质谱培训教材.ppt

ThermoScientificChina DemoCenter LTQ液质联用仪培训教材 质谱基本常识 第一章 ThebasisinMS massspectrometry istheproductionofions thataresubsequentlyseparatedorfilteredaccordingtotheirmass to charge m z ratioanddetected Theresultingmassspectrumisaplotofthe relative abundanceoftheproducedionsasafunctionofthem zratio 质谱的基础是产生离子 这些离子随后按质荷比大小被分离过滤并被检测 得到的质谱图是产生离子质荷比的相对丰度图谱 Niessen W M A VanderGreef J LiquidChromatography MassSpectrometry PrinciplesandApplications 1992 MarcelDekker Inc NewYork p 29 什么是质谱 怎样理解质谱 LC MS LC MSn MS MS MS 总离子流图 MassSpectrometry Simplified GMSD GenerateIons 产生离子 MoveIons 离子传输 SelectIons 选择离子 DetectIons 检测离子 SampleIn 样品引入 DataOut 数据输出 IonOpticsSystem离子透镜系统 质谱简化流程 AtmosphericPressureIonization 大气压下离子化离子源类型 ElectrosprayIonization ESI 电喷雾电离 大多数情况下是液态过程APCI AtmosphericPressureChemicalIonization 大气压下化学电离 气相过程APPI AtmosphericPressurePhoto Ionization 大气压下光离子化 气相过程离子源作用 Desolvatesampleflowforintroductionintomassspectrometer 去溶剂BafflethefirstvacuumregionoftheMSfromatmosphericpressureinthesource 真空过渡Ionizetheanalyteortransportioninsolutiontothegasphase 离子化Pumpawayneutralsandoppositechargedionswhichwouldotherwiseinterferewiththeanalysisofthedesiredpolarity 去除干扰 离子产生 API ChemistryConsiderations化学考虑 ESI 离子在液相产生有益于热不稳定化合物的分析有益于中等到高极性化合物分析有益于大分子 蛋白 多肽 APCI APPI 离子在气态产生不利于热不稳定化合物的分析有益于低极性到中等极性化合物分析适合小分子 steroids 类固醇 甾体化合物 适合含有发色基团的化合物 APPI Electrospray BasicLayout IonTransferTube金属毛细管 ESINeedle 5kV TaylorCone泰勒锥 SolventevaporationandIondesolvation溶剂蒸发和去溶剂 电喷雾电离过程 AuxiliaryGas 辅助气 SheathGas 鞘气 5kV ESI喷嘴横截面 喷嘴 喷针 碱性分子 M H NH2 酸性分子 M H COOH OH 正负离子扫描选择 练习 请为这两个化合物选择合适的扫描方式 AtmosphericPressureChemicalIonization APCI 大气压下化学电离 通过电晕放电达到气相电离电离过程分以下三步1 高压电晕针作用于载气 N2 和挥发的HPLC溶剂 产生初级离子 O2 e O2 2e N2 e N2 2e 2 通过一系列复杂反应 初级离子和溶剂分子产生溶剂离子 如H3O OH 3 溶剂离子和分析物反应产生正离子模式下的 M H 或负离子模式下的 M H H3O Analyte Analyte H H2OOH Analyte Analyte H H2O AtmosphericPressureChemicalIonization APCI 大气压下化学电离 2004Dr PaulGates UniversityofBristol AtmosphericPressurePhoto Ionization APPI 大气压下光离子化电离 利用APCI探针去溶剂通过UV光源离子化电离过程有以下两步1 分析物分子与UV光源作用 氪灯产生10和10 6ev光子 如果分析物的电离势能低于光子能量hv 分析物分子M被电离成分子离子M M hv M e 2 分析物离子有可能从质子溶剂 如果存在 那得到质子形成离子 M H M S M H S H 灵敏度图谱质量速度 3D 3D vs 2D 线性离子阱 LTQ二维线性离子阱 60m3 hr 15L sec 三端口的分子涡轮泵 Probe 离子透镜 线性离子阱 Detector1 Detector2 可互换的离子源探针 图中所示是ESI探针 离子源探针位置调节器 APPI探针入口 IonMax源 IonMax离子源 离子传输毛细管 离子传输毛细管入口 电喷雾喷针 ESI喷嘴 ESI探针 电喷雾针 离子传输毛细管 ESI喷嘴 ESI探针 IonMax源设计 ESI探针 ESI探针特征 固定的喷射角度 60度 增加鞘液接口 精确质量测定和柱后修饰应用 X Y Z方向调节更加便于优化 液相入口 鞘液入口 ESI喷针 样品管外壁聚酰亚胺涂层会吸收某些溶剂而变长 样品管截面要平齐以保证好的喷雾状态样品管缩进ESI喷针里1mm处得到最好喷雾效果 样品管延长 石英毛细管吸收溶剂溶胀图例 ESI探头切面图 喷嘴 ESI喷针 熔融石英毛细管 喷嘴 ESI喷针 金属针 1mm 1mm 很重要 MetalNeedleKit ESI探头切面图 喷嘴 ESI喷针 熔融石英毛细管 喷嘴 ESI喷针 金属针 1mm 1mm 很重要 SprayVoltage 4 5kV IonMax ESI源操作条件 APCI探针 IonMax离子源设计 APCI探针 离子传输毛细管 APCI探针 电晕针 离子传输毛细管 离子源接口 IonMax离子源设计 APCI探头 APCI探头特征 可移动喷雾器新陶瓷加热器自我清洁功能内表面温度超过1000 C外置热电偶源室没有塑料材料喷嘴组件易于更换X Y Z三维可调 IonMax APCI源 操作条件 当你改变离子传输毛细管 或金属毛细管 的温度时一定要优化透镜电压 负离子模式 APCI操作注意事项 确保APCI探针的蒸发温度足够大 喷雾区域没有液滴沉降蒸发温度 400 450C 针对流速为400 1000uL min 可以适当降低金属毛细管的温度仔细检查鞘气流速辅助气流量可以先设到0进高浓度的样品可能会导致污染和记忆效应定期加热离子源 自动清洗 APCISummary 小结 分析物性质 低到中等极性 高质子亲和力 高气相酸度 1200da典型流速 0 2 2 0ml min比ESI更能容忍缓冲盐仅产生单电荷离子 软电离技术典型应用 药物 农药 类固醇及含氮染料 ComparisonofESIandAPCI二者比较 ComparisonofESIandAPCI二者比较 PAHsAPPI质谱图 金属毛细管正常位置 取出金属毛细管 真空锁定小球 真空锁定 IonMax离子源室设计 改进排出口设计 便于大气压电离废气排出 电晕放电鞘 陶瓷和不锈钢 垂直置于壁上 气化溶剂冷却后不被凝结 所改进的不锈钢的废液排出部件 探针垂直安装 液滴直接进入废液排出口 即使氮气用完 也不会在腔室内累积溶剂 非塑料外壳 便于观看的两个视角 钛制成的新型Skimmers 直径较大 提高灵敏度钛材料更有利于保持skimmer的热平衡 不锈钢材料会逐渐冷却所以可作为加热器 IonMax源 Skimmer APIStack装配示意图 LC MS条件优化 第二章 Sampleconcentration样品浓度Choiceofcolumnandsolvents柱子型号和溶剂Flowratesandtheireffects流速及影响 LC MS条件优化 样品信息你需要得到尽可能多的样品信息 目标分析物的信息包括以下 分子式 结构 官能团 分子量 溶解性 pKa 稳定性 储存 是否有标准品 浓度水平和范围基质信息 类型 状态 液体 固体 溶解性 不同成份 样品预处理 提高灵敏度 去除基质干扰 离子抑制建立去除基质干扰的方法 SPE 萃取 过滤等 进样浓度 与进样量和柱内径有关 ESI 1 L min 1mL min最佳使用流速 200 L min一般来说 高流速需要高的毛细管温度和气体流速 APCI 200 L min 2mL minOptimalFlowRate 500 L min一般来说 高流速需要更高的鞘气和辅助气流量 但不需要提高毛细管温度 LC建议流速 液相柱 标准装柱填料直径5 0mm 最适合的流速 线性速度 流速柱子直径1 0mL min4 6mm0 5mL min3 0mm0 2mL min2 1mm50mL min1 0mm 10mL min毛细管 使用窄内径的柱子可以提高分离效果 LC添加剂 酸不要使用无机酸 可能会导致腐蚀 推荐使用醋酸和甲酸碱不要使用碱金属碱 可能会导致腐蚀 推荐使用氢氧化铵和氨水表面活性剂清洁剂和其他表面活性剂会产生离子抑制三氟醋酸 TFA 可以提高液相的分离度 但是在质谱正负离子模式下会产生离子抑制作用三乙胺 三甲胺 TEA TMA 有助于形成负离子 增加TFA用量 乙腈 水 50 50 对质谱信号强度的影响 本结果是两次实验的平均值 注 不加TFA的结果是不确定的 因为在溶液无法肽段质子化 对照样品是50 50 0 1 甲醇 水 甲酸 N 6 平均信号强度 1 10 x106counts S Baldwin K Stoney K Wheeler I Mychreest LowpHSolventAlternativestoTFASolventsandTheirEffectonHPLC ESI MSofPeptides PosterPaperPresentedatASMS 96 液质联用中缓冲盐使用的注意事项 pH 当使用非挥发性的盐时 一定要使用吹扫挡锥 sweepcone 尽量避免使用如下的非挥发性盐碱金属磷酸盐硼酸盐柠檬酸盐经常使用缓冲盐需要定期清洗金属毛细管 乙酸甲酸氢氧化铵氨水溶液三氯乙酸 0 02 v v 三氟乙酸 0 02 v v 三乙胺 0 02 v v 三甲铵 0 02 v v 醋酸铵甲酸铵 LC MS流动相添加剂和缓冲液总结 CrawfordScientific OPDAC OnlineProfessionalDevelopmentinAnalyticalChemistry LC MStrainingpackage HolmStreet Strathaven Lanarkshire ML106NB Scotland UK Buffers pH 甲醇乙腈水异丙醇二氯甲烷氯仿正己烷四氢呋喃 LC MS溶剂的建议 推荐使用溶剂 非推荐使用溶剂 改变流动相的比例提高分离度 BETASILC18 150 x4 6mm 5 m流速 1 25mL min检测器 UV 254样品 烷基苯 100 ACN 90 ACN 10 H2O 80 ACN 20 H2O 等度洗脱vs梯度洗脱 选择等度还是梯度 DivertValve切换阀 使用切换阀可以增加API源的耐用性 我们通常在运行分析前将转换阀打开 将流动相转入废液 在分析物质出峰之前提前再转换到质谱 以便保护质谱检测器 进入离子源 Waste废液 第三章 离子传输 LTQ内部的透镜系统 API组合 多级杆组合 多级杆00 IM透镜0 多级杆0 IM透镜1 门透镜 多级杆1 前透镜 离子透镜全图 10 3Torr API区域的压力变化 多极杆装置在杆上加的只有射频 RF 电压 几乎所有的离子都有稳定的轨道并安全通过多级杆 在LTQ里 Q00andQ0是方形四极杆 引导离子通过 它们在高压离子源区域和质量分析器之间聚焦并传输离子束 方形四极杆离子引导器比圆形杆的更先进 减小了内部四级间透镜口的尺寸提高了真空度 提高离子通过效率 减少了离子在四级杆中的摇摆四级杆中保持好的碰撞缓冲提高离子束的传输 离子引导 基于中心电压的正负设定振幅的连续振荡电压 0 什么是RF 四极杆对离子束引导比传统多极管更高级 所以能提高仪器的灵敏度 Q0 串联方形四极杆离子引导器 MultipolePotentialWells 离子在 Z 方向移动 第四章 离子阱原理 离子阱不同扫描功能工作步骤 捕获 所有扫描分离 SIM 选择离子监测 和MSn 多级质谱扫描 激发碰撞 MSn 多级质谱扫描 抛射 全扫描 X极杆 X和Y极杆 完整离子阱 二维线性离子阱的外形 LTQ捕获离子 捕获离子 四个双曲面电极末端的DC势能 应用于电极上的Rf氦气 稳定离子 氦气用来降低离子阱中捕获离子的动能 CreatesaPotentialEnergyWelltoConfinetheIons Z 方向捕获离子 10VDC AlternatingRFpotentialsproduceaquadrupolartrappingfieldregion 径向 XY 方向捕获离子 1 2MHz5kV0 P DisplacementfromtheTrapCenter RestoringForce 四极电场 z RF有两部分 频率 周期 秒 功率 波的振幅 射频转换电压 0 线性离子阱的射频 1 2MHz 电极杆上的射频 势能阱 氦气作为缓冲气体 氦气流入离子阱 关闭氦气氦气不流入离子阱 氦气的影响 在四极场内离子稳定性的数学表达公式 质量数 IonTrapStabilityDiagram cont 关键 在特定的射频电压下 每个离子都按照特定 长期的 频率移动 增加RF电压 离子的频率 q值 将会增加 因此可以通过MainRF电压控制频率 q值 逐渐提高射频 使离子从低m z到高m z逐渐依次离开 扫描离子 质量选择的不稳定性 withResonanceEjection Theapplicationofresonanceejectionincreasesresolutionbecauseionsofaspecificm zleavethetrapinamorecondensedmanner ResonanceEjection ResonanceejectionkicksionsoutofthetrapattheirspecificejectionfrequencyEjectionoccursmuchfaster q 0 88 thanlettingtheionsreachtheedgeofthestabilitydiagram q 0 908 TheadditionalRFisonlyappliedtotheX rodsrodsandisaddedtothemainRFResonanceejectionincreasesresolutionandsensitivity bynarrowingthedistributionoftheejectedpacketandminimizingscatteringlosses RadialDipolarExcitation X rods ResonanceEjection cont 从离子阱中抛射离子 NormalScan 16 000amu sec 单位质量分辨 快速扫描速度 FWHM 0 7EnhancedScan 5 500amu sec 分辨率提高 比NormalScan扫描速度降低 FWHM 0 45ZoomScan 1 100amu sec 设定质量范围内提高分辨率 可以确定多电荷离子价态 FWHM 0 3UltraZoomScan 28amu sec 最高分辨率 最慢的扫描速度 针对窄质量范围 FWHM 0 15 LTQ扫描 抛射 速度 离子阱全扫描功能 单位质量分辨 扫描速度16700amu sec ZoomScanResolution 扫描速度1100amu sec UltraZoomScan 扫描速度27amu sec M 0 05amu UltraZoomScan 扫描速度27amu sec 第五章 AGC自动增益控制 分辨率好 分辨率差 2 200 20000 大约的离子捕获数目 20 2000 200000 空间电荷效应 自动增益控制 AGC 通过固定时间 1ms 的预扫描估计进入阱内的离子数目 让软件来决定最优化的IT ioninjection 来减少空间电荷效应带来的问题 正式扫描之前有预扫描 校正液混合物图谱 AGCOn Injectiontime单位为ms 校正液混合物图谱 AGCOff AGC预扫描信号 3x105counts 1ms 预扫描时固定不变 倍增器增益x预扫描时间 离子数目x 注意 最大injectiontime是由用户自己设定的 计算离子进入时间 CorrectedIonCurrent TIC ScaledTIC ofionsmeasured TICPlot TriplicateInjectionofMRFA 离子时间 微扫描和扫描循环 AGC循环 一级全扫描总结 FillingtheIonTrap GateOpen GateClosed 第六章 Isolation Activation IsolatinganIon IsolationofIons隔离母离子 0 908 qz 0 0 目标母离子 在不同qz值的离子以不同的频率振荡 o 每一种频率对应唯一的且特定的m z值 TailoredRFWaveform appliedtotheX rods RFpowerappliedatthesecularfrequenciesofallionsinthetrapEXCEPTtheionofinterestcausestheunwantedionstobeblownoutofthetrap IsolationofIons cont 500Hz 30msec qaxis qaxis 908 908 DipolarexcitationisappliedtotheX rodsatallofthefrequenciesexceptthefrequencyoftheionofinterest ejectingallionsbuttheionofinterest IsolationWaveforms IonTrapSIMScanFunction 什么是HighResolutionIsolation HRI Thehighresolutionisolationmethod这种高分辨隔离方法结合使用多频共振抛射隔离波形和慢速共振抛射扫描能够实现低于0 3Da 或者更低 隔离宽度下分离母离子这种隔离方式使MSn的分析不受同位素峰的干扰 同时 这种隔离方法帮助有效隔离不稳定的离子 HowDoesHRIWork Step1 Generateabignotchtogetridofmostoftheunwantedions Step2 SlowlyScanRFtowardlowQtoejectionswithm zhigherthantheionofinterest Step4 MovetheionofinterestbacktooriginalQ Step3 SlowlyScanRFtowardhighQtoejectionswithm zlowerthantheionofinterest HigherResolution HighEfficiencyforLabileIons HRI IsolationWaveforms SlowScanning FragmentinganIon 908 qaxis 908 qaxis 30ms TheisolatedionisexcitedbydipolarexcitationontheX rodsintocollisionswithhelium thecollisionsinducefragmentation whileconvertingtheion skineticenergyintovibrationalenergy ResonanceExcitation Activation Fragmentation CID CAD IonTrapMS MSScanFunction MS2 ResonantExcitationqValue FragmentationEnergy 0 908 q 0 0 0 18 0 908 q 0 0 0 908 q 0 0 0 225 0 30 FragmentionsNOTtrapped LowMassCutoff 1 5 1 4 1 3 HowDoesPQD PulsedQDissociation Work PQDisahighenergyprocess approx 6xthevoltageofCID andallowsionswithm zinresonancewiththeexcitationtoabsorbenergy StepsinthePQDprocess PutprecursorionathighQandactivateusingresonantexcitation HoldionsathighQ justlongenoughtoconvertthekineticenergyintointernalenergy approx 100us throughcollisionsbutnotlongenoughforsignificantdissociationtooccur PulsetolowerQvalueastheionsstarttoundergodissociationandfragmentsaretrappedatlowQ qaxis qaxis 908 908 Isolation Fragments 908 908 H2O qaxis qaxis WideBandActivation WidebandActivation宽带激发 100 150 200 250 300 350 m z 311 329 330 207 MS MSspectrumofm z329没有使用宽带激发 LabetalolC19H24N2O3 MW 328 18 311 207 190 164 329 294 179 147 312 208 MS MSspectrumofm z329使用宽带激发 LabetalolC19H24N2O3 MW 328 18 SourceCID Sourcefragmentation 第七章 离子检测 总结 检测系统 转换打拿极 正离子 或负离子 被推向转换打拿极 因此 会抛射出成比例的反电荷的离子束 包括电子 转换打拿极固定工作电压 15kV 正离子模式 15kV 负离子模式 电子倍增器 电子倍增器校正 LTQ倍增管会遭遇很高的信号电流 因此应该定期进行校正 确定AGC的测定保持准确性 建议三个月进行校正 倍增管的校正只需要MRFA MRFA最终使用浓度应该与全校正液的浓度相同 捕获分离激发抛射 总结 离子阱功能 扫描类型 所有扫描通过 Front CenterandBackSections Potentialwell DC XandYRods MainRF方法 在设定的振幅内切换射频频率 1200kHz 并在阱内加上氦气 阻尼气体 将离子拘捕在阱中心 捕获分离激活投射 扫描类型 选择性离子检测 多级质谱通过 电极方法 a 剪切波形应用在除目标离子外的所有离子上b 这样只有目标离子留在阱中 总结 离子阱作用 捕获分离激活投射 扫描类型 MSn多级质谱通过 XandYRods MainRFvoltage X rods Dipolarexcitation 方法 X电极上施加小电压活化隔离的母离子 并使和离子阱中的氦气原子碰撞 总结 离子阱功能 捕获分离激活抛射 扫描类型 所有扫描通过 XandYRods MainRF X rod Constantfrequency 方法 在设定的扫描范围内 线性增加MainRf电压提高所有离子 按质量从低到高 的q值到0 88 质量选择性扫描 再改变端电极的射频振幅使离子聚成一团 共振抛射 总结 离子阱功能 SRM 抛射 分离 激发 分离 捕获 MS 捕获 抛射 MS2 捕获 抛射 分离 激发 MassSpectrum Chromatogram MassSpectrum Chromatogram SIM 捕获 分离 抛射 LTQ的扫描类型 第八章 一步步调谐和校正LTQ 首先 打开一个相关的调谐文件 点击open 将仪器设置为扫描状态 将仪器设置为扫描状态 打开蠕动泵注射样品 1 点击open 2 设定流速和注射器类型 开启液相色谱泵的流速 1 点击打开 2 设定溶剂组成和流速 3 启动液相色谱泵 检查离子源参数 1 点击打开 在调谐过程之前可以适当调节气流和喷雾电压 检查InjectionTime IT 是否稳定 检查IT确认喷雾稳定 1 点击打开 打开DefineScan对话框修改参数 3 将扫描范围缩小到目标物范围附近 2 将microscans设为3 并增加max injecttime 打开调谐对话框 1 点击打开 自动优化 RecordWhichOpticsintheGraphViewdonotGiveanOptimumVoltage 1 点击打开分屏按钮 2 输入质荷比 3 点击Start 自动优化 找到目标离子某个传输组件 如 frontlens 最优峰顶电压 半自动优化 ChangetheVoltageRangetoOptimizetheVoltagefortheIonOptics 2 输入离子质荷比 3 点击开始 1 选择在automatictuning里没有得到最佳优化的透镜参数 针对每个透镜优化电压的范围 半自动优化 如果找到最优电压 点击accept 手动优化 MonitortheEffectofChangingSourceParametersonSignalIntensity 2 点击start 输入质荷比 一次可以输入四个不同的质荷比 手动优化 1 点击打开 2 改变离子源参数 得到目标化合物最高信号强度 优化MS2参数 IsolationWidth和CollisionEnergy 1 点击打开 MS2参数没有保存在Tune文件中 所以优化的IsolationWidth和CollisionEnergy必须手动保存 找到最优化的IsolationWidth 1 输入质量数 3 点击apply 2 逐渐降低IsolationWidth 4 查看NormalizedLevel NL 确认是否有信号强度的丢失 目标 找到最窄的IsolationWidth同时维持最高的信号强度 对隔离的母离子施加CollisionEnergy 1 设定collisionenergy 35 打碎母离子 自动优化CollisionEnergy 1 点击打开 2 选择TIC或某个质量数碎片离子 3 点击start 自动优化CollisionEnergy 点击Accept 接受该项优化的CE 针对各种扫描模式设定Microscans和MaxInjectTime 1 点击打开 对于MS和MSn microscan设为1即可Maxinjecttime根据MS到MSn有所不同 保存调谐文件 在Tuning界面采集数据 1 点击打开 照相机按钮可以用来采集数据 并且直接在LCQTune界面运行InstrumentMethods 典型的真空设定 APIStack区域 1 0 1 5Torr 离子阱区域 0 75 1 5x10 5Torr 校正注意事项 LTQ电子倍增器遭遇很强的电流信号 所以需要定期校正以保证AGC的测量保持准确 对于LTQ电子倍增器 建议每个月校准一次 每三个月执行一次全面的LTQ校正程序 最好在清洗APIStack之前校正仪器 以免污染仪器 电子倍增器的校正仅需要MRFA 溶液的浓度和全面校正用到的校正混合物中MRFA的最终浓度是一致的 不需要频繁地校正仪器 不必要的校正会导致ultra mark污染 校正前首先确认 校正液是新鲜的 校正液包含所有的校正离子 195 1 524 3 1022 1 1522 1 1822 1 根据所使用的流速调整离子源的相关参数 如SheathGas和AuxGas 获得稳定的喷雾 在LTQTune关注injectiontime IT 和NL thenormalizedlevel 全自动校正 开始全自动校正程序 需要约40分钟 半自动校正 用半自动校正程序校正全自动校正过程中没有通过的项目 LTQ校正液配法 说明书 GettingStarted 附录有详细的说明 第九章 Xcalibur 仪器方法建立 ThermoSoftwareStandard TSQQuantumClassic Discovery DiscoveryMAX Ultra UltraAM EMRLCQAdvantage LCQAdvantageMAX LCQDecaXPPlus LCQDuo LCQDeca LCQClassicLXQ LTQ LTQ FTMS LTQOrbitrap MAT900XP MAT900XP Trap MAT95XP MAT95XP TrapTempus PolarisQ Polaris GCQ TraceDSQTraceMS Voyager MD800 aQa Navigator MSQ MSQ 支持的LC等外围连接设备 Surveyor LC MS MSPluspumps AS ASLite ASPlus ASPlusLite PDA PDAPlus UVvis2000 TSP P2000 P4000 AS1000 AS3000 UV2000 UV6000 CTCAnalytics PALAutosampler Waters 2690 2695 2795 2487UV HP Agilent LC1050 1090 1100 AS1100 DAD1100 VWD1100 Shimadzu LC 10Avpseries FluxInstrumentsAG Rheos2000 dual IC8 Dionex LCPackings Ultimate OtherAnalogDevices其他模拟装置 rawAcquireddatafiles sldSequencesetupfiles pmdProcessingSetupmethod methInstrumentSetupmethod rstResultfilesfromQuantitation mspLibrarysearch lytQualBrowserlayout lqnLCQuanfiles xqnQuanBrowserfiles xrtXReportfiles Xcalibur文件类型 InstrumentConfiguration 主界面 状态显示 点击设定InstrumentMethod HPLCMethodSetup HPLCMethodSetup AutosamplerSetup 选择进样方式 充满的Loop环注射 取样体积 3x设定注射体积 超出的体积超出的体积是26 1ul充满的Loop环注射方式注射精度最高 总体积 注射体积 超出体积超出体积是10ul用气塞填补剩余体积 部分Loop环注射 取样体积 设定注射体积 1ul无损耗注射总让2ul冲洗溶剂注射进入系统 如果系统流速较低且溶剂性质较强这种注射方式会使肽段与柱子结合不好 必要时采用样品制备方法 用户应该用已知样品的充满loop环注射方式校正无损耗注射方式的死体积 无损耗注射 Flush和Wash设定 减少交叉污染 Flush 清洗进样座和进样针的内部 Wash 清洗进样针的外壁 PDASetup LTQMSSetup LTQ设定页面提供最常用实验模板 OpenRawFile LTQMSSetup Segments在LTQ下拉菜单中选择RAWFile打开原始数据 方便划分时间段和时间间隔 输入本方法中需要使用的Segment个数 拖拉红线来增加或减少每个Segment时间间隔 每个Segment只有一个Tune文件 1 2 3 4 LTQMSSetup ScanEvents选择每个Segment的ScanEvent个数每个scanevent本质上是不同的采集模式 例如 一个全扫描紧接着一个二级质谱扫描 这是两个独立的ScanEvent 2 在某个特定的Segment中 每个ScanEvent必须使用相同的TuneFile LTQMSSetup MassRange Low NormalorHighScanRate Zoom Ultrazoom etc Scantype EitherfullscanorSIM togglestoSRM MS2 Polarity or ionmodedetection6 Datatype CentroidorProfile 其他方法功能 1 2 可以让APCICoronaOn和APPILampOn处于激活 需要源内裂解CID就可以激活SourceFragment SelectedIonMonitoring Scantype SIMEntercentermassEnterwidth m z MS MS子离子全扫描 目标化合物MS MS Scantype Full输入母离子质量数 Isolationwidth Tune界面已优化 Normalizedcollisionenergy 用25到35 ActivationQ 默认值0 25 Activationtime 默认值30ms 输入子离子的起始质量范围 DataDependentAcquisition 第一个ScanEvent是触发事件 所有后面的ScanEvent依赖于ScanEvent1 建立DoublePlay DataDependentMS MS 方法 步骤 一级全扫描 从一级全扫描的图谱中选取最强的离子做MS MS 这是数据相关MS2 优点 缺点 提供MS MS 结构 信息 丢失共流出的峰 BuildingDoublePlay ScanEventOne 1 选择两个scanevent 设置采集时间和TuneFile2 第一个扫描事件需要设定扫描宽度 ScanRange BuildingDoublePlay ScanEventTwo 激活DependentScan点击Settings 设定MassWidths Exclusionmass宽度和Rejectmass宽度 2 ExclusionMassWidth中Low和High的设置可以是不对称的 High的设定较宽 可以包含同位素峰 BuildingDoublePlay ScanEventTwo BuildingDoublePlay ScanEventTwo 1 选择Segment MassLists 2 添加Rejectmasses 输入Rejectmasses 用一级全扫描模式采集一个空白数据 在QualBrowser里查看该数据得到 BuildingDoublePlay ScanEventTwo 选择ScanEvent Activation2 设定ActivationType DefaultChargeState IsolationWidth和NormalizedCollisionEnergy BuildingDoublePlay ScanEventTwo 选择ScanEvent CurrentScanEvent设定 Minimumsignalthreshold counts 绝对强度 用一级全扫描模式采集一个空白数据 在QualBrowser里查看该数据得到 确定两处均设为1 实验总结 常用DataDependentLCQExperiments设定 Big3 步骤 一级全扫描对最强的离子 第二强的离子以及第三强的离子做数据相关DataDependent dd MS2优点 缺点 MS2花费时间很长能采到峰顶点位置的信号DoublePlaywithDynamicExclusion 步骤 一级全扫描启用DynamicExclusion 对最强的离子做数据相关DataDependent dd MS2优点 缺点 为分析共流出物提供可能可能丢失出峰的顶点位置 DynamicExclusion 共流出物的MS MS2 DynamicExclusion 1 选择Global DynamicExclusion2 设定Repeatcount Repeatduration Exclusionlistsize Exclusionduration和Exclusionmasswidth 以上设置导致0 2分钟内采集了三次MS MS图谱 0 3分钟后该排除离子获得释放 ExclusionMassWidth中Low和High的设置可以是不对称的 High的设定较宽 可以包含同位素峰 DivertValve操作 方法总结 DataDependentTriggers 数据相关采集系列 第九章 Xcalibur SequenceSetup XcaliburHomePageSequenceSetup 打开SequenceSetup 点击View SequenceSetupView 也可点击SequenceSetup 创建序列 1 双击添加InstrumentMethod 2 如果此路径下没有该文件夹 你可以输入文件夹名 该文件夹将会创建 3 设定FileName 无空格 Position和InjVol 如果你的样品数比较少 从SequenceSetup主页建序列更方便 运行序列需要提供的基本信息 FileName Path InstMeth Position InjVol 创建序列 热键F2 可以编辑该文本 右击并选择OpenFile可以打开InstrumentFile 用新序列模板创建序列 如果你需要运行大量的样品 使用NewSequenceTemplate创建序列会比较方便 1 点击New 新序列模板 1 选择BaseFileName Path InstrumentMethod 3 选择起始的VialPosition 2 输入unknown样品的个数 4 如果你已经有ProcessingMethod 在上面指定好 你可以添加Standards Blanks以及QCs 会自动生成包括processingmethod相关信息的序列 新序列模板 一旦你在NewSequenceTemplate界面点击OK 文件名会自动根据BaseFileName自动往下递增 新序列模板 IfyouwanttotypeanewFileName 2 选择Edit点击FillDown 1 输入Filename 改变序列中ColumnArrangement 1 选择Change点击ColumnArrangement 2 从左边的AvailableColumns选择需要的内容 4 点击MoveUp或者Down改变显示次序 3 点击Add 改变用户标签 1 选择Change并点击UserLabels 2 改变labels 改变Tray 当前配置的自动进样器能够使用的所有进样架列表 1 选择Change点击TrayName 2 选择使用的Tray型号 将序列输出到Excel 1 选择File 点击ExportSequence 将序列输出到Excel 1 选择需要输出的内容并点击Browse 2 命名该文件 3 序列文件将输出为 csv格式 输出序列示例 确保重新将该序列导入Xcalibur 第一行必须包含文本BracketType nwheren 1 4 每个数字代表特定的bracket类型 1 Overlapped 2 None 3 Non overlapped 4 Open 从Excel中导入序列 2 选择你需要输入的内容 点击Browse找到输入文件 1 选择File并点击ImportSequence 运行序列 1 可以选择RunOneSample或RunSequence 运行序列 显示在InstrumentConfiguration界面配置的所有仪器 允许自动处理样品数据 如果没选 序列将不会运行 除非你点击Actions StartAnalysis 确认这些行是待运行的 可以优先运行提交的序列 选择在序列运行前或后仪器的运行方法 信息条 AcquisitionQueue SequenceProgress Status 通过点击ViewanduncheckingInfoView打开或关闭InfoView Status键显示所有配置仪器的状态 提交序列后 就会出现在AcquisitionQueue 点击Sample旁边的方框 框内打勾 键盘上再点击Delete键即可删除该样品 实时图谱查看 1 选择View 点击RealTimePlotView 如果你更改了该页面的一些设定 点击解锁键 重新监测实时数据采集 第十章 QualBrowser定性浏览器 打开QualBrowser 你可以在XcaliburHomepage右击QualBrowser 打开原始数据或序列 打开QualBrowser QualBrowser主界面 InfoBar 放大按钮 可以放大色谱图或质谱中某段区域 主要工具 最多每个窗口一次可以显示16个cells 每个cell最多包含8个plots 右上角有Cell的标志 在QualBrowser界面打开文件 2 选择replace 当前window cell或plot addanewwindoworplot 默认是增加一个新窗口 选择输出的Layout 1 点击File选择Open 也可以打开序列或结果文件 TheInfoBar TheCellInfo页面提供对应Cell中每个Plot信息 如果你打开的是序列或结果文件 将分别出现在InfoBar的第二页和第三页 当你对色谱峰进行积分时 会出现Integration页面 你可以改变积分参数获得合理的积分 TheInfoBar ElementalComposition 2 设定分子式的限定条件 3 改变使用的元素 右击选择AddIsotopes 直接从元素周期表界面进行选择 1 输入质量数或在质谱图某个质量数上右击 选择 GenerateFormulafromMass 4 点击Calculate 表格中即出现分子式信息 InfoBar之ElementalComposition帮助你