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第第5 5章章 亲和层析亲和层析 一 亲和层析的特点 二 基本原理 三 亲和层析介质及制备 四 亲和吸附层析实验流程 待分离物质与配基专一性结合 分辨率高 操作简 单 通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质 具有浓缩作用 可以从含量很低的溶液中得到高浓 度的样品 有的纯化倍数达几千倍 利用生物学的特异性进行分离 所以分离条件比较 温和 能够很好地保持样品原有的生物学性质 一 生物大分子的识别功能 二 亲和层析原理示意 三 亲和吸附剂结构特点 酶 底物 抑制剂 底物类物 抗体 抗原 病毒 细胞 激素 受体 外源凝集素 糖蛋白 表面受体蛋白 核酸 互补碱基链段 组蛋白 蛋白质的结合部位及各种结合力 有机小分子类主要有苯基类 烷基类 氨基 酸类 核苷酸类等 生物大分子类主要有酶类 抑制剂类 蛋白 质 抗原抗体类等 染料主要有蓝色葡聚糖 荧光染料等 亲和层析介质的配基有很多 归纳起来主亲和层析介质的配基有很多 归纳起来主 要有以下几类 要有以下几类 纤维素 cellulose 葡聚糖凝胶 sephadex 聚丙烯酰胺凝胶 Bio Gel 多孔玻璃 Bio Glass 琼脂糖凝胶 sepharose 聚丙烯酰胺 琼脂糖凝胶 Ultro gel 最常用的几种活化剂 溴化氰 CNBr 环氧氯丙烷 1 4 丁二醚 戊二醛 高碘酸盐等 1 1配基的选择配基的选择 2 2载体的选择载体的选择 3 3活化剂与偶联反应活化剂与偶联反应 4 4封闭封闭 5 5亲和介质的技术指标亲和介质的技术指标 配基必备条件 配基必备条件 能与活化剂的活化基团发生偶联作用 偶联后不影 能与活化剂的活化基团发生偶联作用 偶联后不影 响配基和目标分子的专一结合特性 响配基和目标分子的专一结合特性 专一亲和性要强 能有效地分离目标分子 专一亲和性要强 能有效地分离目标分子 配基与目标分子结合后 在一定条件下能够被解吸 配基与目标分子结合后 在一定条件下能够被解吸 附 且不破坏目标分子的生物活性 附 且不破坏目标分子的生物活性 在分离过程中配基与目标分子无空间阻碍 在分离过程中配基与目标分子无空间阻碍 酶酶 底物 底物类似物 抑制剂 辅因子 辅酶 金属底物 底物类似物 抑制剂 辅因子 辅酶 金属 离子等 离子等 抗体抗体 抗原 病毒 细胞 激素 维生素抗原 病毒 细胞 激素 维生素 受体蛋受体蛋 白 载体蛋白白 载体蛋白 外源凝集素外源凝集素 多糖化合物 糖蛋白 细胞表面受体蛋白 多糖化合物 糖蛋白 细胞表面受体蛋白 细胞细胞 核酸核酸 互补碱基链段 组蛋白 核酸聚合物 核酸结合互补碱基链段 组蛋白 核酸聚合物 核酸结合 蛋白蛋白 理想载体的特性 理想载体的特性 不溶于水 但具有高度亲水性 不溶于水 但具有高度亲水性 具有多孔网状结构和良好的流动性和渗透性 具有多孔网状结构和良好的流动性和渗透性 机械性能良好 在一定静水压下不变形 机械性能良好 在一定静水压下不变形 有足够数量的化学基团与大量的配基相偶联 有足够数量的化学基团与大量的配基相偶联 化学惰性 化学惰性 无或微弱的非特异性吸附作用 无或微弱的非特异性吸附作用 有良好的物理和化学的稳定性 有良好的物理和化学的稳定性 纤维素 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃 琼脂糖凝胶 交联琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺 琼脂糖凝胶 凝胶介质上的羟基容易被多种活化剂活化 凝胶介质上的羟基容易被多种活化剂活化 引入不同的基团 引入不同的基团 具有大孔性和亲水性 凝胶内部的羟基得到 具有大孔性和亲水性 凝胶内部的羟基得到 活化 有较高的活化效率 活化 有较高的活化效率 刚性较好 珠状结构对流动向的阻力最小 刚性较好 珠状结构对流动向的阻力最小 分离效率高 分离效率高 非特异吸附极低 理化性质较稳定 非特异吸附极低 理化性质较稳定 1 1 在较广的在较广的pHpH范围内正常工作范围内正常工作 2 2 对去污剂 解离试剂保持稳定对去污剂 解离试剂保持稳定 3 3 用用0 1mol0 1mol L NaOHL NaOH或或0 1mol0 1mol L HClL HCl处理处理2 2 3h3h不引起凝不引起凝 胶颗粒的变化 胶颗粒的变化 4 4 不被乙醇 丙酮等有机试剂所破坏 不被乙醇 丙酮等有机试剂所破坏 5 5 能耐受能耐受6mol6mol L L盐酸胍或盐酸胍或7 mol7 mol L L尿素处理尿素处理 6 6 吸附剂能够再生并重复使用 吸附剂能够再生并重复使用 以生物大分子为配基的偶联反应以生物大分子为配基的偶联反应 活化载体活化载体 接臂接臂 溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联反应溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联反应 环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基偶联反应环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基偶联反应 长臂长臂 接臂接臂 亲和介质亲和介质 短臂短臂 未接臂未接臂 亲和介质亲和介质 在弱碱性在弱碱性pHpH下过夜或在下过夜或在TrisTris HClHCl缓冲液缓冲液 pH8 pH8 中中2h2h被水解 被水解 加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团 封闭的试剂有乙醇胺 葡萄糖胺 甘氨酸 谷氨酸 甘露封闭的试剂有乙醇胺 葡萄糖胺 甘氨酸 谷氨酸 甘露 糖等 糖等 配基偶联量配基偶联量 mol mol g g 或或 mol mol ml ml 样品吸附量 样品吸附量 mg mg s s或或mgmg ml ml 化学稳定性 化学稳定性抗氧化物 配基不降解 抗氧化物 配基不降解 耐酸碱 耐酸碱如如pH3pH3 1010 1 1 亲和层析实验流程亲和层析实验流程 2 2 吸附条件的选择吸附条件的选择 3 3 洗脱条件的选择洗脱条件的选择 4 4 洗脱方式洗脱方式 5 5 亲和介质的处理亲和介质的处理 6 6 亲和层析介质的保存亲和层析介质的保存 亲和层析 介质 预处理 装柱 平衡与上样品 洗去 未吸附杂质 洗脱 收集洗脱峰 1 1 亲和层析实验流程亲和层析实验流程 层析柱 吸附容量 待分离物质的总量层析柱 吸附容量 待分离物质的总量 平衡缓冲液 平衡缓冲液 pHpH和和pIpI 上样体积 温度和流速等 上样体积 温度和流速等 因素因素 多次吸附 使纯化对象与配基充分作用多次吸附 使纯化对象与配基充分作用 竞争性洗脱竞争性洗脱 离子强度洗脱 离子强度洗脱 pHpH 离子强度洗脱离子强度洗脱 变性剂洗脱 变性剂洗脱 化学断裂 化学断裂 一步洗脱 非选择性洗脱 一步洗脱 非选择性洗脱 分步洗脱 选择性洗脱 分步洗脱 选择性洗脱 梯度洗脱 选择性洗脱 梯度洗脱 选择性洗脱 洗脱液浓度梯度变化洗脱液浓度梯度变化 0 5 1 0 mol L NaCl中性盐处理 除去离子性 较强的杂质 异丙醇处理 除去疏水性较强的杂质 6 mol L 脲处理 除去中性分子杂质 6mol L 盐酸胍处理 除去中性分子杂质 亲和层析介质一般保存于溶胀状态 保存温度4 8 不可冷冻 否则会破坏凝胶的珠状结构 在保存溶 液中加入20 的乙醇或0 02 的硫柳汞以防止长菌 活 化的rhiol Sepharose 4B或thiopropyl Sepharose 6B带 巯基的介质不能用硫柳汞 1 1 样液体积的影响样液体积的影响 2 2 流速的影响流速的影响 3 3 柱长的影响柱长的影响 4 4 温度的影响温度的影响 GSH Sepharose 4B亲和层析 分离谷胱甘肽转硫酶 CHOM Sepharose 4B亲和层析 分离胰蛋白酶 平衡液 平衡液 25mmol25mmol L L磷酸盐缓冲液 磷酸盐缓冲液 pH7 4 pH7 4 含含3mmol3mmol L DTTL DTT 1mmol1mmol L EDTAL EDTA 200mmol200mmol L NaCl L NaCl 洗脱液 洗脱液 25mmol25mmol L L磷酸盐缓冲液 磷酸盐缓冲液 pH7 4 pH7 4 含含3mmol3mmol L GSHL GSH 2mmol2mmol L DTT L DTT 平衡液 平衡液 0 1mol0 1mol L L pH8 0 TrispH8 0 Tris HClHCl缓冲液缓冲液 内含内含0 0 5mol LKCl5mol LKCl 50mmol50mmol L CaClL CaCl2 2 洗脱液 洗脱液 0 1mol0 1mol L L pH2 5 pH2 5 甲酸甲酸 0 5mol0 5mol L KClL KCl溶液溶液 1 1 在亲和层析时 为什么床体积比较小 为什么在此层析在亲和层析时 为什么床体积比较小 为什么在此层析 过程中无亲和力的物质往往只能产生一个层析峰 过程中无亲和力的物质往往只能产生一个层析峰 2 2 简述亲和力层析的分辨率比一般吸附层析高的原因 简述亲和力层析的分辨率比一般吸附