家畜传染病学教学实习.doc

实习一 猪瘟的诊断目的了解和掌握猪瘟的现场诊断和实验室诊断方法内容及方法猪瘟的诊断程序人工感染或自然病例 观察症状 荧光抗体诊断观察病理变化扁桃体、淋巴结、脾 采集病料 脾脏兔体交互免疫试验剖检 称重、匀浆制备1：10的组织悬液加双抗4下作用6h肌肉注射实验家兔3只，5mL/只对照组家兔3只，注射生理盐水5mL/只观察测温7天耳静脉注射100倍稀释的猪瘟兔化弱毒1mL/只测温4天，每天4次绘制两组兔的体温曲线判定结果冰冻切片冷丙酮固定4C10min猪瘟荧光抗体染色37C作用30minPH 8.0PBS液涮洗5min0.1伊文斯兰复染3s5sPH8.0 PBS液涮洗2min碳酸盐缓冲液封裱荧光显微镜下观察 判定结果一 猪瘟病例的人工感染（一） 种毒：为购自中国兽药监察所的猪瘟中国石门系强毒，采集高热期抗凝血保存，或采集病死猪的脾脏、淋巴结研磨处理，按稀释1：10倍稀释，加双抗处理后使用。（二） 感染用猪：应选用断奶后未经猪瘟疫苗免疫的猪。（三） 感染方法：用血毒或脾、淋毒，肌肉注射、滴鼻、口服，每头共计4mL。（四） 感染时间：最好于试验前67天（1周）进行。一般23天潜伏期，7天后就可死亡。二 观察临床症状，剖检观察病理变化，采集病料（一）临床症状最急性型：突然发病，症状急剧，主要表现高温稽留，皮肤和黏膜有紫绀和出血，与一般败血症无异，一至数天死亡。急性型：1突然发病，食欲显著减少或完全停食，喂食时，不表现饥饿感，徐徐走近食槽，缓慢嚼食，但食数口后，即退出卧下，有的病猪连续多天完全停食，有时呕吐。2精神高度沉郁，伏卧嗜眠，肌肉震颤，常挤卧于一隅或钻入草堆，呈怕冷状，触动时或发低沉的叫鸣而不动，或徐徐站起，走几步后，又卧地，或表现敏感，发出尖锐的叫声，站立或行走时，背腰弓起，四肢软弱无力，发抖，行动缓慢，摇摆不稳。3体温升高至41以上，高的可达42以上，稽留不退，死前降至常温以下，在体温升高时，白细胞减少，约13000以下，甚至仅有3000，一般以发病后47天最低，血小板也减少。4两眼无神，开张不全，常有多量粘液浓性分泌物，清晨可见两眼粘封，不能开张，结膜潮红发炎，后期结膜苍白，常有出血斑点，口腔黏膜苍白或发绀，唇内面、齿龈、口角、会厌、喉头和阴道等处的黏膜可能有出血斑点。5皮肤通常充血，末期多呈现贫血状态，有些部位如鼻端、嘴唇、耳、下颌、四肢、外阴等处，可能出现紫绀区或出血变化，公猪包皮内积有尿液，挤压时流出浑浊发臭的尿液。6初便秘后腹泻，初期粪便干结，呈小球状，后期腹泻状粪便，病程长的便秘和腹泻交替出现。7病程为13周，后期常并发细菌感染，以肺炎和坏死性肠炎最为多见。8有的病猪主要表现神经症状，嗜眠、磨牙、全身痉挛、体躯强直、不易起立、运动障碍。亚急性型：似急性型，但较缓和，有时好转，病程约34周。慢性型：消瘦，贫血，衰弱，伏卧，时有轻热，食欲不振。便秘和腹泻交替，有的皮肤有紫斑或坏死痂，病程在一月以上。（二）病理变化急性型：1淋巴结的变化比较特殊，以腹腔淋巴结最为明显，表现肿大充血，呈暗红色，切面多汁，呈弥漫性出血，边缘部分尤为显著，杂有贫血变化，因而呈大理石状。2肾色较淡，出血斑点分布在皮质，髓质少见，肾盂和肾乳头也常见到。3脾不肿大，边缘呈出血性梗死，有突起小块，色紫黑。有时为边缘性出血带。4胆囊黏膜可能有出血斑点或坏死。5肺充血出血、支气管肺炎。6、扁桃体常有炎症，初期轻，后期发展成为两侧性坏死性炎症。7、喉头和膀胱黏膜也常见出血点。慢性型：主要为坏死性肠炎，一般见于回肠末端，盲肠和结肠的黏膜上，炎症从淋巴滤泡开始，向外发展，因而形成同心轮层状的钮扣状溃疡，突出于黏膜面，色褐或黑，中央低陷，有的有剥脱现象。（三）病料采集：脾、淋巴结、扁桃体、肝、肾。三、病料研磨与处理脾 称重 剪碎 研磨 稀释（W/V）1：10 反复冻融3次 双抗处理（1000u/mL）4作用6h以上 离心取上清液-20保存。四、病料冰冻切片1连接好半导体致冷器和切片机后，检查水管是否接好，先开冷却水，再开致冷器，预热minmin。将致冷键置于刀台共冷上，调节电流到1520m处，刀台即开始逐渐冷却。调节切片厚度至umum。待台上结霜后将修好的组织块贴于台上，待组织块冻实后，转动手动摇把，先修正组织块，再切片，迅速将切下的组织薄片贴于玻璃片上。自然干燥或风干后，用冷丙酮固定，min。6取出晾干或风干，贴标签，用纸包好，外用厚而不漏水的塑料袋密封，置保存。五病料上清液接种家兔（兔体交互免疫试验）观察测温3天，2-3次/天一组6只体温应正常健康家兔12只二组6只 接种病料上清液肌注5mL/只试验组3只对照组3只一组 测温57天试验组3只对照组3只二组8h一次，3次/日接种生理盐水5mL/只注意：测温要认真，仔细。六猪瘟荧光抗体染色、观察1在固定好的冰冻切片上滴加数滴猪瘟荧光抗体，置37水浴箱中作用30min。2用pH7.2的PBS漂洗3次,每次5 min10min 。3干后滴加甘油缓冲液，加盖玻片封闭，用荧光显微镜检查。4如细胞胞浆内有弥漫性，絮状或点状的亮黄绿色荧光，为猪瘟；如仅见暗绿或灰蓝色，则不是猪瘟。5试验设已知含猪瘟病毒材料压印片和不含猪瘟病毒材料压印片，作为阳性和阴性对照。6标本染色和漂洗后，浸泡于5%吐温80PBS（pH7.2，0.01mol）中h以上，可除去非特异染色，晾干后用0.1伊文思蓝复染1530min，检查判定同上。七、猪瘟兔化弱毒接种试验家兔（一）猪瘟兔化弱毒1猪瘟兔化弱毒疫苗：生药厂生产，在有效期范围内2家兔猪瘟兔化弱毒脾脏：采自具有定型热或轻型热反应的家兔，称重 研磨 反复冻融3次 离心取上清液 双抗处理 备用。（二）接种方法试验组与对照组家兔耳静脉注射1mL/只，注意缓慢注射。（三）接种后的管理与观察1观察注射后家兔的反应。2测温：每6h测温一次，4次/日，连续测温3天，当出现典型的定型热或轻型热反应后，于体温下降至常温前扑杀，采毒。八、猪瘟兔体交互免疫试验的结果判定（一）几个概念1常温：家兔接种前数次体温的平均值。2潜伏期：由接种时算起，到体温上升超过常温的间隔时间。3稽留期：从体温超过常温0.5以上算起，到体温下降或接近常温时的间隔时期。（二）体温反应的类型热型潜伏期温差温次稽留期定型热24h48h13次18h36h轻型热24h72h0.52次12h36h可疑热反应24或72，体温曲线起伏不定12h或36h无热反应体温正常（三）判定标准1试验成立的条件：当对照组家兔注射猪瘟兔化弱毒后发生定型热或轻型热反应，则说明试验成立，即所注射的就是猪瘟兔化弱毒。2. 根据试验组家兔发生的热反应，进行判定。接种病料后接种兔化毒后结果+（猪瘟）+（病料内有兔化弱毒）+（非猪瘟，不含猪瘟病毒）+（非猪瘟，含非猪瘟病毒的致热物质）实习二 鸡新城疫的诊断目的1 掌握鸡新城疫的临诊诊断要点。2 系统地了解和掌握鸡新城疫的实验室诊断和免疫监测技术。内容与方法鸡新城疫的诊断程序病毒增殖实验鸡选择人工感染鸡临床症状观察剖检、病理变化观察员病料采集脾、脑、肝肝、脾、法氏囊、盲扁、肾4保存冰冻切片称重、匀浆、制成1：5悬液加双抗4处理6h冷丙酮固定410min接种911日龄鸡胚尿囊腔新城疫荧光抗体染色3738孵育72h37作用30min做血凝抑制试验PBS液涮洗5min收集鸡胚尿囊液0.1%伊文思兰复染5s做血凝试验检测尿囊液的血凝性PBS洗2min碳酸盐缓冲甘油封裱判定结果 荧光显微镜观察 一、新城疫病例的人工感染1 试验鸡的选择：最好是SPF鸡，如无条件用SPF鸡时，一定要选ND非免疫鸡。2 NDV强毒的准备：用NDV F48E9株经鸡胚尿囊腔增殖，最好通过易感鸡复壮，达到毒力强，毒量足。3 感染：肌肉注射，点眼，滴鼻，1mL/羽。二、临床症状与病理变化观察及病料采集1主要临床症状：体温升高，达4344，食欲减退或废绝，有渴感。精神萎顿，垂头缩颈或翅膀下垂，眼半开或全闭，状似昏睡，鸡冠及肉髯发紫。呼吸困难，伸头，张口呼吸，有“咯咯”的喘鸣音。口角流出多量粘液，常混有饲料颗粒，为排出此粘液病鸡常作摇头或吞咽动作。嗉囊胀软，充满液体，倒提时有大量酸臭的液体从口角流出。排稀薄的粪便，呈黄绿色或黄白色，有时带血，后期排出蛋清样物。有的有神经症状。2病理变化嗉囊内充满酸臭的稀薄液体和气体。腺胃粘膜水肿，其乳头和乳头间有鲜明的出血点，或有溃疡和坏死。肌胃角质层下常见有出血点。肠粘膜有大小不等的出血点，尤其是十二指肠和直肠，也有纤维素性坏死性病变。盲扁常见肿大，出血和坏死。气管出血，肺瘀血或水肿。心冠脂肪有细小如针尖大的出血点。肝、脾、肾无特殊病变。脑膜充血或出血。3.病料采集：病毒分离材料：肝、脾、肾、脑等，低温冻结保存。荧光抗体检验材料：肝、脾、肾、法氏囊，盲扁，4冷藏保存，不能冻结。三、病料的研磨与处理：脾、脑 称重 研磨1：5稀释 反复冻融3次以上离心取上清液 双抗处理 4作用6h以上 20冻存四、病料的冰冻切片1连接好半导体致冷器和切片机后，检查水管是否接好，先开冷却水，再开致冷器，预热minmin。将致冷键置于刀台共冷上，调节电流到1520m处，刀台即开始逐渐冷却。调节切片厚度至umum。待台上结霜后将修好的组织块贴于台上，待组织块冻实后，转动手动摇把，先修正组织块，再切片，迅速将切下的组织薄片贴于玻璃片上。自然干燥或风干后，用冷丙酮固定，min。6取出晾干或风干，贴标签，用纸包好，外用厚而不漏水的塑料袋密封，置保存。五、鸡胚接种 病毒分离除用鸡胚外，还可用实验动物（一） 目的：进行病毒的分离与培养 组织培养，细胞培养（二） 实验条件的准备：1鸡胚：选卵：受精的鸡蛋，最好是白壳蛋，SPF蛋最佳，必须新鲜。保存在520不能超过10天，超过一个月孵化率接近于0。孵育：37.538.5的温箱或孵化箱内，相对湿度5040，另外必须保证空气流通。检卵：孵化后45天检卵，记录受精率，检出未受精卵，以后应每天观察一次，观察发病情况。未受精卵只见模糊的卵黄阴影，不见血管和鸡胚痕迹，活胚具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大的鸡胚还可见胚动。死胚血管昏暗模糊，没有胚动。画气室和胚位置2. 分离材料的准备：取出经处理过的病料冷冻液，常温解冻后，恢复至室温。3其它器械：5#、6#、7#针头，1mL或2mL注射器、镊子、石蜡等（三） 操作程序1消毒：先用碘酒棉在气室部位涂擦，然后再用酒精棉脱碘。2打孔：在气室顶端稍偏向于胚侧，用7#针头打一小孔。3接种：用1mL 注射器吸取病料液，接种鸡胚尿囊腔，0.2mL胚。4封孔：石蜡熔化后涂在打孔部位。（四） 接种后的管理1 接种后放孵化箱继续孵育。2 24h后照蛋，检出死胚弃去。3 24h后，每隔6h照蛋一次，检出死胚置4条件下冷藏。4 注意补充温箱内的水份。六、鸡胚剖检与“病毒”收获（一）器械准备剪刀，镊子，盐水滴头，橡皮乳头每人2套青霉素瓶每人4个，瓶塞每人4个瓶签每人4张或用医用胶布代替。（二）收毒程序1将死亡鸡胚由4冰箱取出，于电风扇下吹15min使之与室温平衡。2鸡胚直立于蛋架上，气室朝上，用碘酒棉擦试消毒，然后用酒精棉脱色（碘）。3用无菌镊子打开气室，去掉蛋壳，使整个气室充分暴露。4用无菌镊轻轻夹起壳膜，并将壳膜撕掉。5镊住绒毛尿囊膜夹起，用剪刀剪一大口，暴露尿囊腔。6用镊子插入尿囊腔，压住鸡胚，然后用一盐水滴头或吸管插入镊子口中间，轻轻吸取尿囊液，放入灭菌青霉素瓶中，加盖。每胚收集两瓶，量多者用于保存，量少者用于检测。7贴上标签，写上姓名，毒种及毒名（病料来源），鸡胚死亡时间（接毒后的时间），测毒价（血凝价）8置低温下保存。9观察鸡胚病变。（三）注意事项：1严格的无菌操作，如果属于具有高度感染力及可感染人的病毒，更应采取严密的保护措施，以免扩散病毒或发生实验室感染事故。2打开气室后，注意不要使卵壳碎屑落入胚内。3吸收尿囊液时要小心，不要碰破卵黄囊。4如发现污染或胚内混浊，则不要收集，应弃去。5标签一定要写清楚。七、血凝与血凝抑制试验的准备（一） 条件准备 1抗凝剂：3.8的柠檬酸钠。注射器与针头：煮沸消毒时，注意离子浓度与p的平衡。洗涤液： 生理盐水； p7.2，0.01的PBS液（二）采血：选取健康鸡只，翅静脉或心脏采集抗凝血。只鸡血混合，保存，最好选用非免疫鸡。（三）红细胞的离心洗涤1500r/min离心10min，洗涤34次，留红细胞泥加洗涤液为血量的35倍。(四) 1%红细胞的配制吸取红细胞泥，加入PBS或生理盐水配成1%浓度，最好于4静置过夜，次日摇匀，这样的红细胞的凝集图像更清晰。八、新城疫切片荧光抗体染色，观察1在固定好的冰冻切片上滴加数滴鸡新城疫荧光抗体，置37水浴箱中作用30min。2用pH7.2的PBS漂洗3次，每次5 min10min 。3干后滴加甘油缓冲液，加盖玻片封闭，用荧光显微镜检查。4如细胞胞浆内有弥漫性，絮状或点状的亮黄绿色荧光，为鸡新城疫；如仅见暗绿或灰蓝色，则不是鸡新城疫。5试验设已知含鸡新城疫病毒材料压印片和不含鸡新城疫病毒材料压印片，作为阳性和阴性的对照。6标本染色和漂洗后，浸泡于5%吐温80PBS（pH7.2，0.01mol）中h以上，可除去非特异染色，晾干后用0.1伊文思蓝复染1530min，检查判定同上。九、新城疫病毒的鉴定（一） 血凝试验、 条件（1） 96孔V型聚乙烯塑料血凝反应板（2） 加样器（3） 稀释液：生理盐水； 0.01 p7.2 PBS液（4） 鸡红细胞悬液2操作于V型血凝板的每孔中滴加PBS（pH7.2）0.05mL，共滴4排；吸1：5稀释抗原滴加于第一列孔，每孔0.05mL，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸0.05mL弃之，最后一列不加抗原作为对照；于每孔中加入1%红细胞悬液0.05mL，置微型混合器上振荡1min，或以手持血凝板圆圈混匀；置室温下（1820）3040min，根据血凝图像判定结果。3判定：以使红细胞发生100凝集的尿囊液的最大稀释度为其血凝价，当血凝价（）大于或等于23时，判为具有血凝性。（二） 血凝抑制试验1条件准备（1）96孔型反应板，加样器，稀释液（2）抗NDV标准阳性血清（3）被检抗原及其单位抗原（4）己知NDV标准抗原（5）抗NDV阴性血清（6）鸡红细胞悬液2操作试验在96孔V型血凝板上进行。先取PBS（pH7.2）0.05mL加入第1孔，再取4个HA单位的抗原加入312孔，每孔0,05mL，再取8个HA单位的抗原0.05mL加入第2孔。用稀释器吸被检血清0.05mL放入第1孔（血清对照）下，挤压混匀后吸0.05mL放入第2孔。依次倍比稀释至第12孔，吸0.05弃去；置室温（1820）下作用20分钟。用稀释器滴加0.05mL红细胞悬液于各孔中，振荡混合后在室温下静置3040min，判定结果。每次测定应设已知滴度的标准阳性血清对照。微量法HI试验操作术式如表1。表1微量法HI试验操作术式 孔 号 滴度（lg2）材 料123456789101112对照234567891011120.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.5%鸡红血细胞悬液（mL）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05作用时间及温度1820 静置3040min判定举例+#PBS（mL）8HA 单位抗原（mL）4HA 单位抗原（mL）被检血清（mL）4 结果判定以100抑制红细胞凝集的血清最大稀释度作为血清的效价，当其大于或等于24时，即可判定该被检抗原（病毒）为ND抗原（病毒）。实习三 禽霍乱的诊断目的掌握巴氏杆菌病的临诊诊断要点和微生物学诊断步骤和方法诊断程序人工感染或自然病例白鼠 亚观察临诊症状白鼠 亚剖检病鸡，观察病理变化白鼠 亚采集病料（胸水、腹水、心包液、心血、肝、脾、淋巴结）白鼠 亚病料涂片或抹片，革兰氏染色镜检（看是否有两极着色的小杆菌）白鼠 亚病料接种血平板，37培养24h后涂片，进行革兰氏染色镜检（G-，球杆状或双球状的小杆菌，两极着色现象少见）观察菌落形态（淡灰色、圆形、边缘整齐较平坦闪光的露珠样小菌落，不溶血。）白鼠 亚挑纯培养白鼠 亚糖发酵试验：葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇、鼠李糖、乳糖、棉子糖、麦芽糖M R试验：阴性V P试验：阴性吲哚试验：阳性麦康凯平板上生长情况:不生长生化鉴定白鼠 亚白鼠 亚动物试验（取菌液皮下或腹腔注射小白鼠，0.2ml/只。小白鼠多在18h24h左右死亡，采取其心血或其它脏器涂片，美兰染色镜检，可以看到两极着色的小杆菌。）白鼠 亚总结分析，得出结论内容及方法一、人工复制病例1菌种：C48-1菌株，在血平板上传代 皮下注射小白鼠（使毒力增强） 小白鼠 死后，从其体内分离到细菌。2感染动物：健康大公鸡3感染方式：2ml/只肌注，或1m1/只肌注/1m1/只静注。二、禽霍乱临诊症状观察潜伏期：自然感染为29天；人工感染为24h48h。由于疾病的流行时期，家禽的抵抗力和病菌的致病力强弱不同，所表现的症状亦有差异，一般分为最急性、急性和慢性。1最急性：多见于流行初期，多发于产蛋率高的鸡。常无前驱症状而死亡，有时病鸡不安，精神沉郁，倒地挣扎，拍翅抽搐，数分钟到几小时死亡。2急性：最常见。常见的症状有： 体温升高43-44，全身症状明显。腹泻，排黄色稀粪。呼吸困难，口鼻分泌物增加。产蛋鸡停止产蛋。）病程短的约为半天，长的13天，病死率高。3慢性：多由急性不死转化而来，多见于流行后期。以慢性肺炎，慢性呼吸道炎和慢性胃肠炎症状较为多见。有些病鸡一侧或两侧的肉髯显著肿大 出现干酪样坏死 干结、坏死脱落。有的病鸡关节肿大、疼痛，脚趾麻痹、跛行。三、剖检病鸡、观察病变剖检病变可能有：病鸡的腹膜、皮下组织及腹部脂肪有小点出血。心包增厚，心包内积有多量透明淡黄色液体，有的含有纤维素状液体，心外膜、心冠脂肪出血尤为明显。肝的病变有特征性：肝稍肿、质变脆呈棕色或棕黄色，肝表面散有许多灰白色，针尖大的坏死点。肌胃出血显著，尤以十二指肠卡他性和出血性肠炎为明显，肠内容物内含有血液。脾一般不见明显变化，或稍肿大，质软。肺有充血和出血点。四、细菌分离培养1. 采集病料 尽可能采取新鲜病料：渗出液（胸水、腹水、心包液）、心血、肝、脾、淋巴结。2. 涂片镜检取采集的病料制成涂片，用碱性美兰染色或瑞特氏染色，如发现两极着色的小杆状菌时，即可作出初步诊断。3. 分离培养用血平板进行划线分离， 37培养24h后观察菌落形态，可见到淡灰色、圆形、边缘整齐较平坦闪光的露珠样小菌落，不溶血。取这些菌落制成涂片，进行革兰氏染色检查，可见到G-，球杆状或双球状的小杆菌，两极着色现象少见。取血平板上的典型菌落接种于血斜面进行纯培养，37培养24h。4生化鉴定取血斜面上的菌苔涂片，革兰氏染色镜检，检查纯度，如果细菌大小形态一致，而且与前述典型菌落涂片染色结果一致，则可接种生化培养基和鉴别培养基。37培养24h48h后观察结果。A糖培养基：葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇、鼠李糖、乳糖、棉子糖、麦芽糖、等，每人1管。B葡