道也仅限于对其生产菌的培养、未纯化酶的最适条件研究上，而对于进一步的生化特性、作用机理却未涉及。而蛋白酶的生化特性、作用机理又是蛋白酶应用的基础，因此该研究在高温中性蛋白酶的分离纯化、生化特性与作用机理方面的研究具有创新性，也有很大的应用前景。5、工作基础与工作条件； 研究小组成员中有长期从事蛋白质分离纯化方面的研究人员，也有从事微生物分离培养方面的研究人员，因此项目组有能力承担该项目研究。同时，项目主要成员已开始对高温微生物产高温蛋白酶进行初步研究，筛选得到具有产高温中性蛋白酶活性的菌株，现正在进一步研究。项目主持人及成员曾承担并完成了浙江省科技计划项目、杭州市科技计划项目、浙江省教育厅科研项目及横向科研项目十余项，主持或参加的项目曾获浙江省科技进步二等奖、浙江省高校科研成果一等和二等奖等多项奖励，因此项目组完全有能力承担并完成该项目的研究任务。项目组所在的实验室拥有AKATA Purifier100蛋白层析仪、Waters高效液相色谱仪、氨基酸分析仪、冷冻离心机、冷冻干燥机、离心浓缩仪、无菌操作室、喷雾干燥仪、凝胶成像仪等仪器设备，基本能满足该项目研究所需。6、预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后发展的思路；通过本项目研究预期能分离纯化得到一种耐高温中性蛋白酶并获知该酶的基本生化特性与最适作用条件及其水解蛋白质的作用方式，所有研究结果将以论文和最后的项目总结报告形式表达。在本项目研究结束后，计划通过两种方式继续发展与开发本项目研究。其一是继续在理论上研究该耐高温中性蛋白酶的酶活性中心氨基酸组成、结构域与高级结构，以更完整了解该酶；其二是对该耐高温中性蛋白酶在食品、洗涤、皮革行业中的应用进行研究开发，争取开发多种适用于不同行业应用的产品。7、参考文献；1 Rao M B , Tankasale A M , Ghatge M S , et al . Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases，Microbiol Mol.Biol. Rev , 1998 , 62 : 597 - 634.2 Ferrero M A, Castro G R, Abate C M, et al. Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR29: isolation, production and characterization. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996, 45:327-332.3 李玲 刘祖同，高温碱性蛋白酶（TAP）菌株的分离及筛选（I），