L_谷氨酰胺产生菌的选育和代谢流量分析.pdf

的提取工艺条件下测得核桃仁内隔膜中总黄酮含量为 6 430 3 2 该方法较简单 快速 稳定 并且实验结果为核桃仁内隔 膜的综合利用提供了实验依据 因此 可作为测定核桃仁内 隔膜总黄酮含量的一种方法 核桃仁内隔膜中黄酮类物质含 量丰富 具有较大的开发利用价值 参考文献 1 陈勤 李磊珂 吴耀 核桃仁的成分与药理研究进展 J 安徽大学学 报 自然科学版 2005 29 1 86 89 2 谢宗万 全国中草药汇编 上册 M 3 版 北京 人民卫生出版社 1996 667 668 3 买合布白 阿不都热依木 艾克白尔 库尔班尼莎 等 心草中总黄 酮含量的测定及其提取工艺研究 J 生物技术 2007 17 4 67 69 4 郑春英 李宏涛 陆欣媛 等 五味子叶中总黄酮最佳提取工艺的 研究 J 食品科学 2007 28 5 139 141 5 刘森 中草药成分提取分离与制剂加工新技术新工艺新标准实用 手册 M 北京 中国教育出版社 2004 69 184 L 谷氨酰胺产生菌的选育和代谢流量分析 刘春辉 张伟国 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122 摘要 目的 建立并完善嗜乙酰乙酸棒杆菌 YL012 及其突变株 LCHA0082 合成 L 谷氨酰胺的中心代谢网络 方法 分别测 定了它们在特定培养时段 48h 50h L 谷氨酰胺等代谢物的胞外浓度 由此计算这一时段这些代谢物在发酵液中积累 或消 耗 的速率 分别作出这两株菌在拟稳态下的代谢流量分布图 进而研究诱变育种过程中不同诱变标记对代谢网络中 L 谷氨酰 胺合成流量分布的影响 结果 育种操作使流量分配朝着有利于 L 谷氨酰胺合成的方向改变 流入谷氨酸节点的流量由 291198mmol P L h上升到 44 854mmolP L h 提高到原来的 1 5 倍左右 合成 L 谷氨酰胺的流量由 18 138mmolP L h 上升 至 311065mmol P L h 效果明显 结论 从代谢流量分析角度上 证明诱变育种对代谢流量的改变起到明显的作用 代谢流量分析也为 新的设计育种提供了思路 关键词 嗜乙酰乙酸棒杆菌 L 谷氨酰胺 诱变育种 发酵 代谢流分析 中图分类号 TQ922 9 文献标识码 A 文章编号 1004 311X 2009 04 0063 05 Breeding of L Glutamine Producer and Its Metabolic Flux Analysis LIU Chun hui ZHANG Wei guo Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education Jiangnan University Wuxi 214122 China Abstract Objective Inthis paper the center metabolic networks of Corynebacterium acetoacidophilum YL012 and its mutant LCHA0082were es tablished and modified Method The concentrations of extra cellular metaboliteswere determined under sub steady state 48 h 50 h in the batch culture The metabolic flux distributionmaps of the two strains were obtained and compared after the accumulation or consumption rates of these metabolites were measured in the broth inthe specific time Result These results indicate that the breeding process skew the metabolic flux towards the formation of L glutamine obviously The flow to node of glutamate increased from 29 198 mmol PL h to 44 854mmolP L h about 115 times of the original The flow to L glutamine synthesis changed from 18 138mmolP L hto 31 065 mmol P L h the effect was significant Conclu sion This study revealed the usefulness of breeding process towards existing productionstrains after the metabolic flux analysis as a tool The analy sis may play an important role in helping us to rationally re design metabolism for further improvement of fermentation process Key words Corynebacterium acetoacidophilum L glutamine breeding fermentation metabolic flux analysis 收稿日期 2009 02 01 修回日期 2009 02 27 作者简介 刘春辉 1984 男 东营市人 硕士生 研究方向 氨基酸 菌种选育 通讯作者 张伟国 1963 男 博士生导师 教授 研究 方向 工 业微 生 物菌 种 选 育 生物 能 源和 生 物 新材 料 Email liuchunhui lang 163 com L 谷氨酰胺 L Glutamine 是 L 谷氨酸C 羧基酰胺化 的一种氨基酸 作为 20 种构成蛋白质的基本氨基酸之一 在 生物体代谢中起着举足轻重的作用 具有许多特殊的功能 被 归类为条件必需氨基酸 1 3 目前国外临床上主要将它应用 于治疗精神萎靡 酒精中毒及胃和十二指肠溃疡等疾病 另 外它还具有增进神经机能 改善脑出血后的记忆障碍 促进智 力不佳儿童的智力发展 防止癫痫发作等功能 是一种极有发 展前途的新药 4 6 代谢流量分析 metabolic flux analysis MFA 7 代谢工程中 用以指导遗传操作和代谢网络分析的基本方法 这种分析方 法根据胞内主要反应的化学计量模型和胞内代谢产物的质量 平衡来计算胞内的代谢流量 它的基础是拟稳态假设 8 假设 在产物形成速率最快的阶段各种中间代谢物的胞内浓度变化 速率为 0 根据质量平衡由 n 个中间代谢物即可得到 n 个关 于速率的方程 通过测定胞外代谢产物的浓度 计算未知途径 的流量 9 11 得到胞内代谢流的分布模式 本文通过NTG 诱变的方法 由出发菌株嗜乙酰乙酸棒杆 菌YL012 MSOR 得到其带有遗 传标记的突变株 LCHA0082 MSOR SGR NH4 2SO4 R SucG NaFR 而后建立并比较两株 菌的代谢网络 研究了遗传标记对代谢流量的影响 并根据 流量分布为以后的设计代谢提供了参考 嗜乙酰乙酸棒杆菌 进行谷氨酰胺发酵代谢流分析方面尚未见相关报道 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 实验材料 嗜乙 酰 乙 酸 棒 杆 菌 Corynebacterium acetoacidophilum YL012 本实验室保藏 1 1 2 试剂 葡萄糖 食品级 蚌埠柠檬酸厂 玉米浆 工业级 无锡 酶制剂厂 NH4 2SO4 工业级 鹰潭生物化学制品厂 丙酮 甲醇 分析纯 L 异亮氨酸 L 缬氨酸 L 精氨酸 L 甘氨 酸 L 谷氨酸 L 谷氨酰胺 L 脯氨酸 L 赖氨酸 L 苯丙 氨酸 L 亮氨酸 L 酪氨酸 生化试剂 中国医药集团上海 化学试剂公司 1 1 3 仪器 电子天平 Mettle 公司 超净工作台 苏净集团安泰公司 往复式摇床 无锡查桥轻机厂 电热恒温培养箱 电热鼓风干 燥箱 上海跃进医疗器械厂 GSP 77 03 磁力搅拌器 江苏泰 县姜埝无线电厂 立式圆形压力蒸汽灭菌器 上海医用核子仪 器厂 TGL 16G 高速台式离心机 上海医用仪器分析厂 高效 液相色谱仪 HP1100 惠普公司 1 1 4 培养基 1 完全培养基 葡萄糖 5g P L 蛋白胨 10g PL 牛肉膏 10g PL NaCl 5gP L 琼脂 25g PL pH 7 0 2 基本培养基 葡萄糖 20g PL NH4 2SO41 5g PL KH2PO4 1g P L K2HPO43g P L MgSO4 7H2O 0 1g P L MnSO4 4H2O 0 01g PL FeSO4 7H2O 0 01g P L 尿素 1 5gP L 生物素 30Lg PL 硫胺素 HCl 100LgP L 琼脂 20g PL pH 7 0 3 摇 瓶种 子培 养基 葡萄 糖 20g PL NH4 2SO45g PL 63 2009 年 19 4 生 物 技 术 KH2PO41g PL MgSO4 7H2O 0 5gP L 玉米浆3g P L CaCO310g P L pH 7 0 4 摇瓶发酵培养基 葡萄糖 130g PL NH4 2SO455g P L KH2PO41 2 MgSO4 7H2O 0 6 MnSO4 4H2O 0 003 FeSO4 7H2O 0 005 ZnSO4 7H2O 0 006 CaCO325g P L pH 7 5 基本培养基 完全培养基和种子培养基均在 0 1MPa 压力 下灭菌 20min 发酵培养基在 0 07MPa 压力下灭菌 8min 1 2 方法 1 2 1 L 谷氨酰胺测定 纸层析 茚三酮显色比色定量法及 氨基酸自动分析仪 1 2 2 L 谷氨酸测定 SBA 40 型生物传感器 山东省科学 院生物研究所 1 2 3 菌体浓度测定 12 1 2 4 还原糖测定 菲林试剂法 13 1 2 5 有机酸测定 8 1 2 6 氨基酸测定 氨基酸自动分析仪 2 结果与讨论 2 1 L 谷氨酰胺代谢网络的相关说明 分析L 谷氨酰胺的生物合成途径可知 首先 L 谷氨酰 胺的合成需要碳源 碳源由葡萄糖 Glc 提供 然后葡萄糖经 EMP 途径降解为 L 谷氨酰胺合成所需的前体碳单位丙酮酸 PYR 部分葡萄糖经磷酸戊糖 HMP 途径氧化以提供还原 力 葡萄糖 Glc 的运输和消耗是在磷酸烯醇式丙酮酸 PEP 磷酸转移酶系统 PEP linked phosphotransferase system 简 称 PTS 催化下的集团运输 14 15 Glc PEPy PYR G6P 1 以葡萄糖为氮源时乙醛酸支路活性很低 故可以不考 虑乙醛酸途径 谷氨酰胺 GLN 的的合成 GLU NH4 ATPy GLN 2 菌体生长过程中 铵根离子主要由谷氨酸脱氢酶固定 所以铵根例子由前体 A 酮戊二酸 A KG 谷氨酸 Glu 和 NADPH 代替 A KG NH4 H2O NADPHy GLU NADP 3 谷氨酸 GLU 合成 在NH4 浓度极低的情况下 4 占优 势 但由于摇瓶谷氨酰胺发酵 NH4 充足 所以直接按照 2 反 应 不按 4 反应 A KG GLN NADPHy 2GLU NADP 4 还原力NADPH 的补给 对于包括 L 谷氨酰胺在内的 一般代谢产物的合成 如果胞内存在转氢酶 由于转氢酶可逆 催化NAD H 和NADPH 之间氢的转移反应 可将 L 谷氨酰胺 合成总反应所净得的 NADH 转化为还原力 NADPH 用以供应 NADPH 如 5 所示 NADPH NADy NADP NADH 5 如果胞内不存在转氢酶 即便是反应过程中能够额外生 成NADH 它还是无法转化为还原力 NADPH 那么就需要由额 外的葡萄糖经磷酸戊糖 HMP 途径氧化以提供更多的还原 力 HMP 途径总化学计量关系 G6Py 6CO2 12NADPH 6 根据以上原则建立了 L 谷氨酰胺合成的代谢网络模型 如图 2A 所示 2 2 L 谷氨酰胺形成阶段各菌株的胞外代谢产物浓度的测 定 从L 谷氨酰胺的生物合成的代谢网络分析可知 L 谷 氨酰胺的碳架物质 能量及还原力主要由葡萄糖经中心代谢 途径后提供 所以 本研究主要考虑了与 L 谷氨酰胺合成的 中心代谢途径 EMP 途径和 TCA 循环以及 HMP 途径 主要用 来提供还原力NADPH 又由氨基酸分析数据得到 L 谷氨酰 胺发酵过程中同时产生了多种氨基酸 所以还要考虑包括甘 氨酸 异亮氨酸 丙氨酸 缬氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸 亮氨酸及 赖氨酸的合成途径 同时 考虑了有机酸的合成途径 丙酮酸 PYR 是磷酸烯醇式丙酮酸 PEP 转化而来的 为了考察葡萄 糖经 EMP 途径降解后 PEP 和 PYR 在代谢过程中的流量分配 所以考虑丙酮酸的代谢途径 乳酸和乙酸在有机酸合成网络 中与丙酮酸直接相关 所以也被考查 由 YL012 及其突变株 LCHA0082 的发酵过程曲线可以看 出 菌体生长在 48h 56h 生长缓慢 56h 左右细胞生长已进入 非生长期 48h 50h 内 L 谷氨酰胺生成速度达到最大 可以 认为 48h 50h时间内 细胞内处于拟稳态即各种代谢物的胞 内积累为 0 因此 分别测定发酵进行到 48h 和50h的出发菌株 及其突变株的胞外代谢产物浓度 研究它们在 L 谷氨酰胺形 成阶段的代谢流分布 图 1A 出发菌株 YL012 的发酵过程曲线 Fig 1A The fermentation course curve of strain YL012 图 1B YL012 突变株的发酵过程曲线 Fig 1B The fermentation course curve of mutant strain LCHA0082 表 1 列出了出发菌株 YL012 及其突变株 LCHA0082 分别 发酵到 48h 和 50h 发酵液中的还原糖 氨基酸和有机酸等的胞 外浓度 根据表 1 所示数据 按下式计算代谢产物积累速率 结果见表 2 V C50h C48h 1000 P2MW 其中 V 为底物消耗速率或代谢产物积累速率 单位为 mmol PL h C48h C50h分别为发酵进行到 48h 和 50h 时代谢产物 的胞外浓度 MW 为对应代谢产物的分子量 2 3 L 谷氨酰胺形成阶段各菌株的代谢流量分配的计算 设 V1 V2 V3 V14分别为图 2A 所示途径的代谢流量 64 生 物 技 术 2009年 19 4 假定L 谷氨酰胺形成阶段代谢处于拟稳态 此时各种中间代 谢产物的累积速率为 0 由质量平衡得 表 1 YL012 菌株及其突变株 LCHA0082发酵到 48h 和 50h 时各代谢产 物浓度 Table 1 The various metabolites concentration of YL012 and its mutant strain LCHA0082 during 48h and 50h 代谢物 metabolite time h YL012 gP L LCHA0082 gP L 葡萄糖 Glc 4839 00943 646 180 0 5037 01040 503 谷氨酰胺 Gln 4820 69124 100 146 2 5020 98624 766 酪氨酸 Tyr 486 4436 374 181 2 506 4536 388 甘氨酸 Gly 486 4866 531 75 1 506 5316 541 异亮氨酸 Ile 4815 23612 389 131 2 5015 30612 587 缬氨酸 Val 483 0113 803 117 1 503 0913 900 丙氨酸 Ala 488 9108 903 89 1 508 9218 919 苯丙氨酸 Phe 4813 07513 057 165 2 5013 14713 075 亮氨酸 Leu 4816 50614 746 131 2 5016 61714 887 赖氨酸 Lys 4818 67116 019 146 2 5018 86216 276 丙酮酸 Pyr 480 2090 052 88 1 500 2120 053 脯氨酸 Pro 4812 06514 067 115 1 5012 17714 277 精氨酸 Arg 488 6048 552 174 2 508 6488 617 乳酸 Lac 485 9809 683 90 1 506 0409 810 乙酸 Ac 480 2550 152 60 1 500 2750 188 注 括号内数字表示代谢产物的分子量 Note The moleculerweight of compounds mark in bracket 表 2 YL012 菌株及其突变株 LCHA0082发酵到 48h 和 50h 时各代谢产 物的速率 Table 2 AccumulatingP Consuming velocity of YL012 and its mutant strain LCHA0082 during 48h and 50h 代谢物 metabolite YL012YL012 LCHA0082LC HA0082 葡萄糖 Glc 5 556100 0008 731100 000 谷氨酰胺 Gln 1 00818 1382 27626 065 酪氨酸 Tyr 0 0280 5040 0390 447 甘氨酸 Gly 0 3155 6700 0670 767 异亮氨酸 Ile 0 5329 5690 5748 639 缬氨酸 Val 0 3416 1430 4144 742 丙氨酸 Ala 0 0621 1160 0911 042 苯丙氨酸 Phe 0 2193 9400 0540 618 亮氨酸 Leu 0 4237 6210 4274 891 赖氨酸 Lys 0 65411 7960 87810 056 丙酮酸 Pyr 1 03 10 2 0 186 5 70 10 3 0 065 脯氨酸 Pro 0 4878 7740 91212 941 精氨酸 Arg 0 1272 2860 2222 543 乳酸 Lac 0 3335 9910 7068 085 乙酸 AC 0 1662 9940 2993 425 注 表中所有代谢物的速率为 mmolP L h 葡萄糖代谢速率为消耗速率 为 将葡萄糖的消耗速率计为 100 Note Unit of velocity of the exocelluar metabolites ismmol P L h Assuming that consuming velocity of the glucose is 100mmolP L h V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14 VPYR 根据图 2A 中的数量关系可以计算出嗜乙酰乙酸棒杆菌 YL012 菌株及其突变株 LCHA0082的代谢流量分布图 将葡萄 糖的消耗速率计为 100 表 2 所示 从而得到各菌株的流量分 布图 如图 2B和图 2C所示 图 2A 代谢流量的计算网络图 Fig 2A Calculation of metabolic flux map 图 2B 出发菌株YL012 代谢流量分布图 Fig 2B Metabolic flux distribution map of YL012 2 4 出发菌株 YL012 与其突变株 LCHA0082 代谢流分析结果 比较 在代谢网络中 将两个或多个不同途径的分支汇合点称 为节点 由图 2可知 两株菌相比 L 谷氨酰胺合成网络多 个节点处的流量进行了重新分配 产物的最终产量是各种中 间代谢物分支点处流量分配和合成酶系酶活调节的综合结 果 所以流量的的改变也会直接影响产物产量的改变 本文根据图 2 中YL012 与LCHA0082 各途径的代谢流量 65 2009 年 19 4 生 物 技 术 着重对影响L 谷氨酰胺合成的三个主要节点丙酮酸 PYR 谷氨酸 GLU 天冬氨酸 ASP 处的流量分配变化进行分析和 比较 图 2C YL012突变株 LCHA0082 的代谢流量分布图 Fig 2C Metabolic flux distribution map of LCHA0082 2 4 1 丙酮酸 PYR 节点处的流量分析 丙酮酸除了流入 TCA 循环 还参与丙氨酸 异亮氨酸 缬 氨酸 乳酸和乙酸等杂酸的合成 所以丙酮酸节点处的流量分 布比较复杂 它的流向比较多 从两株菌的流量分布图可看 到流入丙酮酸的流量分别是 74 614 和 85 799 流量有了很大 的变化 LCHA0082带有 SGR的标记 SG 抗性可以增强能量代 谢 使细胞内的 ATP 含量增高 从而使得EMP 途径的中心代谢 途径的流量都有所增加 还有可能诱变后 LCHA0082的耐高糖 能力较YL012有所上升 但也有文献报道 SG 抗性对糖的耐受 性影响不大 从图 2B 和图 2C 可以看出 有丙酮酸向丙氨酸 异亮氨 酸 缬氨酸的流量有所下降 进入TCA 循环的流量由 50 563 升 至63 549 这与 SGR SucG都有关 前者增强能量代谢 后者能 通过增加草酰乙酸的供应强化了三羧酸循环 但是厌氧有机 酸产物乳酸 和乙酸却都有上升 分别由 5 991 2 994 变为 81085和 3 425 因此在发酵过程中必须严格控制溶氧水平 调 节TCA 循环和厌氧产物的代谢流量 2 4 2 谷氨酸 GLU 节点处的流量分析 谷氨酸是谷氨酰胺合成的前体物质 它的流量分配直接 关系到积累谷氨酰胺的量 所以谷氨酸节点是谷氨酰胺合成 代谢分析中最重要的节点 由图 2 可以看出流入谷氨酸节点 的流量由 29 198 上升到 44 854 提高到原来的 1 5 倍左右 这和 Suc 为惟一碳源的筛选有关 也由于 LCHA0082 带有氟化 钠 NaF 抗性标记强化了三羧酸循环中从柠檬酸到A 酮戊二 酸的代谢 对于快速合成谷氨酸比较有利 谷氨酸流量增加 直接引起谷氨酰胺 脯氨酸以及精氨酸的流量也相应提高 其 中目的产物谷氨酰胺由 18 138上升至 31 065 最为明显 原因 有二 一是前提物质谷氨酸流量增加 势必引起 L 谷氨酰胺 的流量增加 二是因为选育 NH4 2SO4R 突变株能遗传性地解 除NH 4 对谷氨酰胺合成酶 GS 合成的阻遏 酶活的提高直接 使谷氨酸向谷氨酰胺的转化率提高 2 4 3 天冬氨酸 ASP 节点的流量分析 天冬氨酸族氨基酸虽处于谷氨酰胺合成途径下游和谷氨 酰胺合成不直接相关 但由于天冬氨酸族氨基酸产量相当高 TCA 循环中的流量大量流向天冬氨酸节点 不但分担了流向 谷氨酸节点的流量 还消弱了TCA 循环 对谷氨酰胺合成非常 不利 所以下一步设计代谢也应该把天冬氨酸节点考虑进来 3 讨论 国外应用代谢流分析的方法十分广泛 多使用电脑模拟 代谢网络模型 Joungmin Lee 16 等采用电脑模拟的丁醇梭菌 ATCC 824 代谢网络模型进行全基因组代谢流分析 检验单基 因敲除对丁醇产生的影响 利用代谢流分析的方法指导基因 操作 R Montanez 17 等使用电脑模型进行精氨酸分解的代谢 通量控制分析 通过模拟改变精氨酸浓度和其它控制参数 用 以分析转运载体和相关酶系在不同参数条件下对精氨酸分解 产生 NO 和多胺产生中的作用变化 国内代谢流分析主要还 是应用于氨基酸代谢调控分析和有机酸代谢的分析中 杨艳 等 18 利用代谢流分析的方法分析氮饥饿对谷氨酰胺产生菌 NS611的影响 证实氮饥饿对谷氨酰胺合成酶活性提高有作 用 天津科技大学的杜军等 19 利用代谢流分析的方法进行过 程优化 显著提高了谷氨酸的产率 黄佳良等 20 基于 Petri 网 理论构建生物代谢网络模型 提出一种新的采用不等式的代 谢流分析方法 新分析方法在前提假设和分析性能两方面均 比采用方程式的传统方法明显优越 允许数据有一定误差 还 可以进行代谢流分裂比分析 敏感性分析 使代谢流分析应用 更为深入 此外 代谢流分析的方法在柠檬酸 乳酸 酒精以及 核苷酸发酵分析中也多有应用 本文建立并完善了嗜乙酰乙酸棒杆菌 YL012 及其突变株 LCHA0082 合成L 谷氨酰胺的中心代谢网 证明育种对改变 代谢流量分配有很好的效果 但从代谢谱图也可以发现突变 株 LCHA0082 流量分布仍有些分散 可以对该菌下一步选育高 产菌提出如下育种策略 1 有机杂酸和其它杂氨基酸占代谢流量的比例非常大 对于突变株 LCHA0082 占总流量的 65 左右 占比例较大的 主要有有机杂酸即乳酸和乙酸 天冬氨酸族氨基酸 主要是赖 氨酸和异亮氨酸 以及谷氨酸族中的精氨酸和脯氨酸 有机 杂酸的消除主要在于溶氧水平的调节 其它非目的氨基酸的 减弱可以采取筛选营养缺陷型或适当添加相应氨基酸的方 法 2 谷氨酸向谷氨酰胺的转化也是关键 调节谷氨酰胺 合成酶 GS 是最有效的方法 可以通过以下几个方法 一 添 加酶的诱导剂 二 对氮源进行补料发酵 减少 NH 4对谷氨酰 胺合成酶合成的的阻遏作用 三 进一步筛选 L 谷氨酰胺的 结构类似物 6 重氮 5 氧代 正亮氨酸抗性 DON 8 氮 鸟嘌呤 8 AG 的抗性菌株 提高酶活 3 进一步加强 EMP 途径和 TCA 循环中丙酮酸到A 酮 戊二酸的途径 进一步提高 EMP 途径的通量 如抑制 6 磷 酸葡萄糖脱氢酶活性从而达到削弱 HMP 途径的目的 加强丙 酮酸到A 酮戊二酸的流量 选育耐高糖浓度的能力菌株 也 可继续选育以琥珀酸 Suc 为惟一碳源的突变株提高菌株对 CO2的固定能力 同时削弱 A 酮戊二酸向琥珀酸进一步代 谢 可考虑添加某些表面活性剂等达到削弱此途径不影响A 酮戊二酸生成的目的 参考文献 1 汤亚杰 张伟 李红梅 等 发酵法生产 L 谷氨酰胺研究进展 J 食品科学 2008 29 3 499 503 2 丁邦琴 邱鑫 周烽 L 谷氨酰胺生化性质 用途及生产方法概述 J 氨基酸和生物资源 2008 30 4 42 45 3 Shu liang Li Chun Li Yuan shuai Liu Separation of L glutamine from fermentation broth by nanofiltration J Journal of Membrane Science 2003 222 191 201 4 Yan ling Yang Study on L Glutamine Fermentation J Food Science 2005 26 7 122 124 5 贾秀红 韩琳 谷氨酰胺的临床应用 J 滨州医学院学报 2008 31 5 368 370 66 生 物 技 术 2009年 19 4 6 邓丽静 周琰 复方谷氨酰胺在危重患者肠内营养中的作用 J 四 川医学 2008 29 9 1124 1125 7 Bonarius HPJ Schmid G Tramper J Flux analysis of underdetermined metabolic networks the quest for the missing constrains J Trends Biotechn ol 1997 15 308 314 8 朱进伟 青山 张伟国 L 精氨酸生物合成的代谢流量分析 J 微 生物学通报 2008 35 3 395 401 9 Wolfgang W 13C Metabolic Flux Analysis J Metabolic Engineering 2001 3 195 206 10 Lee K Berthiaume F Stephanopoulos GN et al Metabolic flux analysis a powerful tool for monitoring tissue function J Tissue Eng 1999 5 4 347 368 11 Stephanopoulos GN Aristidou A A Nielsen J Metabolic Engineering M New York Academic Press 1998 105 132 12 左爱连 张伟国 L 丝氨酸高产菌的选育及其发酵条件 J 化工 进展 2008 27 9 1408 1411 13 无锡轻工业学院 大连轻工业学院 天津轻工业学院 等 工业发 酵分析 M 北京 中国轻工业出版社 1980 6 22 14 Serpil Takac Giizide Calik Metabolic flux distribution for the optimized production of L giutamate J Enzyme and Microbial Technology 1998 23 286 300 15 Gregory N Stephanopoulos Aristos A Aristidou Jens Nielsen Metabolic engineering principles and methodologies M San Diego Acadeemic Press 1998 16 Joungmin Lee Hongseok Yun Adam M Feist Genome scale reconstruc tion and in silico analysis of the Clostridium acetobutylicum ATCC824metabolic network J Appl Microbiol Biotechnol 2008 80 849 862 17 R Montanez C Rodr uez Caso F Sanchez Jimenez et al In silico analysis of arginine catabolism as a source of nitric oxide or polyamines in endo thelial cells J Amino Acids 2008 34 223 229 18 杨艳 陈奎发 李春 谷氨酰胺产生菌 NS611 的代谢流分析 J 无 锡轻工业大学学报 2003 22 2 38 43 19 杜军 陈宁 刘辉 基于代谢流量分析的 L 谷氨酸发酵过程优化 J 中国食品学报 2008 8 2 30 35 20 黄佳良 孟春 郭红 一种基于Petri 网的代谢流分析方法 J 计算 机与应用化学 2008 25 1 77 80 交联壳聚糖微球固定化 B 葡萄糖苷酶工艺研究 王秀征 1 徐清2 倪邦庆1 1 江南大学化学与材料工程学院 江苏 无锡 214122 2 诺维信中国投资有限公司 北京 100085 摘要 目的 以戊二醛交联壳聚糖微球为载体 通过共价连接反应固定化 B 葡萄糖苷酶 方法 以固定化酶比活和酶活回 收率为目标 采用单因素方法优化固定化工艺 微球制备条件 结果 微球最佳制备条件 2 5 壳聚糖 2 乙酸 7 5 氢氧化 钠 氢氧化钠 乙醇 vPv 1B1 最佳固定化工艺为 0 1g 壳聚糖微球在 20mL 3 戊二醛溶液中 50e 交联 2h 加酶量为 7 388mU Pg干球 25e 吸附 24h 固定化酶比活为6 188mUP g干球 酶活回收率为 95 4 结论 交联壳聚糖微球共价连接法可有效 固定化 B 葡萄糖苷酶 关键词 交联 壳聚糖 固定化 B 葡萄糖苷酶 中图分类号 Q814 2 文献标识码 A 文章编号 1004 311X 2009 04 0067 04 Study of the Immobilization of B Glucosidase onto Cross linked Chitosan Microsphere WANG Xiu zheng 1 XV Qing2 NI Bang qing1 1 School of Chemical and Material Engineering Jiangnan University Wuxi 214122 China 2 Novozymes China Inveslment Co Ltd China Headquarters Beijing 100085 China Abstract Objective To optimize the immobilization of B Glucosidase onto chitosan microsphere with glutaraldehyde Method Using activity of immobilized enzyme and activity recovery as response value the effects of immobilization conditions and preparation conditions of cross linked chitosan microsphere on immobilizationwere studied Result The optimal preparation conditions of chitosan microsphere were 2 5 chitosan 2 acetic acid 7 5 NaOH the ratio of NaOH and ethonal v Pv 1B1 The optimal immobilization conditionswere as following 0 1g wet ch itosan microsphere