（分析化学专业论文）蛋白质组学分离和鉴定的新技术和新方法.pdf

复口人学博i 论史 摘要 蚩白质组学的研究正在成为分析化学研究领域的最前沿课题 它的内容包括 分离和分析细胞与组织的全部蛋白并直接找到 组或几组功能蛋白 研究它们与 功能基凶 组 的内在联系 目前 蛋白质组学的研究主要集中在通过对蛋白质性 质 丰度的考察来揭示它的功能 进而找到与人类重大疾病相关的差异蛋白 使 之成为诊断 治疗及药物筛选的靶分了 蛋白质组学的科学研究之所以能够取得蓬勃的发展 主要依赖于生物质谱技 术的飞速发展以及高通量分离和分析技术的突破性进步 首先是质谱技术尤其是 纳喷雾技术的发展 使之成为检测微量甚至是痕量蛋白质分子的重要手段 高通 量 高效的分离技术和大规模 高效率 高准确性地鉴定一个组织或细胞乃至亚 细胞中的全部蛋白质以及利用稳定同位素标记方式与多维分离一串级质谱实现大 规模的蛋自质定量分析已经使得质谱成为实现这一目标的核心分析技术 生物信 息学的建立形成了国际性的科学火协作 目前 世界各主要国家都不惜巨资进行 蛋白质组的研究 蛋自质组学研究的进一步深入 将对了解疾病的发生和药物的 筛选起到决定性的作用 本博士学位论文工作是在新建蛋白质组学研究试验室的进程中 研究了生物 质谱在蛋白质组学分析中的应用和联用新技术 新方法 发展了蛋白质及肽的毛 细管电泳分离一质谱在线检测技术 并考察了涂层毛细管的优势 对纳喷雾技术 在质谱中的应用作了深入的研究 提出了利用一个外置的辅助电极柬改善纳喷雾 的新方法 应用两维液相色谱和生物质谱的方法对高转移l c i d 2 0 细胞诱发的裸 鼠肝肿瘤组织进行了蛋白质组学分析 本论文共分四章 主要内容摘要如下 第一章 要综述了蛋白质组学研究中的关键技术 生物质谱以及相关联 用技术的发展和生物质谱在蛋白质组学中的应用 基质辅助激光解吸电离技术和 电喷雾电离技术的问世 质谱的质量分析器的改善 各种分离技术如高效液相色 谱 毛细管电泳等和质谱的联用 微喷雾以及纳喷雾技术的不断发展和完善 稳 定同位素标记技术的发展及应用 使得生物质谱已成为蛋白质组学研究中无可替 代的核心技术平台 生物质谱在对基因工程产物 功能蛋白及疾病相关蛋白的定 性 定量分析中具有无可比拟的优越性 在蛋白的相互作用 蛋白质的折叠等动 复口人学博f 论文 力学过程的研究中具有极大的潜力 第二章叙述建立和系统研究了蛋白质及肽的毛细管电泳分离一质谱在线检测 技术 考察了涂层毛细管的优势 在优化缓冲体系 分离电压等实验条件的基础 土二 对标准蛋白进行了分离鉴定 其检测灵敏度可达到1 0 15 摩尔 达到该技术 目前的先进水甲 肽谱是表征和签定蛋白最常用的方法 利用毛细管区带电泳一 质谱 质谱联用体系 以肌红蛋白为研究对象 建立了肽的电泳分离以及质谱分 析的标准技术 以及毛细管内壁改性的有效方法 实验证明有效的毛细管改性可 以降低吸附 提高分离效率和检测灵敏度 讨论了 些实验条件对肽谱分析的影 响 肽的氨基酸组成 碰撞能量的大小 酶解试剂的选择等 均会影响碎片离子 的丰富状况及质潴信号强度 第三章讨论了纳喷雾技术在质谱中的应用 报道了各类微 纳电喷雾系统的 实验室研制方法和性能评价 分析了标准合成肽段以及蛋白的酶解肽段 结果均 优j 二常规屯喷雾 该j 作在实验室建设初期尚无纳喷雾实验条件的情况下 为实 验室实现微量蛋白质质谱鉴定建立了 个新的技术平台 同时 还通过分析细胞 色素 探讨了质谱条件对存在非共价键的生物分予的影响 拓展了电喷雾质谱在 蛋白质研究中的应用 不但可以测得结合的辅基的化学计量比 还可以通过质谱 图中电荷分布状态的变化研究蛋白质的空间构象的变化 胶内蛋白酶解结合 e s i m s 已经成为鉴定胶内蛋白的常规手段 本工作发展了一种简单易行的在线 除盐 预富集与e s i m s m s 联用的分析技术 肽段提取液可直接加入到在线的纳 喷头中 先用水洗脱盐类及其它杂质后 再用含5 0 乙腈的水溶液将肽段洗脱 直接进行质谱鉴定 相当于 个在线的z i p t i p 技术平台 该方法可以大大减少 其它方法中因为转移而引起的吸附损失 并可以除去样品中杂质盐类 不仅具有 相当好的重现性 还具有一定的浓缩作用 该方法应用于实际蛋白样品的分析鉴 定 具有省时省力 装置简单和操作简便等优点 改进了分析的通量 同时 采 用一种由内置金属钼丝提供电接触的玻璃纳喷雾装置 实验中添加一个外置的辅 助电极可 以进一步稳定纳喷雾的信号 提高纳喷雾的信噪比 辅助电极对纳喷雾 技术改善的研究报道尚属首次 第p q 章介绍了用职维液相色谱技术研究高转移l c i d 2 0 细胞诱发的裸鼠肝 肿瘤组织蛋白质组学 盯癌是影响人类健康的重大疾病 蛋白质组学通过比较正 常和疾病组织或体液得到疾病特异蛋白或相关蛋白 为疾病的诊断和治疗提供潜 在的手段和靶点 传统的双向凝胶电泳在分离和分析高分子量蛋白 极酸和极碱 性蛋白等对象时仍然存在许多难以克服的问题 而基于多维液相色谱一质谱技术 的所谓s h o t g u n 蛋白质组学技术路线正受到越来越多的重视 本文采用两维液相 复丑人学博i 论文 色谱技术 即第一维是强阳离子交换色谱 s c x 第二维是反向液相色谱 h p l c 肽段经液相分离后 直接进行质谱耀定分析 不仅快速高效 自动化程度高 而 且易于操作 尤其是等电点p i 1 l 的极端蛋白 以及分子量大于1 8 0 k d a 和小寸 l o k d a 的蛋白 在传统的双向凝胶电泳技术中无法被鉴定 本工作采用的 多维液相色谱一质谱技术克服了卜述弊病 这一新的技术平台为重大疾病的蛋白 质组学积累了重要的数据和信息 关键词 蛋白质组液相色谱毛细管电泳纳喷雾辅助电极质谱 复旦大学博上论j a b s t r a c t p r o t e o m i c sh a sb e c o m eaf r o n t i a ld i s c i p l i n eo fa n a l y t i c a lc h e m i s t r y p r o t e o m i c s r e f e r st ot h ea n a l y s i so fa l lt h ep r o t e i n se x p r e s s e di nac e l lo rt i s s u e s t u d yo f a f f i l i a t i o nb e t w e e nf u n c t i o n a lp r o t e o m ea n dg e n o m i c si so fg r e a ts i g n i f i c a n c e p r e s e n t l ya p p l i c a t i o nr e s e a r c ho fp r o t e o m i c sr e s e a r c hf o c u s e so nd i f f e r e n t i a lp r o t e o m e a n a l y s i so fh u m a nd i s e a s e s w h i c hi sd e s i g n e dt of i n dk e yp r o t e i n sw i t hp o t e n t i a l st o b eu s e da sm a r k e r sf o rd i a g n o s i so rt a r g e t sf o rm e d i t a t i o n d e v e l o p m e n to fp r o t e o m i c sr e l i e so nt h ea d v a n c e si nh i g ht h r o u g h p u ta n a l y t i c a l t e c h n o l o g i e si n c l u d i n gm u l t i d i m e n s i o n a ls e p a r a t i o n b i o l o g i c a lm a s ss p e c t r o m e t r y a n d b i o i n f o r m a t i c s e l e c t r o s p a ye s p e c i a l l yn a n o e l e c t r o s p a y h a sb e e nt h e k e y t e c h n i q u ei nb i o m s i d e n t i f i c a t i o no fa l lp r o t e i n si n ac e l lo rat i s s u ea n dt h e i r l o c a t i o n si nt h eo r g a n i s ma n df i n d i n go u tt h ek e ym o l e c u l e sb yc o m p a r a t i v ep r o t o m i c s h a sm a d em a s ss p e c t r o m e t r yb e c o m i n go n ec r i t i c a lt o o li np r o t e o m i c ss t u d y t h i sd o c t o r a t ed i s s e r t a t i o ni sc a r r i e do u ti nt h ec o u r s eo ff o u n d a t i o no ft h e r e s e a r c hl a b f o rp r o t e o m i c sa n de s t a b l i s h m e n to fe x p e r i m e n t a lp l a t e f o r m sf o rt h e s t u d y o fp r o t e i na n dp r o t e o m i c sa n a l y s i sa c e m s m st e c h n i q u eh a sb e e nd e v e l o p e d a n dt h em e r i t so ft h ec a p i l l a r yc o a t i n gh a v e b e e nd i s c u s s e d s e v e r a lh o m e m a d em i c r o n a n o e l e c t r o s p r a ye m i t t e r sf o rl a b o r a t o r yu s ew e r ed e s c r i b e d a no n l i n ed e s a l i n a t i o n f o rn a n o s p r a yw a sd e s c r i b e df o rt h ef i r s tt i m e a na u x i l i a r ye l e c t r o d ew a su s e dt o i m p r o v et h ee l e c t r i cf i e l dd i s t r i b u t i o nb e t w e e nt h en e s ie m i t t e ra n dt h em ss a m p l e r s ot h a ts nw a sg r e a t l yi m p r o v e d t h i sd i s s e r t a t i o nc o n s i s t so ff o u rc h a p t e r sa n dt h ec o n t e n t sa r es u m m a r i z e da s f 0 1 1 0 w s i nt h ef i r s tc h a p t e r t h ek e yt e c h n i q u ei nt h ep r o t e o m i c ss t u d y b i o m a s sa n di t s r e l a t e dt e c h n i q u e sa n da p p l i c a t i o n so fb i o m a s si nt h ep r o t e o m i c sh a v eb e e nr e v i e w e d b i o m a s sb e c o m e sm o r ea n dm o r ei m p o r t a n ti np r o t e o m i c sw i t ht h ed e v e l o p m e n to f t h et w os o f ti o n i z a t i o nt e c h n i q u e sn a m e l ye s i a n dm a l d i w i t ht h ei m p r o v e m e n to f t h em a s sa n a l y z e r w i t ht h eh y p h e n a t i o no fh p l ca n dc e w i t ht h ed e v e l o p m e n to f t h em i c r o e l e c t r o s p a ya n dn a n o e l e c t r o s p a y a sw e l la st h ea p p l i c a t i o no fi c a t t h e b i o m a s st e c h n i q u ei sap o t e n t i a lp o w e rt o o lf o rt h es t u d yo ft h ed y n a m i cp r o c e s so f p r o t e i n p r o t e i nr e a c t i o n t h es t r u c t u r eo fg e n e t i cp r o d u c t d i s e a s e sr e l a t e dp r o t e i na n d 4 复旦大学博士论文 f u n c t i o np r o t e i n e s t a b l i s h m e n ta n d s y s t e m a t i cs t u d y o fa no n l i n ec es e p a r a t i o n m s i d e n t i f i c a t i o no fp r o t e i n sa n dp e p t i d e sw a sp r e s e n t e di nt h ec h a p t e rt w o t h ec o a t i n g o fc eh a sa l s ob e e nd i s c u s s e d t h ec z ee x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r sw e r eo p t i m i z e d w i t ht h eu s eo fau vd e t e c t o r d e t e c t i o ns e n s i t i v i t yf o rt h es t a n d a r dp r o t e i n sc a nb e r e a c h e du pt of e t t o m o l el e v e lv i as e p a r a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n as h e a t hf l o wi n t e r f a c e i sc o n s t r u c t e dt oh y p h e n a t ec ea n de s i m s t h ei d e n t i f i c a t i o no fp r o t e i ni sr e a l i z e d b ym s m sa n a l y s i so ft h ed i g e s t e dp e p t i d e sa n dt h e nm a s c o tl i b r a r ys e a r c h m e a n t i m e a l le f f e c t i v ec o a t i n gt e c h n i q u eh a sb e e nd e v e l o p e dt or e d u c et h ea d s o r p t i o n m a di m p r o v et h es e p a r a t i o ne f f i c i e n c y a l s o s o m ef a c t o r si n f l u e n c i n gt h em s m s r e s u l t s s u c ha sp r o t e a s es e l e c t i o n t h ea m i n oa c i dc o m p o n e n t si nt h ep e p t i d ea n d c o l l i s i o ne n e r g ys e l e c t i n ga n ds oo n h a v eb e e nd i s c u s s e d s e v e r a lh o m e m a d em i c r o n a n o e l e c t r o s p r a ye m i t t e r sf o rl a b o r a t o r yu s eh a v eb e e n d e s c r i b e di nt h et h i r dc h a p t e r a l lt h e s et i p sa r ee a s yt of a b r i c a t ea n do p e r a t e t h e s t a n d a r d sh a v eb e e nu s e dt ot e s tt h ep e r f o r m a n c eo ft h e s et i p s c o m p a r e dw i t ht h e c o n v e n t i o n a le l e c t r o s p r a ye m i t t e r t h e s em i c r o n a n o e l e c t r o s p r a ye m i t t e r sh a v eb e e n p r o v e dt oh a v eah i g hs e n s i t i v i t ya n dl o wc o n s u m p t i o n s t a i n l e s ss t e a l s s e m i t t e r 5 0 i t mi d x4 0 0 9 mo d w a si n v e s t i g a t e da sn a n o e l e c t r o s p r a yt i pw h i c he n a b l el o w f l o wr a t ea t10 0n l m i n t h eo f f i i n ep e r f o r m a n c eo fn a n o s p r a yw a sq u i t eg o o dd u r i n g m si d e n t i f i c a t i o no fs t a n d a r d p r o t e i nd i g e s t s t h e r e f o r e s se m i t t e r c a no f f e ra n u m b e ro fd e s i r a b l ef e a t u r e ss u c ha s e a s y t of a b r i c a t e l o wc o s ta sw e l la s c o n v e n i e n c et oo p e r a t ea n dc o u p l i n gt om a s ss p e c t r o m e t e r i nt h em e a n t i m e m s p a r a m e t e r so nt h ec o e x i s t e dn o n c o v a l e n tc o m p l e xh a v eb e e nd i s c u s s e d f u r t h e r m o r e a no n l i n et e c h n i q u eo fd e s a l i n a t i o nf o rn a n o s p r a yh a sb e e ne x p l o i t e df o rt h ef i r s tt i m e t h ef u s e ds i l i c ac a p i l l a r yw a sh e a t e da n ds t r e t c h e dt of o r mas h a r pt i p 1 e s st h a n10 9 m id a n dt h e n5 mc 1 8b o n d e dp o r o u s 3 0 0 ap o r e s w a ss u c c e s s f u l l yp a c k e df o r a b o u t5 m ml o n g t h et r y p s i nd i g e s t e dp e p t i d e sw e r el o a d e do n t ot h ec a p i l l a r y a r e r d e s a l t i n gw i t hw a t e r c o n t a i n i n g0 1 f o r m i ca c i d a n dt h e nf l u s h e dw i t h5 0 w a t e r 5 0 a c e t o n i t r i l e c o n t a i n i n g0 1 f o r m i ca c i d la n dm a d ei tf o rm sa n a l y s i s t r y p t i c i n g e ld i g e s t i o no fb s a h a sb e e ni n t r o d u c e da n dt h em e t h o dw a sp r o v e dt oh a v es o m e a d v a n t a g e ss u c ha se a s yo p e r a t i n ga n dh i g he f f i c i e n c y a na u x i l i a r ye l e c t r o d eh a s b e e nu s e dt om o d i f yt h ee l e c t r i cf i e l dd i s t r i b u t i o nb e t w e e nt h en e s le m i t t e ra n dt h e m ss a m p l e r u s eo ft h ea u x i l i a r ye l e c t r o d eh a sg r e a t l ys t a b i l i z e d t h es i g n a l sa n d i m p r o v e ds nf o rt h en a n o e l e c t r o s p r a y 复旦大学博上论文 i nc h a p t e rf o u r at w o d i m e n s i o n a ls e p a r a t i o nm e t h o dh a sb e e ni n t r o d u c e dt o p r o t e o m i c sa n a l y s i s t h ea l lp r o t e i n sf r o mt i s s u e sh a v eb e e nd i g e s t e da n dt h e n s e p a r a t e db yt h es c xc o l u m nf i r s t t h e ns e p a r a t e db yr p l cc o l u m n f o l l o w e d d e t e c t e db ym s t h em e t h o dw a sp r o v e dt oh a v es o m ea d v a n t a g e ss u c ha se a s y o p e r a t i o na n dh i g he f f i c i e n c y h i g hs p e e dc o m p a r e dw i t h2 dp a g e ag r e a tn u m b e r o fp r o t e i n sw i t he x t r e m em o l e c u l a rw e i g h to re x t r e m ep i w h i c hc a nn o tb ed e t e c t e d b yt h e 2 dp a g e h a v eb e e ni d e n t i f i e di nt h i sw o r k t h e p r e s e n tw o r kh a s a c c u m u l a t e ds ol a r g ea n di m p o r t a n td a t af o rt h ed a t a b a s ef i l ef o rt h ep r o t e o m i c so f s e v e r ed j s e a s e s k e y w o r d s p r o t e o m e i n g e ld i g e s t i o n h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h p l c m a s s s p e c t r o m e t r y c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s c e n a n o e l e c t r o s p r a y a u x i l i a r ye l e c t r o d e 复口大学博十论文 1 研究背景 1 i 蛋白质组学概述 第一章前言 后基冈组学的三大流派 功能基因组学 包括转录r n a 组学 结构基因组 学 包括结构蛋白质组学 和蛋白质组学 包括细胞和药物蛋白质组学 目前 显得相当活跃 功能基因组学的出发点是从功能基因 组 找到对应表达的一组功 能蛋白组 结构基因组学通过大规模的结构测定和生物信息学预测基因与蛋门功 能 而蛋白质组学则从分离和分析细胞与组织的全部蛋白并直接找到 组或几组 功能蛋白 并研究它们与功能基因 组 的内在联系1 1 3 n a t u r e 及相关n a t u r e 生物领域杂志 s c i e n c e 以及其它一些重要杂志 接连f u 登和评论有关蛋白质组 学的文章 表明了蛋白组学成为后荩因组学中的重要组成部份的地位正在得到加 强 4 6 蛋白质组学正在成为本世纪科学研究的前沿 7 8 相对于基罔组的普遍性和均一性 蛋白质组的研究则存在着时间上的特殊性 和空蚓 的多样性 即在同一物种的不同细胞中或同一细胞在不同时期 其蛋白 质组也是在不断的变化的 9 1 从这种意义上说 精确的描述细胞内存在的全部 蛋白质的状态及相关的蛋白质组学是小可能实现的 1 0 目6 口 蛋白质组学的研 究t 要集中存通过对蛋白质性质 丰度的考察来揭示它的功能 进而找到与人类 重大疾病桐天的筹异蛋白 使之成为药物筛选的靶分子 指导基圳组的分析 而 小是仪仪尾随d n a 序列分忻的结果 1 l 1 2 蛋白质组学也正在成为分析化学研究领域的最前沿 表现为匹兹堡分析化 学年会的热点和焦点 13 1 4 而蛋白质组学的科学研究之所以能够取得蓬勃的 发展 主要依赖与高通量分离和分析技术的突破性进步 首先是高效的分离技术 的完善 使得蛋白质的大范围 高通量分析成为可能 1 5 其次是质谱技术尼其 是软电离技术的发展 使之成为检测蛋白质分子的重要手段 最后是生物信息学 的建立使得国际性的科学大协作得以形成 1 6 一1 91 它利用数据库 计算机网络 和应用软件 进行巨量生物信息资源的收集 共享 研究和丌发 在蛋白质组的 研究中f 益成为强力的支撑 目前 世界各主要国家都不惜巨资的进行蛋白质组 复旦人学博 1 论文 的研究 建立了越来越多的蛋白质组数据库 蛋白质的分离和检测技术亦在不断 的完善 2 0 2 1 蛋白质组学研究的进一步深入 将对了解疾病的发生和药物的 筛选起到决定性的作用 2 2 2 3 1 2 蛋白质组学的技术进展 1 2 1 双向凝胶电泳 双向电泳的广义定义是样品进行电泳后 为了不同的目的在它的垂直方向再 进行一次电泳 目前双向电泳大都是指第一向为等电聚焦 等电点信息 第二向 为s d s p a g e 电泳 分子量信息 样品经过电荷和质量两次分离后 可以得到分 子的等电点和分子量的信息 一次双向电泳可以分离几千甚至上万个蛋白 这是 目i f 所有电泳技术中分辨率最高 信息量最多的技术 早期双向电泳中第一向用载体两性电解质产生p h 梯度 但等点聚焦时易因 阴极漂移而丢失碱性蛋白 而且载体两性电解质p h 梯度不稳定 受电场和时间 影响大 重复性不好 1 9 8 2 年 等电聚焦技术采用固相p h 介质在凝胶聚合时产 生p h 梯度 不受重水化 脱水和电场作用的影响 p h 梯度非常稳定 i p g 允许 的上样量可高达 5 m g 平衡时蛋白不易洗脱 易于向第二向转移 由于 p g 大 大改善了双向电泳的分辨率 重复性和上样量 使得双向电泳真j 下成为了蛋白组 分析的支撑技术 但是双向电泳技术仍然存在许多严重的不足 憎水性蛋白 如 膜蛋白 难溶于样品缓冲液 高分子量蛋白 极酸和极碱性蛋白易在电泳过程中 丢失 低拷贝蛋白无法检测 重现性依然不能令人满意 定量误差大 步骤繁琐 费时费力 需要受过专f 3 i j i 练的技术人员等等 目前对双向电泳技术的改进主要集中在憎水性蛋白样品制各 分离能力的改 善 以及染色方法等方面 h e r b e r t 2 9 和c h e v a l l e t 3 0 等人尝试了用不同的 表面活性剂增加憎水性蛋白的溶解性 为了分离复杂蛋白样品和低拷贝蛋白 发 展了窄i p g 技术 3 1 即把i p g 胶条的p h 梯度范围缩小至卜1 5p h 提高了等 点聚焦的分辨率 避免了p i 点接近的多个蛋白在电泳图上形成一个点从而给蛋 白鉴定带来困难 另外窄i p g 提高了上样量 因此有利于低拷贝蛋白的检测 对于强碱性蛋白 如核糖体和核蛋白 已经可以用p h 梯度为1 0 一1 2 和9 一1 2 的 p g 得到重复性较好的双向电泳图 3 2 为了得到细胞或组织整个蛋白质组的 概貌 g o r g 3 3 3 4 等尝试了用宽范围i p g p h 范围为3 一1 2 对细胞和组织的 提取液以及t c a 丙酮沉淀蛋白进行了分离 得到了令人满意的结果 k 1c s e 报道 了用增加分离距离的方法提高双向电泳的分辨能力 3 5 2 4 c m 长的 p g 胶条已 经得到成功应用 3 3 用2 4 c m 的窄 p g 可以得到非常高的分辨力 复e l 大学博i 论文 双向电泳通常用考玛斯亮兰染色或用银盐染色 但这两种方法各有不足 考 玛斯亮兰染色灵敏度较低 而银染色线性范围窄 重复性差 荧光染色是较新的 一种染色方法 其原理是使蛋白与荧光试剂反应 在特定波长紫外光照射下 即 可通过蛋白点发出的荧光检测 荧光染色与考玛斯亮兰染色或银染色相比有明显 优势 它的灵敏度与银染相似但速度快得多 仅需要约3 0 m i n 且不需要固定 蛋白 这为后续的蛋白酶解或印迹带来很大方便 另外 荧光染色的线性范围较 宽 定量结果较可靠 常用的荧光染色剂有m d p f 和s y p r o 等 近年来在这方面 有许多卓有成效的工作 3 6 3 9 1 2 2 生物质谱 生物质谱在最近2 0 年间得到了迅猛发展 由于具有迅速 灵敏 准确的优 点 并能进行蛋白序列分析和翻译后修饰分析 质谱已经被公认为蛋白质组学中 分析与鉴定肽和蛋白的最重要的手段 生物质谱技术在离子化方法上主要有两种软电离技术 即基质辅助激光解吸 电离 m a l d i 和电喷雾电离 e s i e s i 质谱的重大进展是纳电喷雾 n a n o e le c t r o s p r a yi o n i z a t i o n n e s i 4 0 由m a n n 在1 9 9 4 年提出 4 1 j 纳电喷雾技术使用纳升流速 提高了质谱分析的灵敏度 使极微量样品的分析成 为可能 4 2 纳喷雾技术己发展和高效液相色普 4 3 以及毛细管电泳技术 4 4 4 5 在线连用 用于鉴定微量甚至是痕量的样品 b a t e m a n 等采用涂层毛细管区带电 泳和纳喷雾技术联用分析鉴定了糖蛋白的修饰位点 4 6 4 7 m a l d i 的延时抽取 d e a y e de x t r a c t i o n 技术 4 8 使质谱分析分辨率大为改善 若与反射t o f 技术相结合 在常规分析中质量准确度可达到几个p p m 利用反射m a l d i t o f 可进行源后裂解 p o s t s o u r s ed e c a y p s d 从而获得更多的肽序列信息 针 对m a l d i 在蛋白测序方面的不足 c h a i t 4 9 发展了一种 蛋白阶梯测序 法 p r o t e i n1 a d d e rs e q u e n c i n g 即通过对e d m a n 降解法的改进 产生一系列切 去n 端残基的肽段 用m a l d i 测其质量从而推测n 端序列 k e o u g h 等 5 0 报道 了一种巧妙的方法来增加 i a l d i 谱图的序列信息 他们利用一种肽段衍生化方法 在肽段的c 端加上一个带负电的基团 这样m a l dr 产生的单电荷肽离子中将包含 两个质子 一个位于c 末端残基上 另一个则具有很大的灵活性 可以引发肽骨 架的多种断裂方式 软电离技术的出现大大的拓展了质谱的应用空间 而质量分析器的改善也极 大的推动了质谱仪器技术的发展 对于生物质谱来说 最重要的性能是灵敏度 分辨率 质量精度和串级质谱能力 生物质谱的质量分析器主要有四类 四微杆 q u a d r u p e ll c 离子阱 i o i lt r a p i t 飞行时削 t o f 和付 l n f 变换离子回 旋其振 f o u r i e rt f a n s f o r mi o nc y c l o i r o nr e s o n a n c e f t c r 复口1 人学博士论文 离子阱质谱灵敏度较高 性能稳定 具备多级质谱能力 因此被广泛应用于 蛋白质组学研究 但它的质量精度较低则是一个明显的不足 最近发展起来的线 性 或称两维 离子阱与传统的三维离子阱不同 离子可储存在一个圆柱状的空间 内 从而显著改善了离子阱质谱的灵敏度 分辨率和质量精度 5 1 飞行时间 t o f 质谱和基质辅助激光解吸电离源联用分析肽段的精确质量 它可测的分子量高达3 0 万 对盐和表面活性剂有较强耐受力 适合高通量分析 因此在利用肽指纹图谱高通量鉴定蛋白方面有极其广泛的应用 该技术对于基因 组较小或序列已知的生物物种尤其有效 近年来新型的质谱技术层出不穷 对蛋 白组学研究产生了潜在的深远影响 m a l d i q t o f 这一先进平台的出现 为自 动化高通量的应用提供了广阔的f 景 q t o f 优异的质量精度 灵敏度和碰撞辅 助电离 c a d 能力改善了数据库搜索结果 并使其成为d ei o v o 测序的有力工 具 5 2 m e d z i h r a d s z k y 等发展了m a l d i t o f t o f 技术 5 3 该技术有着m a l d i q t o f 的许多优点 而且尤其擅长高能量c i d 和高速扫描 t o f t o f 质谱尤其擅 长高能量c i d 和高速扫描 其获得c d 谱图的速度比离子阱或四极杆质谱快一个 数量级 它们得到的碎片离子图通常碎裂更充分 可提供更多的信息 多级质谱仪器 如三级四极杆 离子阱和最近出现的三级四极杆一飞行时间 q t o f 质谱 常采用电喷雾接口与液相色谱联用 分析肽碎片离子谱 然后 通过序列数据库搜索鉴定蛋白 采用仪器控制的程序自动选择合适的肽离子进行 碰撞诱导电离 c i d 是多级质谱仪器的一个发展趋势 对蛋白组学来说 傅立叶变换离子回旋共振 f t i c r 质谱是一种较新的技 术 它可以提供极高的灵敏度和分辨率 质量准确度可优于i p p m 这使得它可 以在一次分析中对数百个完整蛋白的分子进行质量测定和定量 5 4 g o o d l e t t 等 j 5 的工作表明通过f t m s 测得的单个肽段的精确质量 结合其他一些限制条 件 即可通过序列数据库搜索鉴定蛋白 1 2 3 二维谱新技术 传统的凝胶电泳法的灵敏度已经有了巨大的发展 但仍很难将细胞组织内 的多种痕量调控蛋白分离显示出来 而部分的膜蛋白不溶于样品缓冲液 亦难于 从胶上洗脱下来 且此法重现性差 操作复杂 而l c c e 等高效分离技术分离 度商 耗样量少 且易于和质谱检测技术实现在线联用 已成为生物大分子快速 分离鉴定的有利工具 5 6 5 7 色谱技术近年来有了飞速的发展 亲和色谱 反 向色谱等技术随着色谱柱技术的完善 其分离时间和分离效率均有显著的改善 b a n k s 等以反相色谱 梯度洗脱的方式 3 5 秒内完成了对6 种标准肽的分离 并 利用液相色谱 质谱联用技术在3 5 分钟内完成了多肽的分离和鉴定 5 8 t m nl o u l a k i s 等综述了液相色谱 质潜联用技术在蛋白质的氨基酸鉴定中的应 复咀大学博十论文 用 5 9 j 毛细管电泳是另一种高效的分离技术 因其分离度高 分离速度快且易于 和e s i m s 实现在线连接 在蛋白质分析中的应用极为广泛 h e n i o n 等详细论述 了c e m s 的技术实现及实际应用 6 0 c e m s 的接口技术不断完善 6 卜6 4 离 线的 0 f f 一1 i l i e c e m s 技术亦有了明显的进步 6 5 6 6 在毛细管电泳分离模 式中 电渗流的控制对于电泳分离至关重要 6 7 电泳缓冲液中表面活性剂的存 在可以减少蛋白质分子和毛细管壁的吸附作用 并且易于灵活地选择分离模式 目前 较常用的是s d s 6 8 但s d s 的加入 却大大降低了质谱检测的蛋白质信 号 is h i h a m a 等以全氟辛酸 全氟辛烷磺酸作为c e 的表面活性剂 不仅取得了 好的分辨率 亦保证了较好的质谱检测信号 6 9 确定蛋白质分子的性质 尤其是面对其复杂多交的翻译后修饰作用 就使 得一维的分离手段显得力不从心 h a n c o a k 等探讨了以h p l c h p c e 两维分离技 术 m s 检测的方法用于蛋白质的研究 7 0 胡i 有用两维液相色谱联用分离蛋白 质 m s 在线检测 7 1 两维分离的结果明显优于一维 在复杂的生物大分子的 分析中具有应用前景 毛细管等电聚焦电泳一电喷雾质谱己被认为是取代二维 疑 胶电泳法的最有效技术 7 2 肽段的两维 强阳离子交换 反相色谱 7 3 7 4 和三维 强阳离子交换 抗生物素蛋白 反相色谱 7 5 色谱分离体系是目前最 为常用的多维分离技术 y a t e s 7 6 等采用多维色谱s c x r p l c 一 i s 联用技术一次 实验得到1 4 8 4 个酶母蛋白 弥补了双向电泳的不足 发现了蛋白质量大于 1 8 0 k d a 小于i o k d a 以及p i 小于4 3 和p i 大于1 1 的蛋白 混和物中一些低丰 度蛋白也得到了鉴定 图l 给出了常用的两维l c m s 方法的示意图 d i n a t u r a t o dp r o t e i nc o m p l e x 墼2 d chro二matographic c o m p u c a t l o n 谢 a n i a t l o n 0 u n c l n d 5 5s p e c t dt od l n l n o a c i d q u o n c e su i l n qc j g n o m i c s 日q u e n c e i i d n t l f l e dd o t 0 i n i nc o m p k x 妇瓣 塞一 复目大学博j 论立 f i g u r e1 m u l t i d i m e n s i o n a lp r o t e i ni d e n t i f i c a t i o nt e c h n o l o g y m u d p i t c o m p l e x p e p t i d em i x t u r e sf r o md i f i e r e n tf r a c t i o n so fal s c e r e v i s i a ew h o l e c e l ll y s a t ew e r e l o a d e ds e p a r a t e l yo n t oab i p h a s i cm i c r o c a p i l l a r yc o l u m np a c k e dw i t hs t r o n gc a t i o n e x c h a n g e s c x a n dr e v e r s e p h a s e r p m a t e r i a l s a f t e rl o a d i n gt h ec o m p l e xp e p t i d e m i x t u r ei n t ot h em i c r o c a p i l l a r