小鼠中脑多巴胺神经元发育的机制.doc

成绩 中国农业大学 课程论文（2011-2012学年秋季学期） 论文题目： 小鼠中脑多巴胺神经元发育起源 及命运决定 课程名称： 发育生物学 任课教师： 周波 班级： 生化082 学号： 0807090106 姓名： 贾晓波 小鼠中脑多巴胺能神经元发育起源及命运决定的分子机制贾晓波（生物学院 生化082 0807090106）摘要 中脑多巴胺能神经元在哺乳动物中枢神经系统中有着极其重要的生理功能，其功能包括随意运动、认知、情感及奖赏等方面，多巴胺能神经元的特异性缺失将会造成巨大的损害，其中就包括帕金森症。一方面明确多巴胺能神经元的发育及起源的分子机制对于了解神经递质系统是一件重要的工作，另一方面，还可以为这些多巴胺能神经元缺失的疾病的治疗带来福音。关键词 胚胎发育；中脑；转录因子；命运决定1中枢神经系统中的多巴胺能神经元中枢神经系统递质表型的发育是大脑形成完整的、具有正常生理功能神经环路过程中的重要一环。中枢神经系统包括大量形态不同、类型各异的神经元，同时它们所产生和释放的神经递质也有所不同，在一定程度上决定了神经系统功能的多样性和复杂性，最终导致了神奇的神经系统功能。多巴胺（dopamine，DA）是儿茶酚胺类神经递质之一，它在哺乳动物中枢神经系统中有着极其重要的生理功能，包括运动的整合、神经内分泌激素释放的调节、认知、情感、奖赏、意识和记忆。特异性分泌多巴胺神经递质的神经元成为DA神经元。多巴胺能神经元主要源自中脑。在小鼠的中脑，有3个DA神经元的核群：黑质（substantia nigra，SN）致密带（A9，有近10000个DA神经元）、腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA，A10，有近25000个DA神经元）和红核后区（retrorubral field ，RRF，A8）。其他的DA神经元群分布于视丘下部的中间未定带（medial zona incerta）（A13，有近900个DA神经元）等。位于黑质区的DA神经元发出的上行纤维投射至纹状体（尾核及壳核；中脑纹状体通路，mesostriatal pathway）释放DA，其退行性病变可造成纹状体内多巴胺释放量的减少，因而成为帕金森症（Parkinsonsdisease，PD）运动障碍产生的直接原因。腹侧被盖区内DA神经元集中投射至伏隔核的边缘叶（中脑边缘叶通路，mesolimbic pathway），它的过度活跃则与精神分裂症和药物成瘾有关。黑质和红核去DA神经元投射至大脑前额叶皮层的通路则与情绪和动机有关，而中间未定带的DA神经元则参与调节内分泌的过程。了解中脑DA神经元的起源与发育过程，将对PD等DA神经元退行性疾病的治疗带来新的曙光。2中脑发育：中脑和后脑组织结构形成神经元命运的决定和分化是一个级联过程，目前认为，首先是神经前体细胞产生神经元前体细胞和胶质前体细胞，前者有在不同诱导信号的作用下，分化成各种递质表型的神经元类型，不同类群的神经元在位置信号的诱导下沿着神经管的背腹轴和前后轴的精确排布并各自特化和分化。DA神经元发源于腹侧神经管与底板的相连处，当小鼠胚龄为E8.5E10.5时，一组DA神经前体细胞在中脑后端的区域内增殖，最后这些细胞逐渐退出细胞周期，接受和相应各种早期发育信号，并迁移至中脑前端（小鼠中E10.5E12.5），然后逐步分化为成熟的DA神经元表型，生长出轴突与树突，并与靶区形成一系列链接，这个过程可以从E12.5一直持续到出生时。当DA神经元表达分子标记物酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）时，表示其递质表型分化成熟。E14以后DA神经元的投射逐步建立、成熟并形成神经环路。 2.1组织中心区的发育神经管区室化时期是中脑DA神经元发育的关键时期之一，在该时期中脑和后脑组织结构形成（mesencephalic region，MMR），在中脑和后脑交界处（mesencephalic boundary，MMB）的局部组织被成为组织中心区（isthmus organizer，Iso），该区是隔离中后脑的边界，更重要的是，它同时又是指导中后脑发育的信号集中地。再次中心区分泌出的信号分子和神经管底板分泌出的信号分子共同作用，可使一部分神经前体细胞变成DA神经元前体细胞，走向DA神经元分化之路。来自遗传学的证据表明，Iso的形成与一系列调控步骤密切相关。追溯到胚胎中后脑泡的形成过程中，E8表达的同源框转录因子（homebox transcription factor）OTX2和GBX2参与限制中后脑组织结构形成，OTX2表达在中脑而GBX2表达在后脑，它们相互影响，决定了中后脑的边界并形成组织中心区（Iso），OTX2及GBX2的突变小鼠直接证明了这点，OTX2敲除的小鼠缺乏前脑及中脑，GBX2敲除的小鼠则后脑前端发育缺失且中脑后端扩展。特别是OTX2，它可能在中脑早期命运决定中起作用，而且调节Shh（sonic hedegehog）与FGF8（fibroblast growth factor-8）在Iso附近的表达，2008年Omodei等的研究显示OTX2还能特异性的促进DA神经元的增殖。Iso的起始形成还与形态发生原FGF8密切相关。 已有实验表明，早期分泌因子Wnt1（表达起始于E8）表达与中脑和Iso区，它是中脑和Iso形成所需要的，Wnt1基因敲除导致小鼠中脑、后脑和Iso组织结构缺失。由此可见，Wnt1对于中脑的发育起着非常重要的作用，并且Wnt1表达的时辰与Shh和FGF8相近，但是与FGF8不同的是，Wnt1并无独立诱导出中后脑结构的能力，但是却能诱导并维持FGF8在Iso的表达，研究表明，分泌因子Wnt3a和Wnt5a在DA神经元的发育中发挥作用，Wnt3a可以促进DA神经前体细胞增殖，但不能增加TH阳性细胞数，而Wnt5a可以增加DA前体细胞分化成DA神经元表型的细胞数。 2.2多巴胺能神经元的诱导 形成Iso之后，来自底板及顶板的信号将中脑与间脑分为背腹两侧，各有其不同的发育信号级联。研究表明，两个重要的分泌信号分子对DA神经元的产生起关键作用，即表达在神经管腹侧的Shh和定位于组织中心区的FGF-8。在胚胎早期（E7E8.5），FGF8与Shh就已开始表达，而到E13左右终止表达，两者的联合作用可以在神经管的多个区域诱导出DA神经元，为DA神经元早期发育所必须。在Shh存在时，异位表达FGF8可以诱导出中后脑结构，FGF8基因敲除的小鼠则缺失大部分的中后脑组织，因而无法形成DA神经元。2009年，Joksimovic等发现Wnt和Shh信号的相互作用来决定中脑和后脑底板细胞的增殖，Shh的作用为抑制DA神经前体细胞的增殖和神经发生，而Wnt信号通路则是拮抗Shh作用促进DA神经元生成的充分必要条件。多种转录因子在不同时空对DA神经元的发育起不同作用。转录因子在DA神经元发育过程中的表达有着明显的时序性。早期出现的转录因子对中后脑细胞的存活、组织结构的维持和细胞命运的决定起关键作用，而在中后脑早期表达的转录因子（E8E9）除OTX2和GBX2以外，还有同源框转录因子En1、En2、Lmx1b、含配对盒的转录因子Pax2、Pax5、Pax8（E7.5E8.5）。它们表达区域多数重叠，在中脑与后脑都有表达。Pax2是最早表达的基因，En1和Wnt1紧接着也开始出现，随后Pax5和En2表达，Pax8最后一个出现，这是Pax2的表达区域已经被非常特异的限制在中后脑交界处。2007年 Ferri等证明了Foxa1、Foxa2参与了DA神经元发育的多个过程，Foxa1/2功能缺失证明其在DA神经前体细胞的增殖中起重要作用，还可诱导随后DA神经元命运决定的Nurr1等的表达。这些证据表明，在发育过程中转录因子的表达有着严格的时序性和空间限制，而且随着时间推移，基因的表达区域表达量都会发生明显的变化。3多巴胺神经元命运决定的转录因子中脑DA神经元表达分子标记TH显示其已退出了细胞周期，分出成熟的DA神经元。在小鼠中TH从E11.5开始表达，利用更灵敏的检测方法可见在E10左右已有少量TH开始表达，这表明DA神经元的分化成熟是一个不同步的过程，它们的出现是逐步进行的，而大量成熟DA神经元的出现约在E11.5。已知对中脑DA神经元发育起直接调控作用的转录因子有Nurr1、Pitx3和前面所述的Lmx1b、En1/2.Nurr1为中脑DA神经元产生所必需。Nurr1是激素类核受体家族成员之一，因与其作用的配体尚未明确故属于孤核受体，它既可以以单核形式发挥功能也可以同RXR星恒异聚体起作用。Nurr1起始表达于E10.5，被认为表达在未成熟的有丝分裂后DA神经元前体细胞中。Nurr1缺失并不影响中期DA神经元前体细胞的发育，因为在E15.5上能观察到DA神经元前体细胞，并且DA神经元早期发育的许多标记分子表达正常，但在这些DA神经元前体细胞发育过程中，TH不能被诱导表达，且在出生后，小鼠中脑DA神经元则全部消失，多种与DA合成、转运和储存相关的基因也都缺失。此外，在神经干细胞中表达Nurr1，可以增加Shh和FGF8诱导的TH阳性细胞数，但是过度表达Nurr1并不影响与DA神经元发育相关的其他基因的表达。已有资料也表明，Nurr1可以以单体的形式直接结合到TH上游启动子中，激活TH在DA神经元中的表达。此外，如果将正常腹侧中脑组织与Nuur1-/-缺失的细胞共培养，则可以诱导出TH的表达，表明可能有其他不通过Nurr1的激活TH表达的机制。Nurr1除了调节DA合成外，还在营养因子的表达调控中发挥作用。Nurr1缺失使得DA不能合成，但仅仅这个原因似乎不足以成为DA神经元丢失的理由，推测Nurr1基因缺失可能导致那些调节DA神经元存活的信号通路功能障碍。Pitx3从E11.5起特异性地表达于中脑DA神经元中。Pitx3自发突变小鼠中，Pitx3阳性的DA神经元在小鼠出生后死亡，而且这些DA神经元的丢失是个渐进的过程，突变的小鼠出生后，首先黑质致密带的DA神经元缺失，到出生后一天，在黑致密带大约有90%TH阳性的DA神经元缺失，到P21，部分腹侧被盖区的DA神经元也开始消失，而到了P100，该区域大约只有一半DA神经元还存活这。这种发育跟进行性DA神经元死亡的PD中DA神经元的退行性病变死亡有一定的相似之处。 利用遗传学操作分别敲除Lmx1b、Pitx3和Nuur1基因后的实验结果揭示了它们三者之间的关系：Lmx1b的缺失可以使Pitx3的表达大幅减少，但不影响Nurr1和TH的表达，尽管如此，这些TH阳性的神经元在胚胎发育的过程中仍旧逐渐丢失。而Pitx3的缺失影响中脑黑质区和VTA区的DA神经元发育，使之不能分化成TH阳性细胞，Nurr1也不能表达。Nurr1缺失的小鼠中TH不表达，不能分化为DA表型的神经元，但是Pitx3的表达却不受影响。这些结果表明，Lmx1b、Pitx3与Nurr1可能位于不同的遗传学通路上。4 ES细胞转化为多巴胺神经元参与治疗帕金森综合症的相关研究PD作为最著名的神经退行性疾病之一，是SNc中DA神经元的大量凋亡所导致的。尽管通过动物模型已经对PD的病因及病理的理解有了长足的进步，但间歇性的PD发作仍然无法解释。在传统的药理学治疗无效的基础上，近年来兴起了通过幼龄腹侧中脑移植来重塑DA神经元的连接的治疗方法。大量的动物研究表明，这样生成的DA神经元与正常相比是在形态与功能上有相当的相似性。但在临床试验中，这种方法也不能显著的改善PD病人的病情。于是所有的目光都转向了人多能干细胞（Human pluripotent stem cells，PSCs），通过一些操作使ES细胞分化为DA神经元已达到治疗的目的，在我们目前的对DA神经元发育分化的了解基础上，通过胞外信号、转录因子等组合诱导ES向DA神经元发育。但是由于知识还是非常局限，并且人类DA神经元的发育和分化并没有系统的研究过，外加即便诱导出来的DA神经元移植入PD动物模型中，也不能很好地在体内完成分化与连接，这个方法一度陷入停滞。2011年Kriks等第一次在小鼠和大鼠体内通过移植他们诱导的来自PSCs的DA神经元来治疗PD获得成功，并且证明过去的失败是因为特化的不完全而导致的。Kriks他们所使用的诱导原理是激活Wnt和Shh信号通路，外加FGF8及一定的抑制剂Foxa2表达，综合之后便可以成功诱导出分化及特异的DA神经元。他们的工作ES或iPS在PD的治疗带来了新的曙光。参考文献：1 蔡文琴 ，发育神经神经生物学. 科学出版社，20072 Kriks S, Shim JW, Piao J, et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinsons disease. J Nature. 2011 Nov 6;480(7378):547-513 Smits SM, Burbach JP, Smidt M