分子生物学-基因分离.pdf

第二节 目的基因的来源和分离 目的基因片段的分离 分离植物生长发育 逆境反应等相关基因或片段的策略 PCR扩增获得基因片段 根据已知基因或同源基因序列设计引物进行扩增 根据已知基因的EST序列设计引物进行扩增 分离差别表达cDNA 差别显示RT PCR 差减杂交 基因表达系列分析 基因芯片分析 植物突变体中相应基因片段 PCR扩增获得基因片段 已知基因序列 基因专化引物 已知同源基因 简并引物 已知基因片段序列 RACE方法 5 RACE5 RACE mRNA差别显示技术 DDRT PCR Differential Display of reverse transcriptional PCR 分离鉴定差别表达的基因片段的有效方法 不足 假阳性比例很高 差减杂交 subtractive hybridization 原理分离差别表达基因 原理 测试样品中包含需要分离的差别表达cDNA 而对照 样品中则不包含这些序列 来自测试和对照样品的cDNA在 对照样品过量的情况下进行杂交 只有来自测试和对照样品 的共同序列能进行杂交形成双链杂合体 去除双链杂合体及 未杂交的对照样品序列后 获得来自测试样品的目的序列 优点 具富集作用 有利于克隆低丰度基因 假阳性比率较低 效率比较高 可以构建文库 常用方法 普通差减杂交法 subtractive hybridization 抑制性差减杂交法 suppression subtractive hybridization 快速差减杂交法 rapid subtractive hybridization 差减杂交法抑制性差减杂交法 基因表达系列分析 serial analysis of gene expression SAGE 分析基因表达的有效方法 从基因表达分析中获得差别 表达基因的信息 原理 从每一个转录本的特定位置获得一个10 17bp标签 这种 标签含有足够的信息来鉴定该转录本 10 17bp标签相互连接形成很长系列分子 克隆并测序 定量分析特定标签出现次数 反应相应基因的表达水平 优点 Generate cDNA primed with biotin oligo dT Restriction digest double stranded cDNA with a 4 base cutter anchoring enzyme NlaIII bind to streptavidin coated beads AAAA TTTT AAAA TTTT GTAC AAAA TTTT GTAC Divide pool in half fill in 5 overhang to blunt ends GGATGCATGOOOOOOOOOO CCTACGTACOOOOOOOOOO GGATGCATGXXXXXXXXXX CCTACGTACXXXXXXXXXX 12 Blunt end ligate pool 1 to pool 2 and PCR amplify with primers specific to linker sequences 1 and 2 GGATGCATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOCATGCATCC CCTACGTACXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOGTACGTAGG 1 2 Tag 1Tag 2 Ditag Restriction digest with same anchoring enzyme above gel isolate di tags concatenate ditags and ligate to cloning sequencing vector CATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOCATG GTACXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOGTACXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOGTAC DitagDitag Tag 1Tag 2 Tag 3Tag 4 基因芯片分析获得候选基因 基本原理 将一系列的核酸片段固定在芯片载体上作为固相 靶片段 target 待测的核酸片段人工标记上 不同荧光或同位素等作为探针 一定条件下两者 杂交 根据杂交后不同的信号即可获得靶片段的 信息 进行计算机分析 获得基因表达的总体水 平 从而分离与特定生物学过程相关的基因 特点 高度集约化 大通量平行分析 高灵敏度 样品需要量小 处理细胞总mRNA对照细胞总mRNA Cy5标记Cy3标记 杂交 EST 全长cDNA 寡聚核苷酸 结果观察 信息分析 获得基因片段后 如何分离获得相应基因的全长cDNA序列 因为基因全长cDNA时研究基因功能所必须的 基因编码蛋白的生化功能鉴定 通过转基因技术研究基因生物学功能 目的基因及其全长cDNA的分离 基因文库筛选 制备与筛选基因组文库 制备与筛选cDNA文库 PCR相关方法 RT PCR分离全长的cDNA 5 RACE和3 RACE扩增全长的cDNA 酵母杂交技术分离获得全长cDNA 双杂交 分离与已知蛋白互作的蛋白的基因 单杂交 分离与已知顺式作用元件互作的转录因子基因 基因文库的构建和基因克隆技术 基因文库 cDNA文库 来源于细胞表达出的 RNA 反映基因组表 达的基因序列信息 用于研究特定细胞中 基因的表达状态和表 达基因的功能等 基因组文库 来源于基因组DNA 反映 基因组的全部信息 用于基 因组物理图谱的构建 基因 组序列分析 基因在染色体 上的定位 基因组中基因的 结构和组织形式等 基因组文库 基因组文库构建的策略 基因组DNA的分离 基因组DNA酶切与片段分离 载体与基因组片段的连接 连接产物在受体细胞的转化与增殖 重组体的筛选 鉴定和保存 1 基因组DNA的制备 CTAB法 A 基因组DNA的分离酚 氯仿 异戊醇抽提法 商品化试剂盒 B 基因组DNA片段的制备 酶解 酶解片段的分离 2 载体选择和处理 受体细胞结构插入片段大小举例 质粒 噬菌体 粘粒载体 BAC载体 YAC载体 酵母细胞 E coli E coli E coli E coli 线性染色体 环状 环状 环状 环状 100 2000 kb 9 24 kb 8 kb 100 300 kb 35 45 kbpWE15 16 pUC18 19 EMBL系列 pBeloBAC11 构建基因组文库的常用载体 载体DNA的酶切与去磷酸化反应 单酶切 粘性末端 载体5 去磷酸化双向插入 平末端 双酶切 不需要去磷酸化粘性末端单向插入 载体5 去磷酸化平末端双向插入 3 基因组DNA片段和质粒DNA的连接与转化 阴性对照1 线状的去磷酸化的载体DNA自连接后 阳性对照2 完整的质粒DNA转化 1 10ng 实验组 质粒DNA 基因组DNA 感受态细胞 连接片段量 ng 载体量 ng 连接片段长度 kb 载体长度 3 连接效率的优化 插入片段与载体 的摩尔比 1 1 3 1 5 1 4 感受态细胞的制备 化学法转化 氯化钙制备感受态细胞 电转化法 制备新鲜的和冷冻的感受态细胞 受电场强度 电脉冲长度 DNA浓度的影响 感受态细胞转化率计算 平板上的菌落数 质粒的重量 g 制备感受态细胞的所有器皿和过程需在无菌 4 C进行 快速冷冻后 70 C保存 5 重组克隆的筛选与鉴定 互补 诱导物IPTG和生色底物蓝白菌落形成 插入失活 抗生素选择标记 小规模质粒提取 酶切鉴定 杂交 载体 插入片段 cDNA文库的构建 cDNA 以mRNA为模板 在反转录酶作用下形成的互补DNA cDNA文库 一群包含细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合 基因组文库与cDNA文库 基因组文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因 cDNA文库中获得的是已经剪接 去除内含子的cDNA cDNA文库的用途 分离获得目的基因的全长cDNA 大规模EST测序 酵母双杂交技术分离蛋白 蛋白互作基因 酵母单杂交分离转录因子基因 全部mRNA 体外反转录成cDNA 与载体连接 转化受体菌 繁殖扩增 cDNA文库 总RNA 总RNA抽提及mRNA纯化是最关键 的一步 必须保证mRNA的完整性 保证cDNA第一链合成的长度与产量 连接效率直接影响着cDNA文库质量 建议 使用商业化cDNA文库构建试剂盒 或直接送商业公司构建文库 总RNA提取与mRNA纯化 模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率 总RNA制备方法 可用商业化的总RNA提取试剂盒 mRNA纯化 因为mRNA 3 端含有 polyA尾巴 利用 oligo dT 纤维素柱进行纯化 操作RNA时的注意事项 RNA极易被RNase降解 且RNase广泛存在又极为稳定 需戴手套操作并经常更换 玻璃器皿需置于干燥烘箱中180 烘烤4小时以上 塑料容器用0 1 的焦碳酸二乙酯 DEPC 水溶液处理 试剂用0 1 DEPC处理过夜后高压灭 不能用DEPC处理的试剂 如Tris 则用DEPC水配置 双链cDNA合成 第一链合成原理 用依赖于RNA的DNA聚合酶 反转录酶 合成cDNA第一链 商品化反转录酶有 禽类成髓细胞病毒 AMV 逆转录酶 鼠白血病病毒 MLV 反转录酶 需有引物来起始DNA合成 cDNA合成最常用的引物是与 真核细胞mRNA 3 端polyA结合的12 18 bp长的oligo dT 第二链合成原理 自身引导合成双链cDNA 很少使用 置换法合成双链cDNA 广泛使用 引导法合成双链cDNA 广泛使用 随机引物合成双链cDNA 广泛使用 自身引导合成双链cDNA mRNA 5 帽状结构 PolyA尾巴 3 polyT 反转录酶 3 5 3 DNA聚合酶 5 PolyA尾巴 polyT polyT 5 3 PolyA尾巴 S1 核酸酶 polyT 5 3 PolyA尾巴 加接头并连接到载体 筛选重组体并在体外进行表达 置换法合成双链cDNA mRNA 5 帽状结构 PolyA尾巴 反转录酶 5 帽状结构 3 RNase H 5 5 5 5 3 5 3 polyT 5 磷酸钠 PolyA尾巴 polyT polyT 3 PolyA尾巴 5 DNA聚合酶 polyT 5 3 PolyA尾巴 连接到载体 筛选重组体并在体外进行表达 引导法合成双链cDNA 5 帽状结构 PolyA尾巴 3 polyT 限制性内切酶 反转录酶反转录酶 5 3 3 末端转移法在3 加上polyG mRNA 5 帽状结构 PolyA尾巴 3 polyT 限制性内切酶 5 碱水解法碱解RNA 3 GGGGG 5 限制性内切酶 CCCCDNA聚合酶 3 GGGGG 5 限制性内切酶 CCCC 5 3 5 polyT 限制性内切酶 polyA 限制性内切酶 polyT 限制性内切酶 酶切并克隆到表达载体 筛选重组体并在体外进行表达 cDNA的分子克隆 双链cDNA的处理 连接上接头 Linker 限制性内切酶识别位点片段 末端转移酶接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴 PCR扩增 载体 克隆 连接到质粒或噬菌体 转化到宿主菌中进行扩增 基因文库的筛选 基因组文库筛选 同源探针 已知基因片段 差别表达的基因片段 cDNA文库筛选 同源探针 已知基因片段 差别表达的基因片段 特异性抗体筛选 已知目的蛋白 要用表达cDNA文库 酵母双杂交技术 从表达cDNA文库中筛选获得编码与 特定蛋白互作的蛋白的基因 酵母单杂交技术 从表达cDNA文库中筛选获得编码与 顺式调控元件互作的蛋白的基因 用PCR相关方法分离获得基因全长cDNA RT PCR分离全长cDNA 前提 已知目的基因全长cDNA序列 5 3 mRNA 反转录 5 UTR正向引物 3 5 cDNA 5 UTR 3 UTR 5 3 PCR扩增 基因产物的克隆 5 UTR 3 UTR 5 3 5 反向引物 PCR扩增 5 UTR正向引物 5 3 5 3 快速扩增cDNA末端 Rapid amplification of cDNA ends RACE 前提 已知目的基因的某个片段序列 但5 和3 序列未知 5 RACE 扩增未知5 端序列 决定基因转录的起始位点 cDNA 特异引物1 3 mRNA 5 已知cDNA片段 反转录 3 dC n5 5 dG支撑引物 PCR扩增 5 dG支撑引物 特异引物2 PCR扩增 5 末端片段 基因产物的克隆和序列测定 3 RACE 扩增未知3