产脂肪酶的微生物研究进展.doc

产脂肪酶细菌的筛选与鉴定姓名：范丽萍 学号：0911040203 班级：生09级6班前言 1.脂肪酶的简介 脂肪酶(Lipase，EC3113，甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶u J。在动植物体和微生物中普遍存在，它是一类特殊的酯键水解酶，催化如下反应：甘油三酯+水=甘油+游离脂肪酸。它的另一重要特征是只作用于异相系统，即在油(或脂)一水界面上作用，对均匀分散的或水溶性底物无作用即使作用也极缓慢，因此脂肪酶也可说是专门在异相系统或水不溶性系统的油(脂)一水界面上水解酯的酶。 2.微生物产脂肪酶的研究历程脂肪酶是最早研究的酶类之一(见表1)。从1834年兔胰脂肪酶活性的报道至如今的微生物脂肪酶已有上百年的历史。微生物发酵法的应用前景要远远大于提取法及化学合成法。如今，黑曲霉、白地霉、毛霉等微生物来源的酶已制成结晶。根霉、圆柱假丝酵母、德氏根霉、多球、，粘质色杆菌等也得到高度提纯，并对它们的理化性质1开展进一步研究。早在60年代，假丝酵母2、曲霉、根霉等菌产生的脂肪酶相继在日本进入商品生产(见表2)。我国60年代也已开展脂肪酶的研究开发。1967年，中科院微生物所筛选到解脂假丝酵母(Candida lipolytica)AS21203并于1969年制成酶制剂供应市场。表1 常见的产脂肪酶的徽生物 菌 名 黑曲霉荧光假单胞菌白地霉无根根霉毛霉圆柱假丝酵母巢子须霉德氏根霉多球菌棉毛状酶圆弧青霉粘质色杆菌表2 常见商品酶enzymeabbreviationmanufacturerCandida cylindracesCCSigina,amanoAspergillus nigerANAmino,flukaRhisopus delemarRDamano 就微生物脂肪酶而言，虽然在产酶菌株选育、培养条件、酶的性质及工业应用上已研究了几十年，但由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、酶的来源不足、提纯困难以及应用范围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多。因此在微生物产脂肪酶方面还有很大的研究空间，本实验主要就是通过对微生物的培养，筛选出产脂肪酶活力高的细菌。3.微生物产脂肪酶的用途微生物脂肪酶的应用虽不如淀粉酶，蛋白酶广泛，但在许多方面已显示出不可估量的开发潜力。比如脂肪酶食品的加工、乳制品的生产以及在食品添加剂的工业生产中都有着不可估量的价值1。又比如脂肪酶在纺织物的应用方面2也具有一定的贡献。 4.国内外微生物脂肪酶的最新研究进展3 微生物脂肪醇是一种重要的工业酶类，也是当前国内外研究的热点。 （1）在食品工业中的应用脂肪酶现已用于奶制品，如奶酪、奶油和人造黄油的增香。因为奶制品中的香味是牛奶中的脂肪、蛋白质和乳糖代谢的产物，因此，脂肪酶和蛋白酶被广泛地用于加快奶酪的熟化和香味的产生。用脂肪酶处理过的奶制品比未处理的具有更好的香味和可接受性4。除奶制品外，脂肪酶也用于改善稻米和酒精饮料的香味，如在酒精饮料的发酵过程中加入一定量的低温脂肪酶5，产品具有类似奶酪的香味。脂肪酶还用于无脂肪肉的生产，如在鱼加工过程中脂肪的去除是用脂肪酶来完成的。另外，在生面团中加入脂肪酶使三甘酯部分水解而增加单甘酯的含量可延缓腐败，单甘酯和双甘酯的形成也使蛋白的起泡性质得到改善6。（2）环境治理方面的应用 每年由于各种原因排入海中的石油达200万t，如不及时处理，不仅会造成鱼类的大量死亡，而且石油中的有害物质也会通过食物链进人人体。人们用含有脂肪酶及其它成分的复合制剂处理海中的石油，可以将石油降解成适合微生物的营养成分，为浮在油表面的细菌提供优良的养料，使得分解石油的细菌迅速繁殖，以达到快速降解石油的目的。脂肪酶生物技术应用于被污染环境的修复以及废物处理是个新兴的领域。石油开采和炼制过程中产生的油泄漏，脂加工过程中产生的含脂废物以及饮食业产生的废物，都可以用不同来源的脂酶进行有效的处理。酶法生产生物柴油7日益受到人们的青睐，可利用餐饮业废油脂和工业废油脂为原料，变废为宝的同时降低了生物柴油的生产成本8。（3）脂肪酶在奶酪、面包中的应用9 脂肪酶可用于改良食品风味。在适当条件下，脂肪酶生成短链脂肪酸酯、乙醇、丙酮、乙醛、二甲硫醚及低级脂肪酸等风味成分，增强食品香味。如在奶酪生产中，脂肪酶将脂肪降解为游离脂肪酸，游离脂肪酸分解形成有挥发性的脂肪酸，异戊醛，二乙酰，3羟基丁酮等呈味物质，改善了奶酪风味，并产生特殊香味。脂肪酶还能催化脂肪释放中链脂肪酸产生爽滑感。释放出游离脂肪酸参与化学反应，诱发合成乙酰乙酸、p一酮类酸、甲基酮、香味酯和内酯等香味成分10。 （4）脂肪酶在生物传感器中的应用 用脂肪酶的催化特性研制生物传感器逐渐受到关注。固定在pH或氧化电极的脂肪酶联合葡萄糖氧化酶可作为脂质生物传感器，测定甘油三酯、血胆固醇含量。 （5）脂肪水解方面的应用 水解反应是指脂肪酶催化脂肪或酯，将其水解为脂肪酸和甘油或醇。脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的水解反应，利用脂肪酶水解油脂的能力可获得重要的轻化工原料脂肪酸和甘油。用于这种目的脂肪酶11包括来自Candida rli osa，Pseudomonashuorescen和蓖麻种子(castorbean)等的脂肪酶研究。水解的底物包括各种植物油，如大豆油、蓖麻油、橄榄油等；动物油如牛脂、羊脂和鱼油及各种油的酯类。（6）脂肪酸的提纯方面的应用 Hoshino等研制了一种富集n-3多不饱和脂肪酸的三甘酯的生物反应器，利用Aniger和Crugosa、Brassica napu岱脂肪酶不与多不饱和脂肪酸(PuFA)，如R-亚油酸和二十二烷酸作用，而与其它脂肪酸作用使其优先被释放出来的性质，可制备PUFA含量高的甘油酯。用Rarrhzus水解茴香油制备岩芹酸(顺式一6一十八烯酸)是完全可能的，因它对这种酸具有高选择性。（7）手性化合物合成中的应用 脂肪酶催化具有高底物专一性、区域选择性或对映选择性等优点，使其成为有机合成中重要的生物催化剂。脂肪酶催化合成手性化合物的基本类型有两个：（1)前手性底物的反应；(2)外消旋化合物的拆分旧。催化的底物已由传统的前手性或手性醇和羧酸酯扩展到二醇、二酯、内酯、胺、二胺、胺基醇、Ct或B羟基酸，因此，大多数重要的功能有机化合物原则上都可被脂肪酶催化立体选择性地制备。典型的生物催化剂包括细菌脂肪酶，如Paeruginosa、Pfluorescens、Pseudomonas、Bcepacia、Cviscosum、Bacillus subtilis、Achromobacter sp、Alcaligenes和Serratia marcescens以及来自真菌的Cantarctica B和Crugosa.5. 微生物脂肪酶的前景与展望12 脂肪酶来源不同，导致结构和性质的多样性、不稳定性，使脂肪酶研究进展较慢。固定化脂肪酶可重复利用，提高酶稳定性、有利于实现工业化生产，降低生产成本。目前，脂肪酶固定化因其经济性和技术可靠性，离产业化还有相当大的差距，需对脂肪酶载体、固定化技术作深入研究。今后，脂肪酶研究需生物遗传、生物化工、仪器分析、食品工程等领域的研究人员通力合作， 筛选新的工业脂肪酶菌株，以解决工业生产和保护环境问题。实验目的 1.掌握产脂肪酶细菌的筛选鉴定方法。 2.筛选出产脂肪酶活性高的细菌，将其确定到种。实验意义 1.筛选出的产脂肪酶活性高的细菌，将其用于实际生产中。四实验器材显微镜 载玻片 接种环 酒精灯 高压蒸汽灭菌锅 超净工作台 热鼓风干燥箱 恒温磁力搅拌器 离心机 热恒温水箱 精密电子天平 隔水式电热恒温培养箱 便携式pH计 三角瓶（带棉塞） 移液管 天平（带砝码） 钥匙称量纸 三角瓶 培养皿 涂布器 试管 游标卡尺 接种环五试剂及药品5.1 培养基成分及配制方法1. 富集培养基：酵母粉02，Na2HPO4 35，K2HP04 15，MgS047H20 05，NaCl 05，橄榄油100，pH70 2牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏0.3g ，蛋白胨1.0g，氯化钠 0.5g，琼脂 1.5g， 水 100ml橄榄油 0.05 溴甲酚紫在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用记号笔在烧杯外作上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.27.6, 再加入15%琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水，分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌30分钟。 3.复筛培养基：A.种子培养基：1蛋白胨，05酵母粉，05橄榄油，005MgSO47H2O，0.2K2HPO4，调pH值至70，乳化分装灭菌。B.初始发酵培养基：1蛋白胨，05酵母粉，1蔗糖，1橄榄油，02K2HPO4 0.05MgSO47H20，001CaCl2，1吐温80，0001FeS047H20，调pH值至70，乳化分装灭菌4. LB液体培养基酵母膏5gL，蛋白胨lOgL，NaCI lOgL用6molL Na2CO3调至pH90.5. VP试验培养基蛋白胨05，葡萄糖05，K2HPO4 0.05，pH7.274。每管分装45ml。6. 硝酸盐还原试验培养基牛肉膏3g，蛋白胨lOg，NaCI 5g，KNO3 lg，水1000ml，PH776硝酸盐显色液：A液：对氨基苯磺酸05g，稀醋酸(10左右)150ml，B液：a一萘胺01g，蒸馏水20ml，稀醋酸(10左右)150ml7. 脲酶检测培养基蛋白胨1g，NaCI 5g，葡萄糖lg，K2HPO4 2g， 0.2酚红水溶液6ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，115.C蒸汽灭菌30min后调pH至6869使培养基呈橘黄色，微带粉红，20的尿素过滤灭菌后和冷却至5055的基础培养基混合，使其终浓度为2，摆成较大斜面。8. 葡萄糖氧化发酵试验培养基蛋白胨2g，葡萄糖lOg，1溴百里酚蓝水溶液3ml(先用95乙醇溶解后，再加水配成1水溶液)，NaCI 59，KH2PO 40.2g，琼脂6g，蒸馏水1000ml，pH7072.9. 明胶液化试验培养基蛋白胨O5，明胶1015，pH7274，灭菌后用试管分装，培养基高度约为45cm.10. 甲基红试验培养基蛋白胨O5，葡萄糖05，K：HPO。005，pH7274。每管分装45ml.11.半固体培养基酵母膏05，蛋白栋10，NaCI 1O，琼脂05，用lmolLNaOH调至pH7.012.菌体运动性试验培养基蛋白胨05，明胶56。pH7274，灭菌后分装试管，培养基高度约为45cm。5.2 常用用储存液及配制方法(1)lmolL HCl：取862ml浓盐酸加入到900ml蒸馏水中，定容为1L。(2)lmolL NaOH：称取40Og NaOH溶于900ml蒸馏水中，定容为1L。(3)6molL Na2CO3：称取318Og Na2CO3，溶于400ml蒸馏水中，完全溶解后用蒸馏水定容为500ml，分装，高压灭菌。 (5)05罗丹明溶液：称取05g罗丹明溶解在lOOml重蒸水中。(6)橄榄油聚乙烯醇乳化液：称取18g聚乙烯醇，溶于90ml水中，用1molL NaOH溶液调至pH90，再加入30ml橄榄油，10000rmin搅拌乳化5分钟，使之成为稳定均匀的乳化液(7)革兰氏染色液：结晶紫染色液：称取20g结晶紫，08g草酸铵溶于20ml 95乙醇中，再加入80ml重蒸水浑匀，静置48h过滤使用。碘液： 先用5ml重蒸水溶解20g碘化钾，再加入10g碘片，待碘片全溶解后，加重蒸水稀释至300ml。番红复染液： 称取05g番红，溶于25番红的乙醇溶液20ml与80ml蒸馏水中。（8）溴甲酚紫(1.6%)的配制:溴甲酚紫1.6g溶于100ml乙醇（是95%的乙醇？）中，贮存于棕色瓶中保存备用。用作培养指示剂时，每1000ml培养基中加入1ml 1.6%溴甲酚紫。六实验步骤1.土壤的采集本实验是从绵阳师范学院食堂的排污口采集土壤样品。共6份。2.土壤菌悬液的制备及富集降每份土样称取2 g，加入到20 mL灭活的无菌水中，震荡15min后静止30min，取1mL上清液加入到30mL富集培养基中，30。C下200 rmin摇床培养48 h，再取1 mL加入到30mL新的富集培养基中，同等条件下重复培养2次。3.菌种的初筛将富集培养液用无菌水进行梯度稀释，各取200uL 10-5、10-6和10-7 3个梯度的稀释液涂布于三丁酸甘油酯筛选平板上，28下培养23 d后，挑选有明显水解圈的菌落，平板划线法接种到新的初筛平板上，同样条件下培养2-3 d 。培养基 500ml，并加入0.5ml的溴甲酚紫和橄榄油乳化液12ml（橄榄油：20g/L，聚乙烯醇（PVA）为1:3，转速10000r/min,5min或是将2%的聚乙烯醇与橄榄油按体积3:1超声波混匀， 121湿热灭菌20min）。试管9支、涂布器一支、移液管10ml的一支，250ml蒸馏水，培养皿48个（因为要做10-5、10-6、10-7、四个梯度，每个梯度有三个对照、共有四种菌）然后进行高压灭菌处理。 4.菌种的复筛挑取有水解圈的单菌落接种于种子培养基，30下200 rmin摇床培养24h，按10体积接种于基础发酵培养基，30140r/min摇床培养40 h后，无菌操作条件下，挑取筛选的菌株，接种于发酵培养基中，置于30摇床中培养48h。 5.酶活的测定14挑取平板上经复筛后的细菌，接种于LB液体培养基中，30培养48h后，离心去菌体，测定发酵液的上清酶活性。原理：脂肪酶在一定条件下将甘油三酯水解，在不同水解阶段可释放出脂肪酸，甘油二酯，甘油单酯及甘油。水解释放出的脂肪酸可用标准碱液滴定，以此表示酶活力。酶活力单位(u)“定义为：在一定条件下，以每分钟分解底物(橄榄油)释放出lumol游离脂肪酸所需酶量定义为1个脂肪酶活力单位，国际单位(1u)，以lum1表示。试剂：(1)反应底物乳化液的制备：称取308聚乙烯醇(PVA)，加900ml水，加热溶解，冷却后用6molL氢氧化钠调至pH为90，过滤，定容为1000m1量取上述PVA溶液150ml，加入橄榄油50ml，用高速组织捣碎机搅拌6min，4000rmin，前后各3min，间隔5min，液备用。(2)0.05molL甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液的制备：称取1.889甘氨酸，加入约480mL水溶解，用6molL氢氧化钠调节pH至9.0，再定容为500ml，备用。需新鲜配置。(3)0.05molL氢氧化钠溶液的制备：取4.589固体氢氧化钠溶于lL水中，用邻苯二甲酸氢钾标定，使用时再稀释一倍。(4)1酚酞作指示剂，95乙醇作反应终止剂。测定方法：在三角瓶中加入5ml缓冲溶液和4ml乳化液，放入40。C恒温水浴锅中，再加入酶液反应并计时，一定时间(10min或30min)后终止反应，用0.05molL氢氧化钠滴定游离出的脂肪酸，同时做空白样(先加终止剂，后加酶液，其余同样品操作)计算：酶活力(U)=(V2-V1)Nt其中：v2为样品消耗碱的体积(m1)V1为空白消耗碱的体积(m1)t为反应时间(min)N为稀释倍数，这里N=50，50为1mlO.05molL氢氧化钠的微摩尔数5.菌种的鉴定与对筛选出来的菌株进行纯培养，然后对其进行形态学上的观察，通过形态特征初步判断所筛选的菌株属于哪一类微生物，然后根据此依据对其进行相应的生理生化等方面的鉴定。其具体过程如下所示：将产脂肪酶活力较高的菌落划线在LB培养基上30,1-2天。观察单菌落形态，并在电子显微镜下观察细菌的细胞形态参照伯杰氏细菌鉴定手册12（第8版） 工业微生物实用技术手册 进行生理生化鉴定。1.细菌形态的显微观察(1)制片制片要采用干净的载玻片，用接种环挑菌体涂布到载玻片上。操作时需注意接种环的无菌操作，注意菌体量适中。(2)固定涂片后最好先在室温下自然干燥，然后固定。固定常用高温。手执载玻片一侧，标本面朝上，在火焰外层快速来回通过34次。共约34s，要求载玻片表面温度不超过60。C，此时以手背皮肤接触，不觉烫为度。放置待冷后染色。(3)染色标本固定以后，滴加结晶紫染色液，使整个标本固定在染色液中。染色时间为13min。(4)水洗与干燥染色时间一到，用细小的缓流水将多余染料从标本上洗去，洗净后，将标本置桌上风干，也可用吸水纸轻轻吸去水分。有时也可微微加热，待干后再镜检。(4)显微镜观察菌体形态。细菌的生理生化鉴定1）革兰氏染色13A 制片制片要采用干净的载玻片，并注意接种环的无菌操作。做斜面菌体时，要防止菌体和水混合不均匀有结团现象，注意菌体量适中。B 固定涂片后最好先在室温下自然干燥，然后固定。固定常用高温。手执载玻片一侧，标本面朝上，在火焰外层快速来回通过34次a共约34s，要求载玻片表面温度不超过60。C，此时以手背皮肤接触，不觉烫为度。放置待冷后染色。C 媒染与染色标本固定以后，滴加结晶紫染色液，使整个标本固定在染色液中。染色时间视标本与染料的性质而定，一般染色时间为23min，用水洗。碘液作用1min，水洗，吸干。D 脱色与复染A用95乙醇或丙酮乙醇溶液脱色，流滴到脱色液为无色，约30秒。B脱色后需再用蕃红液染色23min。E 水洗与干燥染色时间一到，用细小的水缓缓流滴将多余染料从标本上洗去。洗净后，将标本置桌上风干，也可用吸水纸轻轻吸去水分。有时也可微微加热，待干后再镜检。(2) 过氧化氢酶试验A接种于LB斜面培养基上，30培养24小时B滴加3双氧水于斜面培养基上，若有气泡为阳性。(3) V-P试验A接种于VP斜面培养基上于30下培养。B培养2、4、9天后观察，若仍为阴性，可适当延长培养时间。C取培养液和40氢氧化钠等量混合，加入少许肌酸，lOmin后如培养液显红色，则VP为阳性，有时需放置更长时间才出现红色反应。(4) 硝酸盐还原试验A将测定菌接种于硝酸盐还原液体培养基中，置室温培养l、3、5天，另两管不接种作对照。B倒出少许l、3、5天液体培养基，再各加一滴A液和B液。C如溶液变为红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性；如无红色可再加一滴二苯胺试剂，如呈蓝色则无硝酸盐还原作用，否则按硝酸盐还原阳性处理。(5) 脲酶检测试验A. 接种于脲酶检测培养基斜面上，于30培养。B. 分别于2h、4h过夜观察，培养基变桃红色为阳性，不变者为阴性，阴性结果要观察4天。(6) 葡萄糖氧化发酵试验A. 将灭菌的葡萄糖氧化发酵培养基分装到试管中，然后穿刺接种。B. 每株鉴定菌种分别接种4支试管，其中两支试管用经过高温灭菌的凡士林一石蜡油(含23的凡士林和13的液体石蜡)液封，以隔绝空气。另外两支试管不液封，同时需准备两支未接种的试管，一支用凡士林一石蜡 油液封，另外一支不液封，以做空白对照。C. 室温培养I、2、3、7、14天观察结果。D. 结果检查：a.只有开管产酸变黄的为氧化型。b.开管、闭管均产酸变黄的为发酵型。(7) 明胶液化试验A.取培养1824小时的明胶液化培养基作穿刺接种，于20下培养，有两支不接种作为空白对照。B.培养2、7、10、14和30天的试管，在20以下观察菌的生长情况和明胶是否融化。菌生长，明胶表面无凹陷，且为稳定的凝块，则为明胶水解阴性；如明胶凝块部分或全部在20以下变为可流动的液体，则表明明胶水解阳性；如菌己生长，明胶未液化，但明胶表面菌落下出现凹陷，也被认为是轻度水解，按阳性处理；若细胞未生长，可能是不能在明胶培养基上生长，或是基础培养基不适合。(8) 甲基红试验A.接种于甲基红试验培养基，30下培养。B.培养2、4、9天后观察，若仍为阴性，可适当延长培养时问。c.在培养基中加入一滴甲基红试剂，如果显红色，则为MR阳性，如黄色则为阴性。(9) 菌体运动性试验A.接种针穿刺接种于半固体培养基内，30下培养。B.培养l、2、3后观察，细菌的运动性可用透射光目测。C.如果细菌只沿着穿刺线生长，则没有运动性。若有细菌(非气泡)存在穿刺线周围，说明细菌有运动性。(10) 好氧性测试A.将菌种穿刺接种在半固体培养基内，30下培养。B.培养3天后观察，细菌的好氧性可以用透射光目测。C.若菌体只在培养基表面和穿刺线上段出现，则属于好氧菌。若菌体生长物在穿刺线上生长良好，属于兼性厌氧菌。如果菌体沿穿刺线向培养基内生长，则属于厌氧菌。参考文献1 纵伟.董海丽. 脂肪酶及其在食品工业中的应