伊布利特对家兔左心室肌细胞快钠通道跨壁异质性的影响.doc

摘要】 目的 探讨伊布利特（ibutilide）对家兔心室肌细胞快钠通道电流(INa)跨壁异质性的影响。方法 30只兔随机分为3组：正常对照组、10-7mol/L和10-6mol/L伊布利特组。用膜片钳技术研究各组左室3层心肌细胞INa的改变。结果 正常对照组左室3层细胞的INa存在跨壁异质性,中层心肌(M)细胞的峰值INa是心内膜层(Endo)和心外膜层(Epi)的2倍多;M细胞的INa失活最快；两个伊布利特组3层细胞的INa密度下降,以M细胞变化最显著；INa稳态失活曲线均左移,以M细胞变化最显著;失活后恢复曲线均恢复减慢。结论 左室心肌细胞的INa存在跨壁异质性；伊布利特可减弱INa的跨壁异质性。 【关键词】 伊布利特 心室肌细胞 异质性 膜片钳 快钠通道伊布利特(ibutilide)是一种国内新近推出的速效、安全的3类抗心律失常药物。它即是肾上腺素能受体拮抗剂的同系物，又是一种甲基磺胺类化合物,主要用于快速转复心房颤动/心房扑动。其作用机制与其他的3类抗心律失常药物不同，更与其他类抗心律失常药作用机制不同1。近期动物试验已证实，伊布利特对抑制室性心律失常也有作用2。本研究采用酶解法分离左室单个心外膜、心内膜和中层心室肌细胞，应用膜片钳全细胞记录方法，研究3层心室肌细胞快钠通道电流(INa)的活性，并对应用伊布利特干预后INa 特性的变化进行系统观察，为临床应用伊布利特治疗室性心律失常提供理论基础。1 材料与方法1.1 实验动物 新西兰纯种大耳白兔30只,由华北制药厂实验动物中心提供,雌雄不拘,体重1.52.0 kg,随机分为3组：正常对照组（con）、10-7mol/L伊布利特组(10-7)、10-6mol/L伊布利特组(10-6)。1.2 液体配制 无钙台氏液(mmol/L):NaCl 140，NaHCO3 11.9，KCl 5.4，MgCl2 0.53，NaHPO4 0.33，HEPES 5，葡萄糖10,用NaOH调节pH至7.3。含酶液：无钙台氏液中加入0.4 g/L胶原酶I和0.7 g/L牛血清白蛋白。KB液(mmol/L):KOH 70，KCl 40，KH2PO4 20，L谷氨酸50，牛磺酸20，EGTA 0.5，HEPES 10，葡萄糖 10,用KOH调节pH至7.3。INa电极内液(mmol/L):CsCl 130，MgCl2 2，NaCl 10，HEPES 10,用CsOH调节pH至7.3。INa电极外液(mmol/L):氯化胆碱100，NaCl 50，MgCl2 2，HEPES 10,葡萄糖10,用NaOH调节pH至7.3。胶原酶、HEPES、BSA等由Sigma公司生产,余为国产分析纯。1.3 单细胞分离 猛击兔头颅枕部致昏迷，迅速开胸取心脏，置于冰冷的无钙台氏液中，剪去心包，心脏经修饰后连接在Langendorff心脏灌流装置上，经主动脉根部逆行用无钙台氏液灌流(灌注压70 mmHg，恒温36)10 min。用含酶液灌流1620 min，至心脏膨大、松弛后从灌流装置上取下。用眼科剪分别剪取左室游离壁心内膜下1.5 mm和左室游离壁心外膜下1.5 mm的组织，剩余中间部分以外科手术刀片刮除残余心内膜和外膜细胞后为中层细胞。将之分别剪碎，置于KB液中搅拌，整个搅拌过程保持恒温36并充O2。取细胞悬液置于KB液中保存，1 h后细胞膜状态恢复，即可备用。1.4 细胞封接与全细胞记录模式的建立 按文献3的方法建立全细胞膜片钳记录模式。实验在室温(2025)下进行,细胞破膜后稳定2 min开始记录电流。1.5 细胞膜电容的记录 通道信号经HEKA EPC9膜片钳放大器放大,电流信号由pulse+pulsefit 8.53软件控制,细胞封接时由软件自动测量细胞膜电容值。1.6 INa电流记录1.6.1 电流电压曲线 从维持电位(HP)-140 mV,阶跃+10 mV,从-80 mV逐步去极化到+60 mV,刺激频率1 Hz,钳制时间50 ms。为消除细胞间误差,电流值以电流幅值与膜电容相比即电流密度(pA/pF)表示,以不同钳制电压下的INa峰电流密度绘成电流电压(IV)曲线。1.6.2 稳态失活曲线 采用双脉冲刺激法,HP=-120 mV,条件脉冲-160-40 mV,钳制时间1 000 ms,阶跃+10 mV,每次条件脉冲后紧跟一固定的去极化到-20 mV的测试脉冲,持续时间50 ms,刺激频率1 Hz。将记录的INa与最大激活时的INa之比,与相应的条件脉冲膜电位作图得钠通道失活曲线,并通过Pulse+Pulsefit软件用Boltzmann方程自动计算出INa半数失活电压(V0.5)。1.6.3 失活后再恢复曲线 采用双脉冲刺激法。第1个脉冲(即条件脉冲)HP=-80 mV,去极化到-20 mV,持续时间50 ms；在第1个脉冲回到HP后不同时间间隔给予第2个脉冲(即测试脉冲)去极化到-20 mV,持续时间50 ms；第2个脉冲与第1个脉冲的时间间隔开始为5 ms,增量为10 ms，逐级递增至145 ms,刺激频率1 Hz。以测试脉冲与条件脉冲的INa之比与相应的时间间隔作图,得钠通道失活后再恢复过程曲线。1.7 统计学处理 数据以xs表示,用SPSS10.0软件进行处理,组间均数比较采用方差分析。2 结 果2.1 层细胞的膜电容 对照组的Epi、Endo和M的膜电容分别为（13823）pF(n=10 cells)，（12120）pF(n=10 cells)和（15946）pF(n=10 cells),10-7组的Epi、Endo和M的膜电容分别为（15025）pF(n=11 cells)、（13423）pF(n=11 cells)和(18151) pF(n=11 cells)，10-6组的Epi、Endo和M的膜电容分别为（14522）pF(n=10 cells)、（12724）pF(n=10 cells)和（17647）pF(n=10 cells)，3组各层细胞比较无统计学意义（P0.05）。2.2 3层细胞的INaIV曲线的变化 3组左室3层细胞所记录INa电流的变化见图1。可见组间各层细胞的INa电流幅度依次减低。3组左室3层心肌细胞INaIV曲线的变化见图2。可见3组INa IV曲线均在-70 mV激活,-20 mV达峰值,+60 mV时反转。3组的INa IV曲线形态轨迹均一致,组间各层细胞的INa峰值电流密度依次降低。3组中M细胞的IV曲线最低,Endo和Epi依次升高。对照组INa峰值电流密度在M细胞与Epi和Endo之间比较差异有统计学意义(P0.01),而Epi和Endo之间比较无统计学差异(P0.05),两个伊布利特组3层细胞之间的INa峰值电流密度无统计学差异(P0.05)。2.3 3层细胞的INa稳态失活曲线的变化 3组左室3层细胞的INa电压依赖性稳态失活曲线的变化见图3。组间各层心肌细胞的稳态失活曲线呈左移趋势。正常对照组中M细胞的INa稳态失活曲线在最左边,说明M细胞的INa失活最快。3组心肌细胞的V0.5在M细胞与Epi和Endo比较有统计学差异(P0.05),而Epi和Endo比较无统计学差异(P0.05)。以上各组数据见表1。2.4 3层细胞的INa失活后恢复曲线的影响 3组3层细胞的INa失活后再恢复过程原始电流图见图4，INa失活后再恢复曲线的变化见图5。两个伊布利特组与正常对照组3层细胞组间比较在45、95和145 ms恢复减慢,差异有统计学意义(P0.05)，伊布利特两组之间各层比较差异也有统计学意义（P0.05）。表1 对照组、10-7组、10-6组之间INa、V0.5比较3 讨 论快钠通道是快反应心肌膜上重要的离子通道,是病理情况下产生心律失常的重要原因之一。文献报道,M细胞有较大的0相最大上升速率(Vmax),并间接推论M细胞的INa较Endo和Epi细胞大4,本研究结果表明,兔左室游离壁3层细胞之间M细胞较Epi、Endo有更大的INa。M细胞的峰值钠电流密度达Epi和Endo的2倍以上,与文献推论一致4。本研究还发现,正常情况下,M细胞的INa失活最快，INa灭活后再恢复过程曲线3层心肌细胞间差异无统计学意义。本实验中两个伊布利特组3层细胞INa IV曲线及INa峰值电流密度较正常对照组均下降，而3层细胞INa峰值电流密度之间无差异，提示伊布利特使Vmax下降显著，延长了传导时间。稳态失活曲线常用来说明通道失活的电压依赖性及药物对通道失活过程的影响，伊布利特使曲线左移，表明药物电压依赖性地影响通道的灭活过程，提示药物与失活态的钠通道有较高的亲和力5。伊布利特组3层心肌细胞的INa失活后再恢复曲线明显减慢，而3层细胞之间差异无统计学意义。10-6组较10-7组对快钠离子通道的抑制程度大，说明伊布利特对快钠离子通道的抑制作用在一定范围内呈浓度依赖性。伊布利特对M细胞INa IV曲线和稳态失活曲线作用较显著，并均一的延缓3层细胞快钠通道的失活后再恢复，从而减弱3层细胞电生理的异质性。有关室性心律失常如室性心动过速（VT）、心室颤动（VF）的机制，目前尚不完全清楚，可能与早后除极（EAD）引起的触发活动和折返活动有关6。伊布利特使心室肌细胞INa峰值电流密度降低，INNa的下降必然使Vmax下降2，从而使动作电位幅度降低。Vmax和动作电位幅度的降低延长心室肌有效不应期、动作电位时程和QT间期，使传导减慢，故对室性心律失常起抑制作用，可抑制心室颤动和室性心动过速的发生，并降低除颤阈值2。本实验观察了伊布利特对兔心室肌细胞快钠通道的作用，揭示了伊布利特除具有类抗心律失常药物的延长心肌细胞复极过程，从而延长动作电位时程作用外，还可抑制心室肌细胞快钠通道影响除极过程，具有类抗心律失常药物的作用，拓宽了伊布利特抗心律失常作用的范围。参考文献：1 金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮158例疗效观察J;广东医学;1997年10期 2 董新亭,李卫莉,张随学;自拟粉刺消治疗痤疮126例J;中国中医药科技;1999年06期 3 查旭山,陈修飏;寻常痤疮治疗体会J;江西中医药;/xyfm/class/.2002年05期 4 张随学 ,谭正辉 ,孙叶梅 ,李梅 ,俞玉芳 ,韩峰;3003例痤疮患者特征分析与控制对策J;中华医学美学美容杂志;/xyfm/class/.2002年06期 5 刘勇,王冬梅;痤疮的药物治疗J;临床医药实践杂志;2003年09期 6 高宜云;痤疮从肝论治J;中医药临床杂志;2004年03期 7 欧其平,林维山;中西医结合治疗痤疮J;中华皮肤科杂志;2004年09期 8 陈五一;痤疮辨治体会J;世界中医药;/yisheng/main/index.php.2007年03期 9 雷放;中药热敷治疗痤疮有效J;新中医;/book/main/index.php.1992年09期 10 李东华;异维生素A酸治疗痤疮J;新医学/;1993年10期 11 黄灿奇;针刺联合中药内服外敷治疗青少年痤疮临床观察D;南方医科大学;2011年 12 陈志彬;中医综合疗法对女性痤疮患者皮肤生理指标影响研究D;广州中医药大学;2011年 13 陈传伟;针刺干预慢性疲劳综合征的临床及作用机理研究D;广州中医药大学;2010年 14 Hamid Abdi;针刺对伊朗肥胖者的体重及抗热休克蛋白27、60、65、70的影响D;北京中医药大学;/book/main/index.php.2010年 15 陈玉骐;背俞穴刺络放血治疗痤疮的临床研究D;广州中医药大学;2009年 16 张随学;电针镇痛的脑功能磁共振初步研究D;复旦大学;2005年 17 庞莹;痤疮的流行病学及与雄激素受体基因多态性的相关研究D;中国医科大学;2008年 18 申鹏飞;“醒脑开窍”针刺方法治疗卒中后抑郁症基础