木聚糖酶活力的测定方法.doc

木聚糖酶活力的测定方法1.木聚糖酶活力单位定义在37、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。2.测定原理木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。3.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.3 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氫氧化鈉20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.4 乙酸乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOHCH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。3.5木糖溶液，c（C5H10O5）为10.0mg/ml：称取无水木糖1.000g，加缓冲液（3.4）溶解，定容至100ml。3.6 木聚糖溶液：1.0%（w/v）称取木聚糖（Sigma X0672）1.00g，加入氢氧化钠0.34 g，磁力搅拌再加入60ml水，磁力搅拌至木聚糖完全溶解。再加入冰乙酸0.5 ml，再用乙酸溶液（3.1）调节pH值至5.5。继续搅拌30min，用缓冲液（3.4）定容至100ml。木聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4避光保存，有效期为7天。3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml，搅拌5s，水浴至45。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（3.4），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。4.仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。4.2 分样筛：孔径为0.25mm（60目）。4.3 分析天平：感量0.001g。4.4 pH计：精确至0.01。4.5 磁力搅拌器：附加热功能。4.6 电磁振荡器。4.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45 mm。4.8 离心机：2000g以上。4.9 恒温水浴锅：温度控制范围在3060之间，精度为0.1。4.10 秒表：每小时误差不超过5s。4.11 分光光度计：能检测350800nm的吸光度范围。5.标准曲线的绘制吸取缓冲液（3.4）4.0ml，加入DNS试剂（3.7）5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。分别吸取木糖溶液（3.5）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml，分别用缓冲液（3.4）定容至100ml，配制成浓度为0.100.70mg/ml木糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00ml（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试剂（5.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以木糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。6.试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm）。称取试样两份，精确至0.001g。加入50ml乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.4）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（3.4）定容至100ml，在4条件下避光保存24h。摇匀，取出30-50ml，2000g离心3min。吸取5.00ml上清液，再用缓冲溶液（3.4）做二次稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.040.08U/ml之间）。液体试样可以直接用乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.4）进行稀释、定容（稀释后的酶液中木聚糖酶活力最好能控制在0.040.08 u/ml之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5，需要用乙酸溶液（3.1）或乙酸钠溶液（3.2）调节至5.5，然后再用缓冲溶液（3.4）做适当定容。7 测定步骤吸取10.0ml木聚糖溶液（3.6），37平衡10min。吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37平衡10min。吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37平衡），加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试剂（3.7），电磁振荡3s。然后加入2.0ml木聚糖溶液（3.6），37保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样（参见5）为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml木聚糖（3.6）（已经过37平衡），电磁振荡3s，37精确保温30min。加入5.0mlDNS试剂（3.7），电磁振荡3s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。8.试样酶活力的计算 （AE - AB）K + COXD = 1000 （1） Mt式（1）中：XD 试样稀释液的木聚糖酶活力，U/ml；AE 酶反应液的吸光度；AB 酶空白样的吸光度；K 标准曲线的斜率；CO 标准曲线的截距；M 木糖的分子量（150.2）；t 酶解反应时间，min；1000 转化因子，1mmol = 1000 umol。XD值应在0.040.08 u/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。X = XDDf （2）式（2）中：X 试样木聚糖酶的活力，u/g；Df 试样的总稀释倍数。酶活力的计算值保留三位有效数字。9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。-葡聚糖酶活力的测定1.-葡聚糖酶活力单位定义在37、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的-葡聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。2.测定原理-葡聚糖酶能将-葡聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中-葡聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中-葡聚糖酶的活力。3.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1葡糖糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/ml：称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氫氧化鈉20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.5 乙酸乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOHCH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。3.6 -葡聚糖溶液：0.8%（w/v）称取-葡聚糖（Sigma G6513）0.80g，加入10ml无水乙醇，润湿2分钟，再加入50ml乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至-葡聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）定容至100ml。-葡聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4避光保存，有效期为3天。冷冻保存，有效期为2个月（使用前在4条件下解冻）。3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml，搅拌5s，水浴至45。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（3.4），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。4.仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。4.2 分样筛：孔径为0.25mm（60目）。4.3 分析天平：感量0.001g。4.4 pH计：精确至0.01。4.5 磁力搅拌器：附加热功能。4.6 电磁振荡器。4.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45m。4.8 离心机：2000g以上。4.9 恒温水浴锅：温度控制范围在3060之间，精度为0.1。4.10 秒表：每小时误差不超过5s。4.11 分光光度计：能检测350800nm的吸光度范围。4.12 移掖器；精度为1ml。5.标准曲线的绘制吸取缓冲液（3.5）4.0ml，加入DNS试剂（3.7）5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。分别吸取葡萄糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml，分别用缓冲液（3.5）定容至100ml，配制成浓度为0.100.70mg/ml葡萄糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试剂（3.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。6.试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm）。称取试样两份，精确至0.001g。加入50ml乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（3.5）定容至100ml，在4条件下避光保存24h。摇匀，取出30-50ml，2000g离心3min。吸取5.00ml上清液，再用缓冲溶液（3.5）做二次稀释（稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.040.08 u/ml之间）。液体试样可以直接用乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）进行稀释、定容（稀释后的酶液中葡聚糖酶活力最好能控制在0.040.08 u/ml之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5，需要用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节、校正至5.5，然后再用缓冲溶液（3.5）做适当定容。7 测定步骤吸取4.0ml-葡聚糖溶液（3.6），37平衡10min。吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37平衡10min。吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37平衡），加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试剂（3.7），电磁振荡3s。然后加入2.0ml-葡聚糖溶液（3.6），40保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。吸取2.0ml经过适当稀释的酶液（已经过37平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml葡聚糖溶液（3.6）（已经过37平衡），电磁振荡3s，37精确保温30min。加入5.0mlDNS试剂（3.7），电磁振荡3s，酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。8.试样酶活力的计算 （AE - AB）K + COXD = 1000 （1） Mt式（1）中：XD 试样稀释液中的-葡聚糖酶活力，u/ml；AE 酶反应液的吸光度；AB 酶空白样的吸光度；K 标准曲线的斜率；CO 标准曲线的截距；M 葡萄糖的分子量（180.2）；t 酶解反应时间，min；1000 转化因子，1mmol = 1000 umol。XD值应在0.040.08 u/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。X = XDDf （2）式（2）中：X 试样-葡聚糖酶的活力，u/g；Df 试样的总稀释倍数。酶活力的计算值保留三位有效数字。9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。纤维素酶活力的测定1.纤维素酶活力单位定义在37、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。2.测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。3.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1葡糖糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/ml：称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氫氧化鈉20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.5 乙酸乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOHCH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。3.6 羧甲基纤维素钠溶液：0.8%（w/v）称取羧甲基纤维素钠（Sigma C5678）0.80g，加入80ml乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）定容至100ml。羧甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4避光保存，有效期为3天。3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml，搅拌5s，水浴至45。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（3.4），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。4.2 分样筛：孔径为0.25mm（60目）。4.3 分析天平：感量0.001g。4.4 pH计：精确至0.01。4.5 磁力搅拌器：附加热功能。4.6 电磁振荡器。4.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45mm。4.8 离心机：2000g以上。4.9 恒温水浴锅：温度控制范围在3060之间，精度为0.1。4.10 秒表：每小时误差不超过5s。4.11 分光光度计：能检测350800nm的吸光度范围。4.12 移掖器；精度为1ml。5 标准曲线的绘制吸取缓冲液（3.5）4.0ml，加入DNS试剂（3.7）5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。分别吸取葡萄糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml，分别用缓冲液（3.5）定容至100ml，配制成浓度为0.100.70mg/ml葡萄糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试剂（3.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm）。称取试样两份，精确至0.001g。加入50ml乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（3.5）定容至100ml，在4条件下避光保存24h。摇匀，取出30-50ml，2000g离心3min。吸取5.00ml上清液，再用缓冲溶液（3.5）做二次稀释（稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.040.08 u/ml之间）。液体试样可以直接用乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）进行稀释、定容（稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.040.08 u/ml之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5，需要用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节、校正至5.5，然后再用缓冲溶液（3.5）做适当定容。7 测定步骤吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液（3.6），37平衡10min。吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37平衡10min。吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37平衡），加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试剂（3.7），电磁振荡3s。然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液（3.6），37保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。吸取2.0ml经过适当稀释的酶液（已经过37平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml羧甲基纤维素钠（3.6）（已经过37平衡），电磁振荡3s，37精确保温30min。加入5.0mlDNS试剂（3.7），电磁振荡3s，酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。8.试样酶活力的计算 （AE - AB）K + COXD = 1000 （1） Mt式（1）中：XD 试样稀释液中的纤维素酶活力，u/ml；AE 酶反应液的吸光度；AB 酶空白样的吸光度；K 标准曲线的斜率；CO 标准曲线的截距；M 葡萄糖的分子量（180.2）；t 酶解反应时间，min；1000 转化因子，1mmol = 1000 umol。XD值应在0.040.08 u/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。X = XDDf （2）式（2）中：X 试样纤维素酶的活力，u/g；Df 试样的总稀释倍数。酶活力的计算值保留三位有效数字。9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。果胶酶活力的测定1.酶活定义在pH5.5、37下，每分钟内从浓度为4mg/ml的底物（Fluka 76280或Sigma P9135）溶液中分解释放1umol还原物质（表述为半乳糖醛酸）所需要的酶量为一个酶活单位u。2.测定原理果胶酶能将聚半乳糖醛酸降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中果胶酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中果胶酶的活力。3.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1葡糖糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/ml：称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氫氧化鈉20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.5 乙酸乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOHCH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。3.6 聚半乳糖醛酸溶液：0.8%（w/v）称取果胶（Sigma P9135）0.80g，加入80ml乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至聚半乳糖醛酸完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）定容至100ml。聚半乳糖醛酸溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4避光保存，有效期为3天。3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml，搅拌5s，水浴至45。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（3.4），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。4.2 分样筛：孔径为0.25 mm（60目）。4.3 分析天平：感量0.001 g。4.4 pH计：精确至0.01。4.5 磁力搅拌器：附加热功能。4.6 电磁振荡器。4.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45m。4.8 离心机：2000g以上。4.9 恒温水浴锅：温度控制范围在3060之间，精度为0.1。4.10 秒表：每小时误差不超过5s。4.11 分光光度计：能检测350800nm的吸光度范围。4.12 移掖器；精度为1ml。5. 标准曲线制备标准一水D半乳糖醛酸溶液，一水半乳糖醛酸的浓度范围应在110mg/ml之间。用缓冲液溶解1.0克一水半乳糖醛酸，定容至100ml，获得浓度为10mg/ml的半乳糖醛酸溶液。然后用缓冲液作系列稀释，配制浓度为0、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml和8.0mg/ml的标准底物溶液。吸取2.0ml标准溶液和2.0ml蒸馏水，加入到试管中。震荡，加入5mlDNS试剂，震荡、蒸煮5分钟。然后在自来水中冷却。再用蒸馏水定容至25ml。震荡摇匀，在2000g离心10min，取滤液，以浓度为0的反应液（标准空白样）作为基准，调零。在540nm处测定吸光度。测定值做2个重复，取平均值。每次更换DNS试剂，标准曲线需要重新绘制。6. 酶活测定精确称取1.000克样品用缓冲液溶解酶样，稀释至适当浓度。酶样吸光度AX 吸取2.0ml酶稀释液，加入到试管中，加入2.0ml果胶底物溶液，在40平衡，震荡。在40精确水浴30分钟。加入5mlDNS试剂，混合。用帽塞盖住试管。在沸水中精确保温5分钟。然后，在冰水中终止反应。再蒸馏水定容至25ml，充分摇匀，在2000g离心10min。取上清液，以标准空白样为基准，调零，在540nm处测定吸光度（吸光度在0.150.7之间，如果超过此范围，重新确定稀释度。）。测定值做2个重复，取平均值。酶空白样吸光度 AO 吸取2.0ml聚半乳糖醛酸溶液，在37精确保温30min。加入5mlDNS试剂，震荡。加入2.0ml酶的稀释液，混合。在沸水中精确蒸煮5min。然后用水冷却，终止反应。用蒸馏水定容至25ml，充分摇匀，然后在2000g离心10min，取上清液。以标准空白样为基准，调零，在540nm处测定吸光度。测定值做2个重复，取平均值。7. 酶活计算AX AOK1000Df酶活A = （u/g）WtAX：酶样的吸光度；AO： 酶空白样的吸光度；K：标准曲线的斜率；1000：转换因子1 mmol = 1000 umol；Df：稀释倍数；W：一水半乳糖醛酸的分子量（212.16）；t：反应时间（min）。甘露聚糖酶活力的测定1.甘露聚糖酶活力单位定义在37、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖（Sigma G0753）溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。2.测定原理甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。3.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1甘露糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/ml：称取无水D-甘露糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氫氧化鈉20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.5 乙酸乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOHCH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。3.6 甘露聚糖溶液：0.6%（w/v）称取甘露聚糖（Sigma G0753）0.60g，加入80ml乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至甘露聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）定容至100ml。甘露聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4避光保存，有效期为3天。3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml，搅拌5s，水浴至45。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（3.4），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。4.2 分样筛：孔径为0.25mm（60目）。4.3 分析天平：感量0.001g。4.4 pH计：精确至0.01。4.5 磁力搅拌器：附加热功能。4.6 电磁振荡器。4.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45mm。4.8 离心机：2000g以上。4.9 恒温水浴锅：温度控制范围在3060之间，精度为0.1。4.10 秒表：每小时误差不超过5s。4.11 分光光度计：能检测350800nm的吸光度范围。4.12 移掖器；精度为1ml。5 标准曲线的绘制吸取缓冲液（3.5）4.0ml，加入DNS试剂（3.7）5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。分别吸取甘露糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml，分别用缓冲液（3.5）定容至100ml，配制成浓度为0.100.70mg/ml D-甘露糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00ml（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试剂（3.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以甘露糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm）。称取试样两份，精确至0.001g。加入50ml乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（3.5）定容至100ml，在4条件下避光保存24h。摇匀，取出30-50ml，2000g离心3min。吸取5.00ml上清液，再用缓冲溶液（3.5）做二次稀释（稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.040.08 u/ml之间）。液体试样可以直接用乙酸乙酸钠缓冲溶液（3.5）进行稀释、定容（稀释后的酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.040.08 u/ml之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5，需要用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节、校正至5.5，然后再用缓冲溶液（3.5）做适当定容。7 测定步骤吸取10.0ml甘露聚糖溶液（3.6），37平衡10min。吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37平衡10min。吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37平衡），加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试剂（3.7），电磁振荡3s。然后加入2.0ml甘露聚糖溶液（3.6），37保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。吸取2.0ml经过适当稀释的酶液（已经过37平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml甘露聚糖溶液（3.6）（已经过37平衡），电磁振荡3s，37精确保温30min。加入5.0mlDNS试剂（3.7），电磁振荡3s，酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。8.试样酶活力的计算 （AE - AB）K + COXD = 1000 （1） Mt式（1）中：XD 试样稀释液中的甘露糖聚酶活力，u/ml；AE 酶反应液的吸光度；AB 酶空白样的吸光度；K 标准曲线的斜率；CO 标准曲线的截距；M 甘露糖的分子量（180.2）；t 酶解反应时间，min；1000 转化因子，1mmol = 1000 umol。XD值应在0.040.08 u/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。X = XDDf （2）式（2）中：X 试样甘露聚糖酶的活力，u/g；Df 试样的总稀释倍数。酶活力的计算值保留三位有效数字。9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。酸性蛋白酶活力的测定1.酶活定义在37、pH3.0条件下，每分钟从浓度为1.0%的酪蛋白溶液中降解释放1微克酪氨酸所需要的酶量为一个酶活单位u。2.测定原理蛋白酶在一定温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。在碱性条件下，含有酚基的氨基酸可以将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝。用分光光度计测定反应液的颜色强度，对照标准曲线计算酪氨酸的产生量和酶活力。3.配制副林试剂在2000ml磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO42H2O）100g、钼酸钠（Na2MOO42H2O）25g，水700ml、85%的磷酸50ml、浓盐酸100ml，小心沸腾回流10h。再取下回流冷凝器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50ml和数滴浓溴水（99.0%），沸腾15min，以除去多余的溴。如冷却后仍有绿色，需要再加溴水，再煮沸除去过量的溴。冷却，加水定容到1000ml。制得的试剂应呈黄色，存储在棕色瓶内。使用时加2倍的蒸馏水稀释。4.绘制标准曲线称取干燥无水的酪氨酸0.1000g，用0