耳蜗毛细胞氧化损伤microRNA与mRNA表达谱.pdf

南方医科大学2 0 0 7 级博士学位论文 耳蜗毛细胞氧化损伤m i c r o R N A 与m R N A 表达谱 及其调控网络研究 I n t e g r a t i n gm i c r o R N A a n dm R N A e x p r e s s i o np r o f i l e so f c o c h l e ah a i rc e l l sr e s p o n s et oo x i d a t i v es t r e s st oi d e n t i f y r e g u l a t o r yn e t w o r k s 课题来源 国家自然科学基金项目 3 0 9 7 1 1 9 3 广东省自然科学基金项目 7 0 1 8 6 3 5 广州市医药卫生科技重点项目 2 0 0 9 Z D i 0 7 广州市医药卫生科技重点项目 2 0 0 6 Z D i 0 6 专业名称 学位申请人 指导教师 答辩委员会主席 答辩委员会成员 劳动卫生与环境卫生学 王致 邹飞教授 蒋义国教授 刘移民主任医师 董军教授 余日安教授 毛丽梅教授 论文评阅人邹剑明主任医师 杨爱初主任医师 张维森主任医师 2 0 1 0 年5 月2 6 日广州 卜 f 舢删 7 删埘删埘M 册删 Y 17 7 0 4 5 7 博士学位论文 耳蜗毛细胞氧化损伤m i c r o R N A 与m R N A 表达谱及其调控网络研究 博士研究生 王致 指导教师 邹飞教授 摘要 背景 氧化损伤和活性氧 也称氧自由基 R e a c t i v eO x y g e nS p e c i e s R O S 与药 物性耳聋 噪声性耳聋 以及老龄性耳聋密切相关 顺铂 氨基糖甙类药物和 持续的噪声均可使耳蜗毛细胞产生高浓度的R O S 而导致毛细胞损伤 此外 抗 氧化剂有助于耳蜗毛细胞的存活及维持其正常功能 已有研究表明R O S 可以调 节基因转录水平的表达 庆大霉素和顺铂可通过产生高浓度的R O S 而调节耳蜗 毛细胞中基因的转录 以及氧化损伤相关的信号转导通路 然而 转录后调控 在基因表达和细胞存活中起着重要的作用 仅有研究发现在心肌细胞和血管平 滑肌细胞中R O S 可以通过转录后调控影响基因的表达 但未见有关耳蜗毛细胞 氧化损伤相关的基因转录后调控方面的报道 因此 探寻R O S 对耳蜗毛细胞基 因转录后的调控及其调控机制 对于阐明耳蜗毛细胞氧化损伤的机制具有重要 意义 M i e r o R N A s m i R N A s 是一种内源的 非编码的小R N A 可通过对靶基 因m R N A s 的降解作用和翻译抑制作用而负向调控基因的表达 一种m i R N A 可 调控多个靶基因 而若干m i R N A s 也可协同作用于一个靶基因 从而调控细胞 的分化 增殖 生长 迁移和凋亡 M i R N A s 在小鼠内耳感觉上皮的发育和成熟 过程中具有重要作用 也是听力损失的重要调控因素 最近的研究显示m i R N A 异常可能是人类和小鼠进行性听力损失的病因 然而未见有关耳蜗毛细胞氧化 损伤相关的m i R N A 表达及其在基因调控方面的报道 因此 研究耳蜗毛细胞 中文摘要 氧化损伤和高浓度R O S 对m i R N A s 表达的影响 以及m i R N A s 在R O S 介导的 基因调控中的作用及其生物功能 将对深入了解耳蜗毛细胞损伤和听力损失的 机制具有重要意义 研究目的 1 利用有机氧化剂叔丁基过氧化氢 t e r t B u t y lH y d r o p e r o x i d e t s I W 染毒 耳蜗毛细胞 H o u s eE a rI n s t i t u e O r g a no fC o r t i1 H E I O C1 通过检测t B H P 对 细胞增殖 细胞凋亡和R O S 产生的影响 建立耳蜗毛细胞氧化损伤模型 2 通过m i R N A 表达芯片和全基因组m R N A 表达芯片检测 研究耳蜗毛 细胞氧化损伤m i R N A 和m R N A 表达谱 3 通过生物信息学分析耳蜗毛细胞氧化损伤差异表达m i R N A 与m R N A 研究耳蜗毛细胞氧化损伤m i R N A 与m R N A 表达调控网络及其生物功能 为耳 蜗毛细胞氧化损伤的基因表达及其转录后调节提供更直接的科学线索 研究方法 1 细胞增殖检测H E I O C l 细胞经t B H P 0 2 5 州 5 0 州 1 0 0t t M 2 0 00 M 4 0 0 州 染毒1 2 h 以及1 0 0 1 u Mt B H P 染毒o h 3 h 6 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h 后 分别用C e l lC o u n t i n gK i t 8 C C K 8 检测不同浓度和不同时间t B H P 染毒后细胞增殖能力的改变 2 细胞凋亡检测H E I O C I 细胞经t B H P 0 州 2 5v M 5 0v M 1 0 0 州 2 0 0 州 4 0 0v M 染毒1 2 h 用膜联蛋白V A n n e x i nV 与碘化丙啶 P r o p i d i u m I o d i d e P I 双标记后 通过流式细胞术检测不同浓度t B H P 染毒对H E I O C I 细 胞凋亡的影响 3 胞内R O S 检测设置0 州 2 5r t M 5 0 州 1 0 0 2 0 0r t M 4 0 0 小 6 个浓度t B H P 染毒H E I O C l 细胞组 经D C F H D A 探针标记后 通过荧光倒 置显微镜观察胞内R O S 生成情况 并用流式细胞术定量检测胞内R O S 水平 4 m i c r o R N A 芯片检测H E I O C l 细胞经0r t M 5 0 州 1 0 0 州 2 0 0 州 博士学位论文 t B H P 染毒1 2 h 后 利用E x i q o nL N A 探针标记细胞总R N A 经浓缩 杂交 图 像扫描后 分析耳蜗毛细胞氧化损伤m i R N A 表达谱 全基因组表达谱芯片检测H E I O C l 细胞经0 州 5 0 州 1 0 0p M 2 0 0 p Mt B l i P 染毒1 2 h 后 利用A g i l e n t4 x 4 4 K 小鼠全基因组表达谱芯片检测细胞 氧化损伤后m R N A 表达谱 6 实时定量R T P C R 检测m i R N A 和m R N A 表达t B H P 0p M 5 0 洲 1 0 0p M 2 0 0p M 染毒H E I O C l 细胞1 2 h 后 利用实时定量R T P C R 检测各浓 度t B H P 染毒组细胞中m m u m i R 2 9 a m m u m i R 2 0 3 C C N D 2 A T F 7 I P 的表达 水平 并分别以U 6 和G A P D H 为内参 用2 以 c T 法进行相对定量 7 生物信息学分析通过T a r g e t s c a n5 1 预测耳蜗毛细胞氧化损伤差异表 达m i R N A 的靶基因 并结合差异表达m R N A 进行整合分析 通过O s p r e y1 2 0 构建m i R N A 与m R N A 调控网络 并利用D A V I D 对差异表达m i R N A 调控的表 达上调 和下调 的靶基因进行G O 分析和P a t h w a y 分析 8 统计分析所有实验结果以均数士标准差 X4 S D 表示 并根据实验数 据的性质利用S P S S l 6 0 软件进行方差分析 P 0 0 5 为有显著性差异 研究结果 1 t B H P 对耳蜗毛细胞增殖能力的影响不同浓度t B H P 对H E I O C l 细 胞染毒1 2 h 后各组细胞生长变化率有统计学差异 F 7 9 4 4 5 P 0 0 0 1 且2 5 州 以上浓度的t B H P 染毒1 2 h 后可抑制H E I O C l 细胞的增殖 P 0 0 5 1 0 0 1 x M t B H P 染毒H E I O C l 细胞不同时间后各组细胞生长变化率有统计学差异 F 1 6 0 5 6 P 0 0 0 1 且1 0 0p Mt B H P 染毒H E I O C l 细胞6 h 以上可抑制细 胞增殖 尸 0 0 1 2 t B H P 对耳蜗毛细胞凋亡的影响各浓度t B H P 组早期细胞凋亡率无统 计学差异 庐1 4 1 6 4 2 8 7 各浓度t B H P 组细胞凋亡率有统计学差异 庐8 3 7 2 P 0 0 0 1 5 0p M 以上浓度t B H P 致H E I O C l 细胞凋亡率增高 尸 m 中文摘要 0 0 5 且主要为晚期细胞凋亡 P 0 0 5 的增加所致 3 t B H P 对耳蜗毛细胞胞内R O S 水平的影响荧光显微镜下可见R O S 分 布于胞内 不同浓度t B H P 染毒组间细胞内荧光有极大差别 流式细胞术定量 检测胞内R O S 结果显示 各浓度t B l i P 组荧光细胞率有统计学差异 F 3 4 7 8 9 7 P 0 0 0 1 未染毒对照组荧光细胞仅为3 4 5 2 5 州t B H P 组荧光细胞为 4 2 6 P 0 6 51 5 0t t Mt B H P 组荧光细胞为7 5 9 P 0 0 5 10 0 州 2 0 0 t t M 4 0 0 州t B H P 组荧光细胞增多 尸 O 0 0 1 分别为1 7 2 6 2 7 9 0 5 9 8 5 以上结果表明5 0 山以上浓度t B H P 可致H E I O C l 细胞氧化损伤 并致胞 内R O S 生成量明显增多 4 耳蜗毛细胞氧化损伤m i c r o R N A 表达谱以0p Mt B l i P 作为对照组 5 0t t M 1 0 0t t M 2 0 0 州t B H P 染毒组共有4 0 个m i R N A 表达上调 3 5 个m i R N A 表达下调 相比未染毒对照组 5 0 州t B H P 组有2 1 个m i R N A 表达上调 3 0 个m i R N A 表达下调 1 0 0t t Mt B H P 组有1 9 个m i R N A 表达上调 1 7 个m i R N A 表达下调 2 0 0 州t B H P 组有2 1 个m i R N A 表达上调 3 3 个m i R N A 表达下调 5 耳蜗毛细胞氧化损伤全基因组m R N A 表达谱 以0p Mt B H P 作为对 照组 5 0t t M 1 0 0 州 2 0 0 州t B H P 染毒组共有2 0 7 6 个m R N A 表达上调 5 8 0 个m R N A 表达下调 相比未染毒对照组 5 0t t Mt B H P 组有6 2 个m R N A 表达上调 2 6 个m R N A 表达下调 1 0 0 州t B H P 组有1 8 0 3 个m R N A 表达上 调 2 9 8 个m R N A 表达下调 2 0 0 州t B H P 组有5 3 3 个m R N A 表达上调 3 6 7 个m R N A 表达下调 6 实时定量R T P C R 验证m i R N A 和m R N A 芯片结果经实时定量 R T P C R 检测 2 0 0 州t B H P 组m m u m i R 2 9 a 表达上调 尸 0 0 5 1 0 0t t M 2 0 0 洲t B H P 组m m u m i R 2 0 3 表达下调 P 0 0 5 1 0 0 州 2 0 0 州t B H P 组 A r F 7 I P 表达上调 P 0 0 1 5 0 州 1 0 0 州 2 0 0 州t B H P 组C C N D 2 表达 下调 P 0 0 0 1 与m i R N A 和m R N A 表达芯片检测结果基本一致 表明m i R N A 和m R N A 芯片实验结果可信 I V 博士学位论文 7 耳蜗毛细胞氧化损伤m i R N A 与m R N A 调控网络分析各浓度t B H P 组差异表达m i R N A 靶基因筛选结果表明 5 0b t Mt B H P 染毒H E I O C l 细胞组 中3 个表达上调的m i R N A 有5 个表达下调的靶基因 4 个表达下调的m i R N A 有4 个表达上调的靶基因 1 0 0p Mt B H P 染毒H E I O C l 细胞组中5 个表达上 调的m i R N A 有2 0 个表达下调的靶基因 8 个表达下调的m i R N A 有1 2 1 个表达 上调的靶基因 2 0 0p Mt B H P 染毒H E I O C I 细胞组中8 个表达上调的m i R N A 有6 3 个表达下调的靶基因 1 1 个表达下调的m i R N A 有6 5 个表达上调的靶基 因 整合3 个浓度t B H P 染毒H E I O C l 细胞差异表达m i R N A 靶基因筛选结果 表明1 1 个表达上调的m i R N A 有8 1 个表达下调的靶基因 1 5 个表达下调的 m i R N A 有1 8 0 个表达上调的靶基因 8 G O 分析和P a t h w a y 分析G O 分析结果显示 受下调m i R N A 调控的 表达上调的1 8 0 个靶基因属9 7 个G O B i o l o g i c a lP r o c e s s 分类 其中 c e l l u l a r p r o c e s s 分类中基因数最多 为1 0 5 个基因 受上调m i R N A 调控的表达下调 的8 1 个靶基因属1 5 3 个G O B i o l o g i c a lP r o c e s s 分类 其中 r e g u l a t i o no f b i o l o g i c a lp r o c e s s 和 b i o l o g i c a lr e g u l a t i o n 分类中基因数最多 均为4 2 个基 因 P a t h w a y 分析结果显示 受下调m i R N A 调控的表达上调的1 8 0 个靶基因属 6 个P a t h w a y 分类 受上调m i R N A 调控的表达下调的8 1 个靶基因属1 4 个 P a t h w a y 分类 结论 1 5 0g M 以上浓度的t B H P 染毒H E I O C l 细胞1 2 h 后可抑制细胞增殖 诱 导细胞凋亡率增高 并致胞内R O S 生成增多 从而确定了通过5 0g M 1 0 0p M 2 0 0 肚Mt B H P 染毒H E I O C l 细胞1 2 h 建立轻 中 重度的耳蜗毛细胞氧化损 伤模型 2 相比未染毒对照组 5 0g M 1 0 0 g M 2 0 0g Mt B H P 染毒H E I O C l 细 胞组共有4 0 个m i R N A 表达上调 3 5 个m i R N A 表达下调 共有2 0 7 6 个m R N A 表达上调 5 8 0 个m R N A 表达下调 构建出耳蜗毛细胞氧化损伤m i R N A 和m R N A V 中文摘要 表达谱 3 生物信息学整合分析表明 耳蜗毛细胞氧化损伤中1 1 个表达上调的 m i R N A 有8 1 个表达下调的靶基因 属9 7 个G O B i o l o g i c a lP r o c e s s 分类 6 个P a t h w a y 分类 1 5 个表达下调的m i R N A 有1 8 0 个表达上调的靶基因 属1 5 3 个G O B i o l o g i c a lP r o c e s s 分类 1 4 个P a t h w a y 分类 明确了耳蜗毛细胞氧化 损伤m i R N A 与m R N A 调控网络及其生物功能 关键词 耳蜗毛细胞氧化损伤活性氧微小R N A 表达谱微阵列芯片 V I 博士学位论文 I n t e g r a t i n g m i c r o R N Aa n dm R N A D p r o f i l e s c o c h l e ahair llsexr e s s l o nO r o l i l e so lC O C I I l e aI I a l rC e l l sD r e s p o n s e t oo x i d a t i v es t r e s st oi d e n t i f y r e g u l a t o r yn e t w o r k s N a m e Z h i W a n g S u p e r v i s o r P r o f F e iZ o u A BS T R A C T B a c k g r o u n d O x i d a t i v es t r e s sa n dh i g hl e v e l so fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s R O S a r e a s s o c i a t e d 诵t 1 1t h ed r u g a n dn o i s e i n d u c e d a n da g e r e l a t e dh e a r i n gi n j u r ya n dl o s s C i s p l a t i n a m i n o g l y c o s i d e sa n dc o n t i n u a ln o i s eC a np r o m o t eh i g hl e v e l so fR O S p r o d u c t i o ni nh a i rc e l l s F u r t h e r m o r e i n c r e a s e dl e v e l so fa n t i o x i d a n t ss u p p o r t h a i r c e l ls u r v i v a la n df u n c t i o n P r e v i O t i ss t u d i e sh a v er e v e a l e dt h a th i g hl e v e l so fR O S r e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fe p i g e n e t i ca n dt r a n s c r i p t i o n a lf a c t o r s G e n t a m i c i na n d c i s p l a t i nc a np r o m o t eh i g hl e v e l so fR O Sp r o d u c t i o na n dm o d u l a t et h et r a n s c r i p t i o n o fal a r g en u m b e ro fg e n e si na u d i t o r yh a i rc e l l s E x p o s u r eo fa u d i t o r yc e l l st oR O S m o d u l a t e st h ea c t i v a t i o na n ds i g n a lt r a n s d u c t i o no fo x i d a t i o n s e n s i t i v es i g n a l p a t h w a y s G i v e nt h a tp o s t t r a n s c f i p t i o n a lr e g u l a t i o ni sc r u c i a lf o rg e n ee x p r e s s i o n a n dc e l ls u r v i v a l t h e r ea r eo n l yaf e ws t u d i e so ft h eR O S r e l a t e dg e n ee x p r e s s i o na t t h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e l b u tn os t u d yo na u d i t o r yc e l l s H e n c e d i s c o v e r yo ft h e p a t h w a y si n v o l v e di nt h ep a t h o g e n e s i so fR O S r e l a t e dh a i rc e l lc y t o t o x i c i t ya n d i l l u s t r a t i o no fm o l e c u l a rr e g u l a t o r so ft h ep a t h o g e n i cp r o c e s sw i l lb eo fg r e a t s i g n i f i c a n c e A B S T R A C T M i c r o R N A s m i R N A s a l ee n d o g e n o u s s m a l l n o n c x x i i n gR N A st h a tc a n n e g a t i v e l yr e g u l a t eg e n ee x p r e s s i o nb yd e g r a d a t i o na n dt r a n s l a t i o n a li n h i b i t i o no f t h e i rt a r g e tm R N A s A ni n d i v i d u a lm i R N Ac a nr e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fi t s m u l t i p l et a r g e tg e n e s a n ds e v e r a lm i R N A sc 锄a l s os y n e r g i s t i c a l l ya c to no n et a r g e t g e n e r e g u l a t i n gc e l ld i f f e r e n t i a t i o n p r o l i f e r a t i o n g r o w t h m o b i l i t y a n da p o p t o s i s M i R N A sa l s op l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ed e v e l o p m e n ta n dm a t u r a t i o no fs e n s o r y e p i t h e l i ai nm o u s ei n n e re a r a n dm a yb ep i v o t a lr e g u l a t o r so ft h ep r o c e s so fh e a r i n g l o s s R e c e n ts t u d i e sh a v es h o w nt h a tam u t a t i o ni nm i R N A m a yb ea c a u s a t i v ef a c t o r f o rt h ed e v e l o p m e n to fp r o g r e s s i v eh e a r i n gl o s si nh u m a n sa n dm i c e H o w e v e r t h e e f f e c t so fo x i d a t i v es t r e s sa n dh i i g hl e v e l so fR O So nt h ee x p r e s s i o no fm i R N A sa n d t h e i rp o t e n t i a lr o l e si n t h eR O S m e d i a t e dg e n er e g u l a t i o na n db i o l o g i c a lf u n c t i o n si n a u d i t o r yc e l l sh a v en o tb e e ne x p l o r e d F u r t h e r m o r e l i t t l ei sk n o w na b o u th o wt h e e x p r e s s i o np r o f i l e so fm i R N A s a n dm R N A sc o n t r i b u t et ot h er e g u l a t o r yn e t w o r k si n t h eR O S r e l a t e da u d i t o r yc e l li n j u r ya n dd e a t h o b j e e t 1 T h i ss t u d ya i m e da td e t e r m i n i n gt h ee f f e c t so ft r e a t m e n t 埘mt e r t b u t y l h y d r o p e r o x i d e t B LI P o nt h ep r o d u c t i o no fR O S a p o p t o s i s a n dt h es u r v i v a lo f H o u s eE a rI n s t i t u t e O r g a no fC o r t iI 脏I o c oc e i l s E s t a b l i s h e do x i d a t i v ed a m a g e m o d e lo fc o c h l e ah a i rc e l l s 2 C h a r a c t e r i z i n gt h eR O S r e l a t e de x p r e s s i o no fm i R N A sa n dm R N A si n H E I O C lc e l l si nv i t r o 3 F u r t h e r m o r e w ea n a l y z e d t h e p o t e n t i a l i n t e r a c t i o no fd i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e dm i R N A sw i mt h et a r g e t e dm R N A si nt h ep r o c e s so fR O S i n d u c e d a u d i t o r yc e l l s H e n c e o u rf i n d i n g sm a yp r o v i d en e wi n s i g h t si n t ou n d e r s t a n d i n gt h e r e g u l a t i o no fm i R N A so nt h eo x i d a t i v es t r e s s r e l a t e da u d i t o r yc e l li n j u r ya n dd e a t h 博士学位论文 M e t h o d s 1 C e l lv i a b i l i t ya s s a y T h ev i a b i l i t yo fH E I O C lc e l l sr e s p o n d i n gt ot B H P t r e a t m e n tw a sm e a s u r e du s m gC e l lC o u n t i n gK i t 8 C C K 8 a c c o r d i n gt ot h e m a n u f a c t u r e r Si n s t r u c t i o n B r i e f l y c e l l sw e r et r e a t e d I r i t l ld i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s 0 2 5 5 0 1 0 0 2 0 0 o r4 0 0p M o f t B H Pf o r1 2h a n de x p o s e dt oC C K 8 f o l l o w e d b ym e a s u r i n ga t4 5 0B i no n am i c r o p l a t er e a d e r A d d i t i o n a l l y t h ec e l l sw e r et r e a t e d 诵t l l1 0 0 Mo f t B H Pf o rv a r y i n gp e r i o d s o 3 6 1 2 2 4a n d4 8 2 M e a s u r e m e n t so fa p o p t o s i s T h et B H P i n d u c e dH E I O C lc e l la p o p t o s i s W a s a n a l y z e db yF A C Sa n a l y s i su s m gt h eF I T CA n n e x i nVA p o p t o s i sD e t e c t i o nK i t I a c c o r d i n gt ot h ei n s t r u c t i o n sf r o mt h em a n u f a c t u r e r B r i e f l y H E I O C1c e l l sw e r e t r e a t e dw i t ht B H P O 2 5 5 0 10 0 2 0 0 o r4 0 0p M f o r1 2h S u b s e q u e n t l y t h ec e l l s w e r es t a i n e d 诵t l lF I T C A n n e x i nVa n dP I a n de x a m i n e db yF A C Sa n a l y s i so na B e c t o nD i c k i n s o nF A C S c a nf l o wc y t o m e t e r 3 D e t e 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