隐球菌脑膜炎的实验室检测.doc

隐球菌脑膜炎的实验室检测首都医科大学附属北京地坛医院 王慧珠一、新型隐球菌的特点 新型隐球菌广泛分布于自然界中，鸽子粪是主要传染源。圆形、卵圆形，菌体为宽厚的荚膜包裹；不形成菌丝和孢子；出芽生殖。分 A 、 B 、 C 、 D 四个血清型。 A 型最多见。 致病菌属包括 17 个种和 8 个变种，主要是新型隐球菌新生变种和格特变种，已报道引起人类疾病的还有浅黄隐球菌、浅白隐球菌和罗伦隐球菌，但是很少见。 二、致病性 新型隐球菌为条件致病菌，免疫功能低下者为高发人群，但也可发生在免疫功能正常人。白血病、恶性肿瘤、艾滋病、 SLE 、尿毒症患者。长期广谱抗生素、激素、免疫抑制剂使用者更易感染。 隐球菌侵入肺部后，局部病变进展缓慢，病变轻微，常无临床症状，但有 20% 以上的病例可由此经血进入中枢神经系统，导致隐球菌性脑膜炎的发生。 三、临床表现 （一）起病缓慢、可呈亚急性，潜伏期 2-4 周。 （二）脑膜炎的表现：意识障碍，头痛、发热（以不规则热多见） 。 （三）颅内压的表现，可有颅神经损害。 （四）未经治疗病情逐渐恶化 （五）血常规正常 （六）腰穿：压力增高明显，脑脊液外观透明或微混，白细胞轻中度增多（ 40-400/ul) ，以淋巴细胞为主。蛋白轻度升高，糖减低，氯化物轻中度减低。 四、其他部位隐球菌病 （一）肺隐球菌病 （二）皮肤隐球菌病 （三）骨隐球菌病 五、新型隐球菌对 CNS（中枢神经系统） 具有亲和力？ 机理可能和脑脊液中有隐球菌所需要的天门冬酰胺、肌酸内酰胺等刺激真菌生长的营养因子有关。 六、特殊宿主的隐球菌病 隐球菌病是 AIDS 病人最重要的也是致命的真菌感染并发症，在 AIDS 人群中，发病率可达 6% 10% ，而在中部非洲地区可高达 15% 30% ，这可能与发达国家对于 AIDS 合并机会感染控制水平有关，即早发现、早治疗。 AIDS 病人患隐球菌病的临床表现与其他免疫受损的病人相似，然而，感染部位常含有更多的菌体， 80% 以上的病人在做出诊断时已有脑膜炎或脑膜脑炎，且病变更广泛。 AIDS 患者并发隐球菌病很少能治愈，常见持续感染和复发，有文献报道 10%25% 的病人死于治疗期间。 七、北京地坛医院情况 我院 2009 年 1 月至 2011 年 12 月共确诊 405 例 AIDS 患者，其中隐球菌脑炎患者为 53 例，感染率 13.1% 。 其中墨汁染色阳性 25 例（ 47.2% ），真菌培养阳性 23 例（ 43.4% ），抗原检测阳性 53 例（ 100% ）。 通过单一或联合治疗，治愈 1 例（ 1.9% ），好转 40 例（ 75.5% ），未愈 6 例（ 11.3% ），死亡 6 例（ 11.3% ）。 八、诊断 对于临床上出现 CNS 感染的症状、体征、脑脊液压力明显增高及糖含量明显下降的患者，应高度警惕隐球菌脑膜炎的可能，尤其对具有免疫功能底下者、有养鸽或有鸽粪接触史者，更应高度怀疑。实验室检查具有重要的诊断价值，包含涂片镜检、培养、隐球菌特异性抗原检测和组织病理检查发现隐球菌。 九、治疗 隐球菌病的治疗包括真菌药物治疗、对症治疗、免疫制剂治疗、手术治疗及原发病的治疗等。 抗真菌治疗：两性霉素 B(0.5-0.8mg/kg/d) ，由 1mg/d 起渐加量，加入 500ml 葡萄糖液中避光静脉缓慢滴 6h 以上；或 0.5-1mg 脑室引流管缓慢抽吸。氟胞嘧啶（ 25mg/kg ， q6h) 。氟康唑（ 200-400mg/d)/ 伊曲康唑（ 100mg bid) 。 十、治愈标准 连续 3 次 CSF 涂片镜检阴性或抗原 阴性 十一、实验室检查 （一） CSF 的涂片 革兰氏染色 ：将临床送检的 CSF 标本 1500g 离心 5 分钟，将沉淀物进行涂片、墨汁染色及真菌培养，用上清夜做新型隐球菌抗原的检测。 一定要离心，容器要选择能离心的无菌塑料试管，避免二次污染。 ppt14 的图片显示的是隐球菌革兰氏染色镜下形态，可见黑色的孢子，以及夹膜抗原。 （二） CSF 的 墨汁染色 1. 方法 （ 1 ）用离心后的沉淀物进行墨汁染色。 （ 2 ）墨汁与脑脊液比例一定要合适，一般选 1 ： 2 的比例。 （ 3 ）选用优质墨汁。 重视墨汁染色，墨汁染色阳性可以直接向临床报告检测到新型隐球菌。 2. CSF 的 墨汁染色隐球菌的形态 取可疑标本置玻片上，加 1 滴墨汁混匀后加盖片镜检。墨汁染色检测隐球菌对于早期诊断隐球菌性脑炎十分重要，但墨汁染色检测隐球菌镜下形态要注意与单核细胞的区别，隐球菌本身并不被染上墨汁，但在黑色背景下为 5-20m ，圆或卵圆形，有宽阔透明的荚膜，菌体周边显现为强的折光形成一个折光环，中心部分为折光性较强的颗粒状或条状物质，也能见到单芽孢子，出芽孢子的颈粗细不一，当母子细胞尚未完全分离时同样可见荚膜沟通，无假菌丝。 ppt17 的图片显示的是墨汁染色高倍镜下隐球菌的形态，可见外圈为透明的荚膜，中间是核，实际工作中，在显微镜下会看到核仁。 ppt18 的图片显示的是将 ppt17 图片中隐球菌的形态放大后的效果，可以看得更清晰，外圈是宽厚的荚膜，中间是核。 ppt19 的图片显示的是墨汁染色隐球菌和母孢子没有完全分离时的形态。 ppt20 的图片显示的是隐球菌正以出芽的方式进行生殖。 ppt21 的图片显示的是墨汁染色中，墨汁和脑脊液的比例不合适，墨汁加的太多，造成荚膜不容易辨别。 3. 菌体计数 对中枢系统隐球菌患者，脑脊液菌体计数是判断预后疗效的重要指标。用血细胞计数板计数，在低倍镜下观察，按白细胞计数法计数。 （三） CSF 的真菌培养、鉴定、及药敏试验 1. 真菌培养及鉴定 （ 1 ）培养基内可加氯霉素，但不可加放线菌酮，因后者抑制本菌生长。 （ 2 ）新型隐球菌 的 菌落特征 ： SDA25 奶油色酵母菌落，有时黄色或带粉色。 （ 3 ） 显微镜特征 : SDA25 球菌或椭圆形酵母菌细胞，第一代培养物有时可见小的荚膜。继代培养物不见荚膜。 （ 4 ） 生理生化检测：用沙氏培养基上分离出的纯菌落制成 0.5 个麦氏单位悬液，充填 API20cAUX 真菌鉴定条（购自生物梅里埃公司），置 35 培养 24-72h 后进行判度。 2. 药敏试验 用 ATB FUNGUS3 真菌药敏试剂条（购自生物梅里埃公司）进行药敏测定 。 （四） 隐球菌抗原的检测 1. 试剂 （ 1 ）进口试剂 大部分是用美国 ImmunoMycologics 有限公司生产的隐球菌抗原乳胶检测试剂盒进行检测。 该试剂在国内还没有拿到注册证，只能用于科研，并且试剂十分昂贵，凝集的结果要注意判读。 （ 2 ）国产试剂 已有国内公司拿到注册证的试剂。 2. 试验原理 用抗隐球菌抗体包被的乳胶颗粒和脑脊液中存在的隐球菌夹膜多糖抗原的标本反应，发生凝集，对血清标本使用裂解酶处理，减少非特异性干扰。标本类型包括 CSF 、血清（肺隐球菌病及其它隐球菌病）、支气管盥洗液等。 3. 临床意义 新型隐球菌抗原的检测非常重要，对于早期诊断隐球菌脑炎有重要价值，临床上一部分病人在就诊初期未能及时得到病原学证据，成为本病容易漏诊的最常见原因。目前国外已用乳胶凝集试验代替了一般的墨汁染色，使诊断的敏感性和特异性明显提高，可以达到 95% 以上。 隐球菌感染的金标准是真菌培养，但敏感性不高，并且隐球菌经过抗生素治疗后很难再培养出来，墨汁染色虽然方法简便，但受菌量多少影响较大，并且治疗后菌体出现退行变，不易辨别。 隐球菌抗原的检测不受送检标本中菌体数量的限制，亦不受药物治疗的影响，可作为活性感染的证据。而新型隐球菌抗原滴度的改变对于临床治疗疗效的观察非常重要。 （五） 其它标本隐球菌的检测 1. 支气管灌洗液 用 50ml 离心管对标本进行离心，用沉淀物进行涂片、墨汁染色、真菌培养。 2. 血培养 （ 1 ）抽取 10ml 血液放到需氧血培养瓶中 （ 2 ）血培养瓶报警后的处理 血培养瓶如报警后，抽取培养物进行 涂片，注意镜下细菌形态。 ppt31 的图片显示的是隐球菌血培养涂片形态，可见许多真菌孢子黏在一起。 ppt32 的图片显示的也是隐球菌血培养涂片形态，可见许多真菌孢子，高度怀疑是隐球菌感染。 抽取血培养液进行墨汁染色，这样做非常重要，可以立刻向临床报告 , 能提前 4-5 天的时间报告。但要注意用血培养进行墨汁染色时，没有用 CSF 进行墨汁染色时的镜下形态好看，荚膜层要小一些，要注意观察。 ppt34 ppt35 的图片显示的是血培养的墨汁染色形态，可见隐球菌的荚膜和核。 ppt36 的图片显示的是墨汁染色的比较，左侧是用脑脊液做墨汁染色，可见隐球菌的荚膜非常宽大，右侧是用血培养做墨汁染色，可见荚膜较窄。 （六） 组织病理检测 有的病变主要由大量繁殖的隐球菌及其引起的炎性细胞浸润构成。由于隐球菌的荚膜物质有抑制中性粒细胞趋化作用，故浸润的炎性细胞是单核细胞、淋巴细胞和浆细胞。损害显示胶样液化，囊腔内有多量隐球菌。有的病变则表现为肉芽的形成，主要由单核细胞、上皮细胞和多核巨细胞等构成。此时隐球菌数目较少，且大部分被吞噬细胞吞入胞浆内。在新鲜的病灶内，菌体大小不等，小的居多，且容易见到单芽生孢子。在其他病灶内，菌体较大，很少见到芽生状态。