微生物蛋白质组学

微生物蛋白质组学 蛋白质组学 猪瘟病毒感染蛋白质组学研究 病毒感染蛋白质组学研究进展 第一部分 蛋白质组学 Wilkins于1994年提出蛋白质组概念 蛋白质组比较公认的定义 基因组编码的全部蛋白质 蛋白质组内的蛋白质数目等于基因组内编码蛋白质的基因数目 在一个细胞中 并不是所有基因都是同时表达的 因此 一个细胞的蛋白质组中蛋白质数目少于基因组中基因的数目 另一方面 从基因可变剪切和蛋白质修饰的角度看 蛋白质数目又远远多于基因组中基因的数目 蛋白质组的概念 蛋白质组学的概念 蛋白质组学是研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学 旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及其功能模式 其内容包括鉴定蛋白质的表达 存在方式 修饰方式 结构 功能和相互作用等 蛋白质组学与传统的蛋白质研究不同之处 蛋白质组学研究是在生物体或细胞的整体蛋白质水平上进行的 从一个机体或细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和阐明生命活动的基本规律 蛋白质组研究的意义 蛋白质是生理功能的执行者 是生命现象的直接体现者 对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制 蛋白质本身的存在方式和活动规律 如翻译后修饰 蛋白质间的相互作用以及蛋白质构象等问题仍需要直接对蛋白质的研究来解决 蛋白质组学的特点与难点 蛋白质组与基因组的区别与联系 同一性与多样性 基因组作为遗传信息的载体 其最主要的特征就是同一性 对单细胞生物而言 不论在什么条件下 其基因组始终是不变的 对多细胞生物而言 同一个个体的基因组不论是在不同的发育阶段或不同种类的细胞是同样的 蛋白质是生命活动的主要执行者和体现者 对于不同类型的细胞或同一细胞在不同的活动状态下 蛋白质组的构成是不一样的 有限与无限 对基因组而言 不同物种的基因组 不论其大小 其核甘酸的数量是一定的 明确的 对蛋白质组而言 一个细胞或生命体蛋白质的种类究竟是多少则很难确定 细胞内的大部分蛋白质通常被进行过翻译后修饰 如磷酸化 糖基化 酰基化等 修饰过的蛋白质具有其特定的物理化学性质和生物学功能 对蛋白质修饰的研究构成了蛋白质组学的一个分支 修饰蛋白质组学 如果说表达的蛋白质的种类可以根据基因的数目来确定 那么修饰形成的蛋白质种类只有依靠对蛋白质的直接研究来决定 而这种研究是没有止境的 因为蛋白质的修饰与生命的活动密切相关 从这种意义上来讲 对基因组核甘酸序列的测定是一种 有限 的工作 而对蛋白质组的蛋白质种类的确定则是一种 无限 的工作 蛋白质组学与基因组学的区别与联系 静态与动态 一个个体的基因组自个体诞生到死亡 始终保持不变 而作为新陈代谢的主要执行者的蛋白质组 在个体的生命活动中却总是变动不停 人们可以通过确定变化的蛋白质来理解其功能 因此 蛋白质研究的一个重要任务是 找出蛋白质组里发生了变化的蛋白质 生命活动中的蛋白质可大致分为两类 一类是比较稳定的 如负责细胞各种结构组成的蛋白质 一类是随细胞的活动和状态发生量或质变化的蛋白质 如负责信号转导或细胞活动调控的蛋白质 在这种意义上 人们把以研究蛋白质变化为主的蛋白质组学称为功能蛋白质组学 其主要是比较在不同生长状态下或病理状态下的同一种细胞或组织的蛋白质组内的差异蛋白质 与此相对应 测定一个细胞或组织含有的全部蛋白质种类的研究就是通常所说的蛋白质组学 蛋白质组学与基因组学的区别与联系 时间与空间 DNA通常位于细胞核内 且保持稳定 因此测定基因组的DNA序列不受时空影响 对于转录的mRNA来说 时间是主要的参考因素 在发育的不同阶段或细胞的不同活动时期 mRNA的表达是不一样的 因此 在研究转录组或基因芯片时必须考虑到时间 但通常不需考虑空间的影响 在蛋白质组的研究中 不仅要考虑时间的因素 更要考虑空间的影响 首先 不同的蛋白质分布在细胞的不同部位 其功能与其空间定位密切相关 其次 许多蛋白质在细胞里不是静止不动的 它们在细胞里常常通过在不同的亚细胞环境里的运动发挥作用 如细胞的信号传导和转录调控也常常依赖于蛋白质在空间位置的变化和运动 因此 蛋白质组学中又派生了一个与空间紧密相关的新研究领域 亚细胞蛋白质组学 这种亚细胞蛋白质组可能是细胞器蛋白质组 如高尔基体蛋白质组 也可能比细胞器还要小的组分 如核膜 孤立行为与相互作用 基因组的基因表达的各种mRNA是彼此孤立的 互不干扰 蛋白质彼此间有着广泛的相互作用 不存在不与其他蛋白质发生作用的 孤立蛋白质 蛋白质的功能实现离不开蛋白质与蛋白质或蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用 蛋白质组研究的一个主要内容是研究大规模的蛋白质的相互作用 相互作用组 相互作用组研究可分为两类 研究蛋白质相互作用的网络 酵母双杂交 噬菌体显示和蛋白质芯片技术研究蛋白质复合体组成的分析 包括结构型的蛋白质复合体 如核孔复合体 这一类比较稳定 另一种则是功能型蛋白质复合体 如负责转录的转录蛋白复合体或负责DNA复制的复制蛋白复合体 这类复合体只有在执行功能时才聚合在一起 因此很不稳定 单一手段与多种技术 基因组既无量的变化 也没有质的变化 在基因组研究中 DNA测序技术是一个最基本和最主要的工具 蛋白质组研究技术的难度远远大于基因组研究技术 可简单地分为两大类 第一类是蛋白质的分离技术 包括双向电泳技术 细胞的分级分离技术 亲和层析技术等蛋白质组研究技术等 蛋白质组分离面临着蛋白的量和质两方面的难点 第二类是蛋白质组的鉴定技术 其核心是质谱技术 现有鉴定技术面临的最大问题是 它们都依赖于已知的蛋白质或基因的序列作为检测的基础 通过比较来确定待测定的蛋白质 对于在已有的数据库中没有记载的全新蛋白质进行 从头测定 是一个很困难的任务 总之 蛋白质组对技术的依赖和要求远远超过基因组学 蛋白质组学的发展是受技术限制的 也是受技术推动的 互补与互助 在后基因组时代 蛋白质组研究和基因组研究依然是形影相随的两个重要领域 基因组与蛋白质组之间既为互相补充又能互相帮助 mRNA是介于基因和蛋白质之间的中间产物 因为mRNA既是基因的产物 又比蛋白质要容易分析 所以 研究mRNA的表达模式也是了解基因组和蛋白质组的一个重要途径 由此专门形成了一个新的研究领域 转录组 研究转录组的主要手段是基因芯片技术 SAGE 基因表达序列分析 技术 蛋白质组的许多工作也离不开对基因组的研究 在蛋白质组的相互作用研究中表现尤为突出 双杂交技术 噬菌体显示技术等就是以基因组数据和技术为基础的 蛋白质组学技术 蛋白质分离 蛋白质鉴定 生物信息学 蛋白质序列数据库 蛋白质功能数据库等 基于凝胶 非凝胶 双向电泳 2DE 微流芯片 多维色谱 毛细管等电聚焦 质谱技术 三大支柱 双向电泳和差异凝胶电泳 双向电泳 Twodimensionelctrophresis 2DE 是根据不同蛋白质等电点和分子量的不同利用第一向等电聚焦和第二向SDS PAGE电泳将蛋白质混合物中的各种蛋白分离开 差异凝胶电泳 differentialgelelectrophoresis DIGE 是在2DE基础上建立的蛋白质分离技术 该方法将待比较的两个样品蛋白质分别用不同的荧光染料 Cy2 Cy3 Cy5 进行标记后 等量混合再进行双向电泳 由于荧光染料的发光波长不同 可以在一块凝胶上检测两个样品 并通过蛋白点不同荧光信号间的比率确定蛋白量的差异 凝胶分离技术 蛋白质分离技术 色谱与质谱联用技术 色谱与质谱联用就是将蛋白质混合物通过液相色谱分离并收集样品中的特定组分 然后再借助质谱进行分析 获得特定蛋白质的分子量信息并对蛋白质进行鉴定 目前 液相色谱串联质谱联用 反相液相色谱 离子交换色谱 反相液相色谱 串联质谱三维联用等色谱与质谱联用技术已广泛用于蛋白质组学研究 非凝胶分离技术 蛋白质芯片与质谱联用技术 表面增强激光解析电离质谱 surfaceenhancedlaserdesorptionionization massspectrometry SELDI MS 就是将蛋白质芯片与质谱相结合的蛋白质图谱分析技术 该技术可直接将血清 尿液 组织提取物等蛋白质混合物与不同化学表面 疏水 亲水 阳离子 阴离子 金属离子螯合 和生物表面 抗原 抗体 受体 配体 DNA 蛋白质 的蛋白质芯片相结合而将蛋白质分离 然后用SELDI MS对分离的蛋白质进行鉴定 根据质谱图可得到蛋白的分子量及相对强度 分析不同样品的差异蛋白 与2DE相比 该方法可以检测到低丰度的蛋白质 需时短并适于微量样品的分析 非凝胶分离技术 生物质谱技术与蛋白质鉴定 在蛋白质组学研究流程中 蛋白质的鉴定是最关键的一环 蛋白质鉴定的主流技术就是生物质谱技术 就技术而言 蛋白质研究技术比核酸研究技术要相对复杂和困难得多 不仅氨基酸残基种类远远多于核苷酸残基 而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰如磷酸化 糖基化等 这给分离分析带来很多困难 20世纪80年代末在生物大分子领域得以广泛应用的质谱技术则与Edman降解氨基酸测序使蛋白质一级结构得以阐明 NMR的出现推进了对蛋白质溶液构象的解释一样 是蛋白质研究领域的里程碑 对蛋白质和多肽而言 质谱技术就是要确定一个蛋白质或多肽的分子质量 分子质量是一个蛋白质 多肽或氨基酸最基本的特征 这种特征是专一的 不同的氨基酸组成 不同的氨基酸序列 不同的修饰方式 不同的蛋白质间结合方式 不同的位点差异都可以在蛋白质的分子质量上得以体现 对蛋白质以及组成蛋白质的多肽 氨基酸的分子质量测定实际上就是对蛋白质种类和性质的鉴定 质谱技术的基本原理是样品分子离子化后 根据不同离子间质荷比 m z 的差异来分离并确定分子质量 一台质谱仪一般由进样装置 离子化源 质量分析器 离子检测器和数据分析系统组成 其中 离子化源和质量分析器是两个中心部件 不同类型的质谱仪主要就是根据这两个部件命名的 飞行时间质谱 TOFMS 由离子源 S 引出极 漂移区 D 和检测器组成 当离子在离子源内形成后在离子源内电场E的作用下进入无场漂移区 在理想状态下 所有进入漂移区的离子具有相同的动能 KE 测定离子在漂移区内的飞行时间即可计算出它的质荷比 基质辅助激光解吸离子化是将样品均匀包埋在固体基质 a 氰基 4 羟肉桂酸 中 基质吸收激光提供的能量而蒸发 携带部分样品分子进入气相 并将一部分能量传递给样品分子使其离子化 基质辅助激光解析离子化质谱仪 MALDI TOF TOF MS 检测器 加速电压 引出极 漂移管D 离子源 D S 飞行时间质谱示意图 质谱法结合数据库检索对多肽和蛋白质进行鉴定 这一方法的理论基础是认为每个蛋白质经过酶解成为长短不一的肽段后 同一时间获得所有肽段分子质量而形成一个肽段分子质量图谱 这一图谱对蛋白质应是专一而特异的 因此肽质量指纹图谱 peptidemassfingerprinting PMF 这一方法不需对图进行人工解析 只需将实验获得的PMF与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF比对 就可以鉴定该蛋白质 因此比传统方法速度快 通量高 是最早用于大规模蛋白质鉴定的质谱方法 也是目前最简便的蛋白质鉴定方法之一 双向电泳 制备原则 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 包括多数疏水性蛋白 且制备方法应具有可重现性 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰 如酶性或化学性降解等 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白 从而保证待研究蛋白的可检测性 双向电泳分析中的样品制备 制备原则 双向凝胶电泳第一向为等电聚焦 IEF 根据蛋白质等电点进行分离 第二向为SDS凝胶电泳 SDS PAGE 根据蛋白质的相对分子质量进行分离 所以 在样品制备过程中 一切影响等电聚焦和凝胶电泳的因素都应该考虑在内 有效的可重复的样品制备是双向电泳成功的关键 可溶性样品 固体组织样品 细胞 不同样品的基本处理方法 样品的分级处理通过采用亚细胞分级 液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理 可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质 当前最简单有效的处理是采用分级抽提 按样品溶解度不同进行分离 样品的溶解 溶解的目标 1 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏 从而形成各个多肽的溶解液 否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2 DE中出现新的蛋白点 相应的表示单个多肽的点的强度会下降 2 溶解方法必须去除可能干扰2 DE分离的盐 脂类 多糖和核酸等物质 3 溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态 是2 DE成功分离蛋白质的最关键因素之一 增加样品溶解性的手段 为获得最佳的双向电泳分离结果 样品一般使用促溶剂 去污剂 还原剂 IPG缓冲液和两性电解质等将其变性并充分溶解 变性剂 尿素和硫尿是最常用的变性剂 其主要作用是改变氢键或次级键的结构 使蛋白质充分伸展 将其疏水中心完全暴露 降低接近疏水残基的能量域 使得蛋白质变性并使蛋白酶失活 硫脲和尿素联合使用 可大大增加蛋白质的溶解性 特别是膜蛋白的溶解性 硫脲和尿素有效地破坏了疏水键 防止了聚集作用和二级结构的形成 聚集作用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性 表面活性剂 经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团 表面活性剂的作用主要是破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用 提高蛋白质的溶解性 防止等电聚焦时析出 原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型 这样才不会影响蛋白质迁移到它们各自的等电点位置 离子型去污剂SDS不利于等电聚焦 但是SDS缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降解 并提高了蛋白质的溶解性 特别是膜蛋白的溶解性 所以一般只用于样品处理的初级阶段 浓度不高于0 3 时 对等电聚焦不会产生太大影响 非离子型去污剂TritonX 100和NP 40以前应用较多 现多用兼性离子去污剂CHAPS CHAPS比其他去污剂溶解疏水性氨基酸残基的能力更强 其使用浓度一般在1 2 还原剂 在变性剂和表面活性剂联用条件下 加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全 溶解更彻底 还原剂主要用来断裂蛋白质分子中半胱氨酸残基之间形成的二硫键 增加蛋白质的溶解性 常用含自由巯基的DTT或 巯基乙醇 以及不带电荷的三丁基膦 TBP 进行还原 其中DTT是使用比较广泛的还原剂 在50mmol L时能有效地还原大部分的二硫键 起载体作用的两性电解质 即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下 某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态 否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀 Carrierampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分 从而保证蛋白质的溶解性 吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子 离心时还有助于核酸的沉淀 应用时 两性电解质的浓度应小于0 2 w v 浓度过高会使IEF的速度降低 另外 为了保证实验的精确性 在选择不同pH范围的IPG胶条时 也应使两性电解质的pH值与之相符合 样品液的准备 标准液 SuggestedBio lyteampholytecompositionforIPGuse Multiplechaotropicagentsolutionpreparation Multiplesurfactantsolutionpreparation 样品中核酸的去除 对电泳的影响 增加样品粘度 与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹 解决方法 用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解 或是利用合成载体两性电解质 SCA 同核酸结合形成复合物的能力 再通过超速离心来去除复合物 亚蛋白质组样品的制备 用超离心技术分离出细胞器 质膜和细胞核等成分 再用适当的蛋白质溶解液进行溶解 其优点是不仅大大减少样品的复杂性 而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位 但该法需要专业仪器 有时会出现假阳性 亚蛋白质组样品的制备 顺序抽提法 根据细胞蛋白溶解性的差异 用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法 第一步 用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白 第二步 把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取高疏水性蛋白 第三步 用含复合表面活性剂的蛋白溶解液 最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11 W W 特殊样品的制备 低丰度蛋白的分离 尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量 但同时增加了高丰度蛋白的负荷 且造成蛋白的叠加效应而影响分离 现常用预分级 窄pH胶的微制备技术进行分离 即将总蛋白组分成蛋白质组亚群 再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离 强碱性蛋白质 如核糖体 的处理 先将蛋白预处理以富集 再用特殊pH梯度的IPG胶条 如pH3 12 4 12或10 12 进行等电聚焦 其中窄范围碱性IPG胶 如pH10 12 的挑战是克服反向 阴极向阳极 电渗流和水平条纹模式 而宽范围的碱性IPG胶 如pH3 12 4 12 等消除了窄范围胶所需要的专门水化液 极端分子量的蛋白质 小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG 2D上不易看到 这可能是在Tris glycine缓冲液中 样品和游离的dodelcylsulfateions持续积累浓缩 与小分子量的蛋白质发生对流混合 产生茸毛状的或模糊的带 从而降低小蛋白的分辨率 在胶底端 高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难 至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下 蛋白质复合物变成了多肽 或者可能是大分子 一维固相pH梯度等电聚焦 IEFwithIPG 蛋白质是带有电荷的两性生物大分子 其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化 一维固相pH梯度等电聚焦 IEFwithIPG 等电聚焦 IEF 电泳就是在凝胶中加入两性电解质 从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度 处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动 最后各自停留在其等电点的位置上 测出蛋白分子聚焦位置的pH值 便可以得到它的等电点 一维固相pH梯度等电聚焦 IEFwithIPG 一维固相pH梯度等电聚焦 IEFwithIPG IPG ImmobilizedpHGradient IPG 胶的材料是Immobilines 为拥有CH2 CH CO NH R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列 其中R包含羧基或叔氨基团 它们构成了分布在pH3 10不同值的缓冲体系 根据公布的配方计算后 将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合 在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度 通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用 因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态 IPG胶的重泡涨 2 DE样品 重泡涨溶液 重泡涨溶液 8M尿素2 NP 40或CHAPS2 IPG缓冲液 两亲性电解液 0 28 DTT微量溴酚蓝 IPG胶条支架 IPG胶条定位 泡胀的实质 是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内 从而能进行接下来的IEF 蛋白载样量 影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括 待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度样品的复杂度复杂度较高的样品 为了尽可能的了解所包含的每种蛋白 需要反复实验才能完成 如果将待检样品被富集以后则更易分析 IPG胶条的pH范围 IPG胶条的蛋白质大约载样量 不同长度 多种窄pH范围胶条可选 尤其是1个pH范围 pH7 11NL碱性胶条 IPGIEF中pH梯度的选择 IPGIEF中pH梯度的选择 常用方法 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长 预试验确定 宽pH梯度用于 全部蛋白 确定感兴趣蛋白的大致位置 窄pH梯度用于 提高分辨率增加载样能力以检测 分析更多蛋白 IPG水化上样 杯上样 纸桥上样杯上样 有些情况下 需要在水化之后加样 然后立即进行IEF电泳 例如 如果担心发生蛋白质水解或其他蛋白质修饰 样本经过过夜的水化过程就不合适了 使用碱性ImmobilineDryStrip凝胶时 阳极样本杯上样可改善双向电泳斑点图像 纸桥上样 纸桥上样适合于非常大量的样本和制备电泳 特别是采用碱性pH范围时 IPGphor包括半导体温控系统 20 C 和程序化电源 10000V 可同时进行12根胶条的等电聚焦 聚焦效果以 Vh 数控制 可提高重复性 IEF电泳 聚焦时间的优化 理论上讲 要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间 聚焦时间太短 会导致水平和垂直条纹的出现 过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移 但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出 电渗 而造成蛋白图谱变性 在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失 最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品 上样量 pH范围和胶条长度通过经验来确定 IEF的基本条件 Stemp1 Stemp2 Stemp3 total voltage Time Volt Hours Ramp 250 20min Linear 4000 4000 2hr 10 000V hr Linear Rapid 5hr 14 000V hr 7cm Stemp1 Stemp2 Stemp3 total total Stemp1 Stemp2 Stemp3 11cm 17cm 250 250 8000 10000 10000 8000 20min 20min 2 5hr 2 5hr 20 000V hr 40 000V hr 30 000V hr 50 000V hr 5 3hr 7hr Linear Linear Linear Linear Rapid Rapid 两维间的平衡 一维结束后可马上进行二维电泳 也可保存在两片塑料膜间于 80 保存数月 但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡 以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合 从而在SDS PAGE是电泳能顺利进行 建议方案是 用含2 m v SDS 1 m v DTT 6mM尿素和30 甘油的50mMTris pH8 8 缓冲液先平衡15min 再用5 m v 碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15min 第一步DTT平衡 使变性的非烷基化蛋白处于还原状态 1x15min 1 DTT 第二步碘乙酰胺平衡 去除多余的DTT 防止拖尾 1x15min 2 5 iodoacetamide 二维SDS PAGE 同普通SDS PAGE类似 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶 因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩 可以认为非限制性IEF胶 低浓度丙烯酰胺胶 充当了浓缩胶 二维SDS PAGE 低熔点琼脂糖 SealtheCassetteandFixtheIPGStripwithAgarose InsertingtheCassette 聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测 理想显色剂的7S安全 safety 灵敏 sensitivity 简单 simplicity 特异性 specificity 快速 speed 稳定 stability 兼容性 synergy 有机染料和银染 考染灵敏度为30 100ng 线性范围是20倍 银染的线性范围是40倍 灵敏度是考染的100倍 胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色 其极限灵敏度为8 10ng 但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果 胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯 PVDF 和 或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色 银染的缺点是 对某些种类的蛋白质染色效果差 对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响 这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量 负染 能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率 但不能用于膜上染色 结果表现为胶面着色而蛋白质点透明 速度快 5 15min 蛋白质的生物活性能保持 一旦用络合剂如EDTA或Tris 甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质 它主要适用于蛋白质显色 完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析 该技术主要包括金属盐染料 锌 咪唑染料等的使用 胶体扩散染料 主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质 不用于胶内染色 最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似 这种技术主要包括印度墨水染料 胶体金属染料等 有机荧光团染料 包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类 后者最为常用 其典型代表是已经商品化的SYPRORed Orange Ruby等荧光染料 这三种染料可对SDS PAGE胶内蛋白质进行一步染色 约30 60min完成 灵敏度为2 10ng 染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存 其线性范围为3个数量级 这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配 在Tris 甘氨酸转印缓冲液中染色后 蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质 金属螯合染料 这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的 相对较新的蛋白质显色试剂 其设计专门与常用微量化学表征过程兼容 它们不包含戊二醛 甲醛或Tween 20等 很容易和集成化蛋白质组学平台 包括自动化凝胶染色仪 图像分析工作站 机器人剪切仪器 蛋白质酶解工作站和质谱仪等 相结合 其中SYPRORuby也是一种基于钌的金属发光染料 凝胶的图像处理分析和 典型流程凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2 DE数据库的建立 蛋白质的胶内酶切 包括感兴趣蛋白点的挖取 含蛋白质凝胶的脱色 胶内蛋白质的酶切等过程 实验方法完整蛋白质 如凝胶分离或色谱纯化蛋白质 肽混合物 质谱测定肽质量 MALDI MS ESI MS 选择肽段裂解PSD MALDI MS ESI MS MS 计算方法蛋白质序列数据库 核酸序列翻译数据库 肽质量检索 未解析碎片离子检索 酶切 质谱鉴定蛋白质的策略 生物学问题的提出 实验模型的设计 实验组和对照组样品的制备 蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析 感兴趣蛋白点的切取 胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图 微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现 其它实验的进一步验证 蛋白信息的初步获得 孙金福 猪瘟病毒感染蛋白质组学研究 第二部分 CSFV是猪瘟的病原 CSF是以出血性高热 淋巴细胞减少和免疫抑制为主要特征的传染病 近年来 CSF多呈温和 慢性 非典型 持续感染特征 隐性感染母猪导致流产 死胎 给养猪业造成重大经济损失 临床症状 发热 白细胞减少 皮下 粘膜和内脏器官出血 CSFV感染蛋白质组学 为了寻找CSFV感染 致病相关蛋白 揭示CSFV的致病机制 本研究用高通量蛋白质组技术 2DE 2DDIGE和质谱鉴定分析了感染CSFV体外细胞PK 15 体内细胞PBMC和感染猪血清的蛋白质组变化 目前 关于CSFV致病机制的研究多集中在病毒的自身毒力及宿主免疫反应方面 关于CSFV感染致病过程中宿主因素变化的报道较少 实际上 病毒的致病是病毒与宿主相互作用的结果 病毒的侵入会导致宿主细胞蛋白表达模式的改变 这种改变将影响宿主细胞的正常生理功能并决定病毒的致病进程和结果 CSFV感染蛋白质组学 A B 20 实验方案 1样品制备与定量1 1样品制备用猪瘟病毒石门株血毒 1 105TCID50 0 1mL 接种PK细胞 每瓶 4 7mm 细胞接种2 105TCID50 于接种病毒后48h 用细胞裂解液 8M尿素 4 CHAPS 40mMTris 65mMDTT 10mM蛋白酶抑制剂 裂解感染细胞 裂解液收集于1 5mL小离心管 1 2样品定量各实验组样品经超声处理并离心 20000g 15min 后 用Bradfordassay法 Bio RadEttan2 DQuant试剂盒 进行蛋白质定量 IPG immobilizedpHgradient 胶条 17cm PH3 10 BIO RAD 水化 适量水化液与150 g样品混合 使总体积为350 L strip 加入持胶槽 然后将IPG胶条放入持胶槽 避免有气泡产生 放入胶条后 往胶槽加满矿物油 在50V电压条件下主动水化12h 16h 胶条水化后 在50 A strip 20 条件进行等电聚焦电泳 不同的电泳系统 上样方法不同 等电聚焦电泳程序 250V1h 500V1h 1000V1h 然后在1000V 10000V线性上升5h 10000V恒定8h 电压时间积达80000VH 2双向电泳 2DE 第一向电泳 等点聚焦电泳 Stripsrehydration IEF 350 Lrehydrationbuffercontainingofproteinsamples150 gforeachstripe 250V1h 500V1h 1000V1h linearrampto8000Vover1h then8000Vconstantforatotalof80000Vh 第一向电泳后 IPGstrips置还原缓冲液中平衡15min 然后在烷基化缓冲液中平衡15min 还原缓冲液 烷基化缓冲液 50mMTris HCl pH8 850mMTris HCl pH8 86Murea 6Murea 4 w vSDS4 w vSDS65mMDTT53mMIodoacetamide 碘乙酰胺 30 glycerol30 glycerol痕量溴酚蓝痕量溴酚蓝 胶条的平衡 3凝胶染色 SDS PADE电泳 IPG胶条平衡后 转移至SDS PADE胶 进行第二向电泳 电泳程序设置为 5mA30min 10mA30min 15mA1h 20mA1h 25mA至结束 3 1硝酸银染色 1 固定45 乙醇 5 乙酸20 30min2 水洗2min 2 60min3 敏化0 02 Na2S2O31 2min4 水洗1min 25 染色0 1 AgNO34 20 40min6 水洗1min 37 显色40 l甲醛 2gNa2CO3100ml一般10min以内8 停显1 乙酸 不可用于质谱分析 EDTA Na2终止反应 3 65g 250mlddH2O 3 2考马斯亮蓝染 1固定液 10 甲醇 7 乙酸 固定2h2水洗3 10min3胶体兰染色G250 150 200ml 3 4h或过夜4用去离子水脱色至背景消失 4图像采集 用扫描仪 AmershamBiosciences U9909H7L0 扫描凝胶 采集图像 48h感染 48h对照 银染分析胶图像 5图像分析 用PDQuest软件进行图像分析的主要步骤 点的检测 spotdetection 建立匹配组 machset 建立复制组 replicategroup 建立分析组 analysisset 5图像分析 6表达差异蛋白质点 6 1软件分析图像分析显示 各实验组满足T检验 P 0 05 感染后48h表达差异1 5倍以上的蛋白点为 35个点 6 2人工比对 对软件分析给出的差异点进行人工校对 7 1制备胶条件优化 样品蛋白的丙酮沉淀 1按照蛋白样品与预冷丙酮 含20mmolDTT 1 3比例加入预冷丙酮溶液2 20 沉淀2h320000g离心15min 弃上清 倒置于滤纸上4加入原体积1 3裂解液 振荡溶解5超声处理 超声0 2秒 间隔2秒 15循环 20 功率 6离心 20000g15min7取上清8定量 7差异表达蛋白点的鉴定 考染制备胶图像 感染和对照混合样品1 2mg621 感染和对照混合样品0 7mg627 丙酮沉淀后对照 700mg720 丙酮沉淀后对照 700mg711 丙酮沉淀后感染 0 7mg730 丙酮沉淀后感染0 7mg717 上样量不同 7 2制备胶切胶与胶内酶解 1切胶 用解剖刀将目的点切下 并将胶块切成1mm3大小的胶粒 置EP管中 2脱色 加入脱色液100 L浸泡 振荡20min 弃去溶液 重复1 2次洗至透明 3冻干 弃脱色液 将胶粒冻干 4酶解 加入15 20 L酶液 0 01 g L 置于4 放置30min 待酶液完全被吸收 弃多余酶液 补充酶解缓冲液 25mMNH4HCO3 15 20 L 使胶完全浸没 37 保温15小时或过夜 注 时间不要太长 5蛋白提取 吸出酶解液 移至新EP管 原管加提取液 5 TFA 100 L 40 加热水浴45min时 超声3min左右 再水浴45min 吸出提取液与酶解液合并 然后向胶块中加入提取液 50 乙腈 2 5 TFA 100 L 30 保温1小时 30min时 超声3min左右 吸出提取液与前液合并 氮气吹干乙腈后 冰冻干燥 20 保存用于质谱鉴定 8质谱鉴定 样品 基质的准备与点靶 冻干的蛋白样品用0 1 TFA溶解 一般2 5 L左右 然后在靶上点样 Dried Droplet法 饱和的基质溶液与蛋白质溶液混合 5000 1 0 5 2 L混合液点到靶体上 Thin Layer法 均一的基质层首先在靶体上形成 然后样品加在其上 先加样品 再加基质 样品点0 8 1 L 可分多次点样 点完样品后 点基质0 6 L 一次点样即可 全面分析了宿主细胞感染CSFV病毒后蛋白质的整体表达模式 在对照和感染样品中 每块凝胶检测到1300多个蛋白点 在病毒感染后48h 通过软件分析 满足T检验 P 0 05 至少有1 5倍以上的差异表达的蛋白点共有35个 在显著差异表达的蛋白中 用串联质谱 MALDI TOFMS MS 共鉴定了21个蛋白点 其中上调表达蛋白16个 下调表达蛋白5个 根据差异表达蛋白的功能 根据蛋白功能可以分为细胞骨架 细胞能量代谢 抗氧化应激 核酸复制 转录 翻译 蛋白加工 信号传导以及热休克蛋白等7个类群 ResultofProteomeanalysis PK 15cells 感染与复制相关蛋白 膜联蛋白annexin2是一个钙依赖的胞质蛋白 能与胞膜结合 参与多种病毒的感染 复制 装配 出芽与释放 比如 annexin2介导巨细胞病毒的感染 在人上皮细胞 annexin2是呼吸道合胞病毒的受体 巨嗜细胞annexin2与HIV1糖蛋白Gag结合 并且annexin2下调表达可显著抑制HIV复制 Annexin2在CSFV感染细胞中上调表达 表明其可能对CSFV感染和复制发挥着一定的作用 差异表达蛋白的功能意义 不均一核糖核酸蛋白 hnRNPs 是一类核RNA结合蛋白 具有参与转录 mRNA运输与剪接 mRNA稳定性等功能 研究表明一些hnRNPs蛋白参与病毒的RNA合成和加工 比如 hnRNPA1参与丙型肝炎病毒 HCV 的复制 调节鼠肝炎病毒RNA合成 几种hnRNPs蛋白还参与人获得性免疫缺陷病毒 HIV 的RNA代谢和基因表达的调节 感染与复制相关蛋白 差异表达蛋白的功能意义 感染与复制相关蛋白 差异表达蛋白的功能意义 翻译延长因子1 EF 1 在感染样品中显著上调表达 真核翻译延长因子在几种病毒的复制和致病机制中发挥关键的作用 如与WNV 登革热4型病毒 HCV HIV 1 BVDV等病毒的结构蛋白或非结构蛋白相互作用 促进病毒的复制或抑制宿主细胞的蛋白表达 细胞凋亡相关蛋白 差异表达蛋白的功能意义 糖酵解酶磷酸甘油酸变位酶1 PGAM1 上调表达 三磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH 下调表达 除了能量代谢功能之外 PGAM的活性增强可抵抗细胞的氧化应激 促进细胞无限增殖 GAPDH是细胞凋亡的通用介导蛋白 与细胞凋亡有关 GAPDH上调表达会诱导细胞的凋亡 抗氧化应激蛋白 PRDX6 thioredoxin like 上调表达 thioredoxin和PRDX6在细胞中过量表达能够抵抗氧化应激 抑制细胞凋亡 以上凋亡相关蛋白的表达变化 抑制了细胞的凋亡 为病毒提供了持续繁殖的场所 实现了持续感染 Peptidyl prolylcis transisomeraseA cyclophilinA playsanimportantroleindenovoproteinfoldingandinisomerizationofnativeproteinsinseveralcellularsystems Inaddition cyclophilinAinteractswithHCVRNAaswellastheviralpolymerase andisanessentialcellularcofactorforHCVreplicationandinfection 46GrowingevidenceindicatesthattheimmunosuppressantcyclosporinA CsA targetedcellularcyclophilincanstronglysuppressthereplicationofHCVinvitroorinvivo BothHCVandCSFVaremembersoftheFlaviviridae andhaveasimilargenomestructure therefore upregulationofcyclophilinAinCSFV infectedsamplessuggeststhatcyclophilinAmayalsoplayacriticalroleinCSFVreplication 二维电泳 CSFV感染猪 外周血白细胞凋亡和T细胞亚群动力学检测 攻毒后猪外周血白细胞总数显著减少 白细胞凋亡显著高于对照组 CD4 和CD8 T淋巴细胞亚群急剧下降 表明CSFV感染诱导细胞凋亡是免疫细胞减少和免疫抑制的主要原因 感染的PBMC样品中共有73个差异表达蛋白点 质谱鉴定了其中51个蛋白点 属于34种特定蛋白 根据差异表达蛋白的功能可以分为细胞骨架 能量代谢 抗应激蛋白 核酸复制 转录 翻译 蛋白加工等5个功能类群 Westernbloting比较分析cofilin和annexinA1在CSFV感染猪PBMC和对照样品的表达水平 细胞骨架紊乱多种细胞骨架蛋白包括肌动蛋白 膜突蛋白 粘着斑蛋白 膜联蛋白A1 踝蛋白等蛋白的表达发生了变化 上调或下调 共有7个不同的蛋白点鉴定为 肌动蛋白或肌动蛋白亚型 4个不同的蛋白点鉴定为膜联蛋白annexinA1 具有不同分子量 等电点的蛋白点被鉴定为同一种蛋白 可能是CSFV感染诱导了宿主细胞骨架蛋白的解聚 降解或不同程度的翻译后修饰 导致细胞骨架的紊乱 崩解 肌动蛋白骨架完整性的丧失与细胞凋亡有着密切的联系 肌动蛋白骨架紊乱能够激活细胞凋亡蛋白酶 3 caspase 3 进而诱导细胞的凋亡 感染与复制相关蛋白膜突蛋白是细胞骨架重塑相关信号的转导蛋白 能够调节稳定微管的形成 在感染样品显著上调表达 在HIV 1感染的T细胞系CEM和H9细胞中 膜突蛋白上调表达 与HIV囊膜糖蛋白gp120结合 这种结合可能在病毒的摄入 装配和出芽过程中发挥着重要的作用 与膜辅蛋白CD46相互结合形成麻疹病毒 meslesvirus MV 的受体复合物 促进细胞对MV的摄入 翻译延长因子1 EF 1 在感染样品中显著上调表达 与体外PK 15相似 细胞凋亡相关蛋白粘着斑蛋白参与调节与细胞生存和凋亡有关的细胞信号途径 有研究显示在凋亡细胞中粘着斑蛋白上调表达 而在高度恶化和转移性肿瘤细胞中粘着斑蛋白缺失或显著下调表达 粘着斑蛋白在感染样品中上调表达 显示CSFV诱导了PBMC的凋亡 GAPDH上调表达8倍 而在体外PK 15细胞显著下调表达 抗氧化物酶Prx 1下调表达 Prx 1参与信号调节激酶1 signal regulatingkinase1 ASK1 信号介导的细胞凋亡途径 并在该凋亡途径中发挥着抑制凋亡的作用 免疫相关分子血小板反应素1 Thrombospondin1 TSP 1 除参与凝血机制外 还具有免疫调节功能 比如 TSP 1调节T细胞行为并参与炎性T细胞的激活和克隆增殖 有证据表明 敲除TSP 1的转基因小鼠对细菌性肺脏感染较敏感 显示了TSP 1对宿主免疫反应的作用 TSP 1显著下调 可能干扰T细胞的免疫功能 抗氧化蛋白的上调表达有助于增强CD8 T细胞的抗病毒活性 在HIV感染活化的CD8 T细胞中 过氧化物氧化还原蛋白家族成员NKEF A和NKEF B上调表达 本研究中 Prx 1显著下调表达 可能会影响CD8 T细胞的抗病毒活性 由于血清 血浆样本易于采集 并且含有细胞和组织分泌的数千种蛋白 血清 血浆中蛋白成分的动力学变化反映着机体细胞 组织的病理生理状态 因此血清 血浆是最有价值的寻找蛋白标记的样品 在人的肿瘤 病毒性疾病的血清蛋白质组研究中发现了一系列的疾病相关蛋白标记 建立了一些新的诊断方法 Cy2 红色 标记混合内标对照样品 Cy3 蓝色 标记感染血清样品 Cy5 绿色 标记对照血清样品 白色的点表明该蛋白在三种样品的含量是相等的 紫色的点表明该蛋白在感染血清中上调表达 绿色的点表明该蛋白在感染血清中下调表达 发现了17个差异表达蛋白点 用质谱鉴定了14个差异表达蛋白 这些差异表达的血清蛋白反映了CSFV感染猪组织 细胞的生理状态的变化 进一步的评价分析将有可能发现与致病机制相关的信息或新型诊断标记 接联球蛋白属于急性期蛋白 可抑制炎性反应造成的损伤 在急性和慢性炎症 病毒感染以及肿瘤等疾病中 血清接联球蛋白的水平会提高 除此之外 接联球蛋白还具有刺激血管生成和组织修复的生物功能 CSFV感染可造成血管内皮系统的损伤 接联球蛋白水平在感染血清中降低 可能不利于炎症损伤的控制和血管内皮系统损伤的修复 进而导致宿主皮下 内脏器官粘膜出血 凝血酶抑制因子亚型2的水平显著下调 凝血酶是一个丝氨酸蛋白酶 在凝血级联反应和止血过程中发挥着核心的作用 此外 凝血酶控制内皮组织对损伤的增生 修补反应 促进促炎症反应和促凝血内皮系统反应 在CSFV感染猪的血清中 凝血酶抑制因子亚型2的水平显著下调 可能诱导了凝血机制的紊乱 造成毛细血管弥漫性凝血 载脂蛋白AI是高密度脂蛋白的主要载脂蛋白 由肝脏和肠道产生 在胆固醇的逆行转运中具有重要的作用 还具有抗炎症 抗氧化剂 修复人的内皮系统功能障碍的作用 apoAI的水平显著下调 可能不利于炎症反应的控制和血管内皮系统的功能修复 与免疫有关的补体C4的亚基C4a 免疫球蛋白 链两种蛋白在CSFV感染血清中下调表达 补体系统失调与凝血系统的功能障碍等疾病有关 补体成分是炎症反应的重要调节因子 并促进免疫反应的调节C4是补体经典途径的主要成分 感染血清C4a的下调 可能对补体系统的激活和机体的免疫反应以及凝血系统造成不良影响 差异表达蛋白中的一些蛋白如接联珠蛋白 载脂蛋白AI及C4a被鉴定为其它疾病的生物标记 这些差异表达蛋白作为CSFV感染生物标记的潜在可能性还需进一步的评估 用2 DE 2DDIGE和质谱鉴定等高通量蛋白质组学技术对CSFV感染蛋白质组进行了系统分析 获得了迄今最为完善的CSFV感染体内外宿主细胞 宿主血清差异表达蛋白质组数据 鉴定了一些可能的CSFV感染 复制与致病相关宿主蛋白和可能的抑制和诱导宿主细胞凋亡的细胞途径 为CSFV致病机制和新型预防 治疗靶标以及诊断标记的进一步研究奠定了基础 提供了研究素材 病毒蛋白质组学研究进展 病毒病原生态与分子流行病实验室 第三部分 病毒粒子蛋白质组 病毒感染诱导宿主细胞的蛋白质组变化 病毒感染宿主血清蛋白质组 1病毒粒子蛋白质组研究 全面了解病毒粒子的蛋白质组成是研究病毒生物学功能以及特定病毒蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的前提 有些病毒粒子中含有非病毒编码的宿主细胞蛋白 这些宿主蛋白反映了病毒在细胞不同的细胞器或细胞亚单位进行复制 装配和释放的可