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第十五章 蛋白质及核酸（一）蛋白质蛋白质是由多种-氨基酸组成的一类天然高分子化合物，分子量一般可由一万左右到几百万，有的分子量甚至可达几千万，但元素组成比较简单，主要含有碳、氢、氮、氧、硫，有些蛋白质还有磷、铁、镁、碘、铜、锌等。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%，即每克氮相当于6.25g蛋白质，生物体中的氮元素，绝大部分都是以蛋白质形式存在，因此，常用定氮法先测出农副产品样品的含氮量，然后计算成蛋白质的近似含量，称为粗蛋白含量。W粗蛋白=W氮6.2515.1 肽的结构化和名称15.2 多肽 一般肽中含有的氨基酸的数目为二到九,根据肽中氨基酸的数量的不同,肽有多种不同的称呼:由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等,一直到九肽。通常由10100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，它们的分子量低于10，000Da（Dalton，道尔顿），能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。也有文献把由210个氨基酸组成的肽称为寡肽（小分子肽）；1050个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质,换言之,蛋白质有时也被称为多肽。 多肽也简称为肽，是20世纪被发现的。多肽有生物活性多肽和人工合成多肽两种。生物提取的多肽具有很强的活性，所以叫做活性肽！只有活性的肽才能对人体产生很好的效果!但是人工合成的多肽有很多是没有活性的，是需要筛选的，只有活性肽才能被人体安全使用！15.2.1多肽链的测定(1)N-末端测定A.二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)：1945年Sanger提出此方法，是他的重要贡献之一。DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后，通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸。B.氰酸盐法：1963年Stank及Smyth介绍了一种测定N末端的新方法，步骤如下：由于乙内酰脲氨基酸不带电荷，因此可用离子交换层析法将它与游离氨基酸分开，分离所得的乙内酰脲氨基酸再被盐酸水解，重新生成游离的氨基酸，鉴别此氨基酸即可了解N-末端是何种氨基酸。C.二甲基氨基萘磺酰氯法：1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法，采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯，简称丹磺酰氯。它与游离氨基末端作用，方法类似于Sanger的DNFB法，产物是磺酰胺衍生物。丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍，样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP氨基酸高)，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。(2)C-末端分析A.肼解法：这是测定C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中，100下进行反应，结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放，而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。这样羧基末端氨基酸可以采用抽提或离子交换层析的方法将其分出而进行分析。如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺，则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基酸。此外肼解时注意避免任何少量的水解，以免释出的氨基酸混淆末端分析。B.羧肽酶水解法：羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。15.2.2多肽的合成15.3蛋白质蛋白质是结构复杂的多肽，是一类含氮高分子化合物，是生物体内组成细胞的基础物质。15.3.1蛋白质的组成蛋白质是由C（碳）、H（氢）、O（氧）、N（氮）组成，一般蛋白质可能还会含有P、S、Fe（铁）、Zn（锌）、Cu（铜）、B（硼peng）、Mn(锰)、I（碘）、Mo（钼）等 这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳 50% 氢7% 氧23% 氮16% 硫03% 其他 微量 15.3.2 蛋白质的性质1.两性 蛋白质是由-氨基酸通过肽键构成的高分子化合物，在蛋白质分子中存在着氨基和羧基，因此跟氨基酸相似，蛋白质也是两性物质。 可发生水解反应 蛋白质在酸、碱或酶的作用下发生水解反应，经过多肽，最后得到多种-氨基酸。 蛋白质水解时，应找准结构中键的“断裂点”，水解时肽键 如：蛋白质 nH2NCH2COOH 找到“断裂点”就可以确定蛋白质水解的产物 例如某蛋白质水解 可得三种-氨基酸，为H2NCH2COOH、 2. 盐析 少量的盐（如硫酸铵、硫酸钠等）能促进蛋白质的溶解，如向蛋白质水溶液中加入浓的无机盐溶液，可使蛋白质的溶解度降低，而从溶液中析出，这种作用叫做盐析 这样盐析出的蛋白质仍旧可以溶解在水中，而不影响原来蛋白质的性质，因此盐析是个可逆过程利用这个性质，采用盐析方法可以分离提纯蛋白质 3. 变性 在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等作作用下，蛋白质会发生性质上的改变而凝结起来这种凝结是不可逆的，不能再使它们恢复成原来的蛋白质蛋白质的这种变化叫做变性 蛋白质变性后，就失去了原有的可溶性，也就失去了它们生理上的作用因此蛋白质的变性凝固是个不可逆过程 造成蛋白质变性的原因 物理因素包括：加热、加压、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波等： 化学因素包括：强酸、强碱、重金属盐、三氯乙酸、乙醇、丙酮等。 4. 胶体的性质 有些蛋白质能够溶解在水里（例如鸡蛋白能溶解在水里）形成溶液。具有胶体性质。 蛋白质的分子直径达到了胶体微粒的大小（109107m）时，所以蛋白质具有胶体的性质。5. 颜色反应 蛋白质可以跟许多试剂发生颜色反应例如在鸡蛋白溶液中滴入浓硝酸，则鸡蛋白溶液呈黄色这是由于蛋白质（含苯环结构）与浓硝酸发生了颜色反应的缘故还可以用双缩脲试剂对其进行检验,该试剂遇蛋白质变紫. 蛋白质在灼烧分解时，可以产生一种烧焦羽毛的特殊气味 利用这一性质可以鉴别蛋白质15.3.3 蛋白质的结构蛋白质是具有特定构象的大分子，为研究方便，将蛋白质结构分为四个结构水平，包括一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。1. 一级结构 蛋白质的一级结构（primary structure）就是蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序（sequence），也是蛋白质最基本的结构。它是由基因上遗传密码的排列顺序所决定的。各种氨基酸按遗传密码的顺序，通过肽键连接起来，成为多肽链，故肽键是蛋白质结构中的主键。迄今已有约一千种左右蛋白质的一级结构被研究确定，如胰岛素，胰核糖核酸酶、胰蛋白酶等。蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级结构，成百亿的天然蛋白质各有其特殊的生物学活性，决定每一种蛋白质的生物学活性的结构特点，首先在于其肽链的氨基酸序列，由于组成蛋白质的20种氨基酸各具特殊的侧链，侧链基团的理化性质和空间排布各不相同，当它们按照不同的序列关系组合时，就可形成多种多样的空间结构和不同生物学活性的蛋白质分子。蛋白质的二级结构是指多肽链骨架盘绕折叠所形成的有规律性的结构。最基本的二级结构类型有-螺旋结构和-折叠结构，此外还有-转角和自由回转。右手-螺旋结构是在纤维蛋白和球蛋白中发现的最常见的二级结构,每圈螺旋含有3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm,螺旋中的每个肽键均参与氢键的形成以维持螺旋的稳定。-折叠结构也是一种常见的二级结构，在此结构中，多肽链以较伸展的曲折形式存在，肽链（或肽段）的排列可以有平行和反平行两种方式。氨基酸之间的轴心距为0.35nm,相邻肽链之间借助氢键彼此连成片层结构。2. 二级结构 蛋白质的二级结构的维持稳定确实是氢键在作用的，这是因为在无论如何的情况下，蛋白质内的氢原子都是在电子云极其稀薄的情况下的，所以其他电负性强的原子就会结合他，这就和水里面的氢键一样，水的氢键是一个水分子的氧原子和两个其他水分子的氢原子产生氢键，而自身的氢原子又参与了其他水分子的结合产生氢键一样。而考虑到分子的立体结构，氢原子只有在其结合其它原子的另一个方向上才可以和其他原子产生氢键的，而这个方向可以有广泛的结合范围，并且氢键并不是让氢原子的电子云得到充实得很多，所以一个氢原子完全可以产生这样的结构。这是第一个原因。第二个原因是：并不是所有的氢原子在一级结构中就产生了氢键，还有好多的氢原子（当然也有氧原子和其他电负性很强的原子）没有产生氢键，最明显的就是赖氨酸和酪氨酸的结构了，因为他们结构的特殊性，所以造成了他们附近的相连氨基酸的结构不能和其他的相关原子产生氢键，所以这样很容易有其他“遗漏”的潜在氢键产生。3. 三级结构蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象。三级结构是在二级结构的基础上进一步盘绕，折叠形成的。三级结构主要是靠氨基酸侧链之间的疏水相互作用，氢键，范德华力和静电作用维持的。 名词解释: 蛋白质三级结构：指一条多肽链在二级结构的基础上，进一步盘绕，折叠，从而产生特定的空间结构4. 四级结构蛋白质四级结构：指亚基的种类，数目及各个亚基在寡聚蛋白中的空间排布和亚基之间的互相作用。 蛋白质是具有特定构象的大分子，为研究方便，将蛋白质结构分为四个结构水平，包括一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。一般将二级结构、三级结构和四级结构称为三维构象或高级结构。 一级结构指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序。肽键是蛋白质中氨基酸之间的主要连接方式，即由一个氨基酸的-氨基和另一个氨基酸的-之间脱去一分子水相互连接。肽键具有部分双键的性质，所以整个肽单位是一个刚性的平面结构。在多肽链的含有游离氨基的一端称为肽链的氨基端或N端，而另一端含有一个游离羧基的一端称为肽链的羧基端或C端。（二）核酸由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸，简称RNA和脱氧核糖核酸，简称DNA。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用，其中转移核糖核酸，简称tRNA，起着携带和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称mRNA，是合成蛋白质的模板；核糖体的核糖核酸，简称rRNA，是细胞合成蛋白质的主要场所。15.4 核酸的组成核酸是生物体内的高分子化合物。它包括脱氧核糖和核糖核酸两大类。DNA和RNA都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的，由C、H、O、N、P 5种元素组成。15.4.1核糖及脱氧核糖1. 核糖是一种单糖，分子式C4H9O4CHO。 D-核糖和D-2-脱氧核糖是核酸中的碳水化合物组分，以呋喃糖型广泛存在于植物和动物细胞中。D-核糖也是多种维生素、辅酶以及某些抗生素，如新霉素A、B和巴龙霉素的成分。 D-核糖为片状结晶；熔点87；在水溶液中它是呋喃糖和直链糖的平衡混合物。核糖是核糖核酸分子的一个组成部分，是生命现象中非常重要的一种糖。 它一种戊醛糖，分子式C5H10O5，是在细胞中发现的，是细胞核的重要组成部分，是人类生命活动中不可缺少的物质。它具有醛糖的通性(参看葡萄糖的性质)、它是核糖核酸(RNA)的重要组成部分。 另一种重要的核糖是脱氧核糖，分子式C5H10O4，是分子中氢原子数和氧原子数不符合21的一种戊醛糖，它是脱氧核糖核酸(DNA)的重要组成部分。 2. 脱氧核糖英文名称：Deoxyribose 分子式C4H9O3CHO。D-2-脱氧核糖是核糖的一个2位羟基被氢取代的衍生物。它在细胞中作为脱氧核糖核酸DNA的组分，十分重要。最早由胸腺核苷中析离得到。 a-D-2-脱氧核呋喃糖的熔点7882,比旋光度aD55。-异构体熔点9698，aD9158。D-2-脱氧核糖与苯胺形成结晶的半缩醛，熔点175177。aD46，它常用于D-2-脱氧核糖的分离提纯和贮存，需要时将半缩醛胺与苯甲醛反应，即得2-脱氧核糖。2-脱氧核糖可进行多种特殊颜色反应，并可进行定量测定。常用的方法是2-脱氧核糖在硫酸和乙酸存在下与二苯胺反应得蓝色，与硫酸亚铁反应也得蓝色，称为凯勒-基连尼反应。D-2-脱氧核糖很易与乙醇-HCl作用形成糖苷，这种糖苷很易水解15.4.2碱基这几个杂环体系的碱基如下式： 15.4.3核苷在核酸和脱氧核酸中，核糖和脱氧核糖都形成五元环的呋喃糖的形式，在3位或5位的羟基和磷酸成酯。所有的碱基都以-苷键的形式在1位上结合，因此由以上组分形成的核苷和核酸，具有下列的结构，现仅举一两个例子来说明： 腺嘌呤核苷或腺苷3-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸2-脱氧腺嘌呤核苷或脱氧腺苷2-脱氧胸腺嘧啶核苷或脱氧胸苷5-尿嘧啶核苷酸或尿苷酸15.4.4核苷酸核苷中的戊糖5碳原子上羟基被磷酸酯化形成核苷酸。核苷酸分为核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸两大类。依磷酸基团的多少，有一磷酸核苷、二磷酸核苷、三磷酸核苷。核苷酸在体内除构成核酸外，尚有一些游离核苷酸参与物质代谢、能量代谢与代谢调节，如三磷酸腺苷（ATP）是体内重要能量载体；三磷酸尿苷参与糖原的合成；三磷酸胞苷参与磷脂的合成；环腺苷酸（cAMP）和环鸟苷酸（cGMP）作为第二信使，在信号传递过程中起重要作用；核苷酸还参与某些生物活性物质的组成：如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+），尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。15.4.5多聚核苷酸 核苷酸在核酸长链上的排列顺序，也称为碱基序列。几个或十几个核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的分子称寡核苷酸，由更多的核苷酸连接而成的聚合物就是多聚核苷酸。多聚核苷酸链的方向：53DNA碱基组成规律：1.A=T，G=C。 2.碱基组成有种属特异性 3.碱基组成无组织或器官特异性 4.碱基组成一般不受环境影响DNA分子由两条以脱氧核糖- 磷酸作骨架的双链组成，以右手螺旋的方式围绕同一公共轴有规律地盘旋。螺旋直径2nm，并形成交替出现的大沟和小沟。 15.5核糖核酸和脱氧核糖核酸 DNA和RNA的基本化学组成类别DNARNA基本单位脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸 鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 腺嘌呤核苷酸 鸟嘌呤核苷酸 胞嘧啶核苷酸 尿嘧啶核苷酸碱基腺嘌呤（A) 鸟嘌呤（G) 胞嘧啶（C) 胸腺嘧啶（T) 腺嘌呤（A) 鸟嘌呤（G) 胞嘧啶（C) 尿嘧啶（U） 五碳糖脱氧核糖 核糖酸磷酸 磷酸 15.5.1 DNA的一级结构 DNA的一级结构是指分子中脱氧核苷酸的排列顺序，常被简单认为是碱基序列（base sequence）。碱基序有严格的方向性和多样性。一般将5- 磷酸端作 为多核苷酸链的“头”，写在左侧，如pACUGA（ 5 3） 。 在DNA一级结构中，有一种回文结构的特殊序列，所谓回文结构即DNA互补链上一段反向重复顺序，正读和反读意义相同，经反折可形成“十字形”结构，在转录成RNA后可形成“发夹”样结构，有调控意义。 GCTA GTTCA CTC TGAAC AATT CGAT CAAGT GAG ACTTG TTAA 15.5.2 DNA二级结构 1953年，Watson和Crick根据Wilkins 和Franklin拍摄的DNA X-射线照片（DNA有0.34nm和3.4nm两个周期性变化）以及Chargaff等人对DNA的碱基组成的分析（A=T，G=C，A+G=C+T），推测出DNA是由两条相互缠绕的链形成。Watson-Crick 双螺旋结构模型如下图：1两条反向平行的多核苷酸链形成右手螺旋。一条链为5 3，另一条为3 5。（某些病毒的DNA是单链分子ssDNA）2碱基在双螺旋内侧，A与T，G与C配对，A与T形成两个氢键，G与C形成三个氢键。糖基-磷酸基骨架在外侧。表面有一条大沟和一小沟。3螺距为3.4 nm，含10个碱基对（bp），相邻碱基对平面间的距离为0.34 nm。螺旋直径为2 nm。氢键维持双螺旋的横向稳定。碱基对平面几乎垂直螺旋轴，碱基对平面间的疏水堆积力维持螺旋的纵向稳定。4碱基在一条链上的排列顺序不受限制。遗传信息由碱基序所携带。5DNA构象有多态性。Watson和Crick根据Wilkins 和Franklin拍摄的DNA X-射线照片是相对湿度92%的DNA钠盐所得的衍射图，因此Watson-Crick 双螺旋结构称B-DNA。细胞内的DNA与它非常相似。另外还有A-DNA